材料和试剂

诺雷尔® 选择系列TM 3毫米NMR管（西格玛- Aldrich公司，目录号：NORS36008）
Eppendorf管® 体积（0.5毫升）中，PCR清洁（Sigma-Aldrich公司，目录号：EP0030124537-500EA）
苏打石灰巴斯德移液器已拔出，容量为2 ml，长度为230 mm（VWR，目录号：612-1702）
吸管奶头，MBL ® 天然橡胶（SciLabware，目录号：BIBBBPP004）
移液器提示：
10 µl刻度吸头（Starlab ，目录号：S1111-3800）

200 µl 黄色吸头（Starlab ，目录号：S1111-0806）

1 ，000微升b 略提示（STARLAB ，目录号：S1111-6801）

磷酸盐缓冲盐水片（Sigma - Aldrich，目录号：P4417）
蒸馏水（室内）
D 2 O （氧化氘99.9原子％D ）（Sigma - Aldrich，目录号：151882）
DMSO- d 6 （二甲基亚砜-d 6 “ 100％”，99.96原子％D ）（Sigma - Aldrich，目录号：156914）

设备

手动离心机，不带转子2 x 15 ml，用于手动离心机的90°锥形圆锥形转子转子（Satorius，型号：C1011）
科学工业公司SI TM Vortex- Genie TM 2（科学工业公司，型号：SI-0266，目录号：15557335 ）
-80 °C 冷冻室
pH计（Jenway ，目录号：351001）
吉尔森移液器，单通道：
P ipetman L，2-20 µl （Gilson，目录号：FA10003M）

P ipetman L，20-200 µl（吉尔森，目录号：FA100 05M）

P ipetman L，100-1 ，000微升（吉尔森，目录号：FA10006M）

程序

注意：假设1 H NMR光谱学已掌握NMR光谱仪操作的本地知识，或可以适当地获取。此处列出的命令与Bruker NMR光谱仪的操作有关- 遵循其他供应商的等效协议。

聚合协议
溶解配体（在DMSO- d 6中的化合物以获得10 mM的储备溶液）。
在准确的天平上称出目标化合物，并使用微量移液器添加DMSO- d 6 以溶解该化合物并获得储备溶液。如果化合物最初不完全溶解，则可以用吹风机缓慢加热（约40-50°C），每次少于1分钟，然后涡旋30 s 。可以重复进行直到固体完全溶解。所得溶液应澄清，没有漂浮的物质颗粒，并且不混浊。

准备一个新的10 mM PBS缓冲液，将其pH校正为7.4 。
将磷酸磷酸盐缓冲盐水片溶于100 ml水中，并通过pH计将所得溶液的pH校正为7.4。

将10 µl的10 mM 配体储备液添加到0.5 ml的Eppendorf管中[ 以下步骤（A 3- A 5）用于将化合物稀释至最终浓度为500 µM ] 。
使用微量移液器和吸头将配体溶液添加到干净的新Eppendorf中。丢弃尖端。将Eppendorf放在Eppendorf架子上。

将170 µl缓冲液添加到Eppendorf中，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将缓冲液添加到含有配体溶液的Eppendorf中。丢弃尖端。在设置8处将Eppendorf关闭并涡旋30 s。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

向Eppendorf中加入20 µl D 2 O，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将D 2 O 添加到含有配体溶液和缓冲液的Eppendorf中。丢弃尖端。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

将所得溶液转移至3 mm NMR管中。
在橡胶奶嘴的帮助下，用长巴斯德移液器小心地吸取溶液。然后将溶液小心地转移到试管中，将移液管完全放入，然后轻轻按下奶嘴将其取出以释放溶液。轻轻摇动NMR试管几次（朝向地板），以确保液体完全移至试管底部。

盖好并离心NMR管。
盖上NMR管，将其置于手动离心机中，并离心几分钟，以确保表面没有气泡（因为这会导致NMR实验中的磁场优化不佳（匀化））。

将试管放在NMR光谱仪中进行waterLOGSY 1-D NMR检测。
将NMR管放置在3 mm旋转器（涡轮）中，并使用适当的NMR深度计将管正确放置在旋转器中。通过手动放置或通过使用与磁体低温恒温器相连的样品传输机械手，将样品/旋转体转移到NMR光谱仪磁体中。

waterLOGSY 基本协议
基本的WaterLOGSY 此处以C = 50 µM的初始储备蛋白溶液为例。蛋白质的浓度决定了实验中所需缓冲液的量。可以使用其他蛋白质浓度，并相应更改缓冲液量。

溶解配体（在DMSO- d 6中的化合物以获得10 mM的储备溶液）。
在准确的天平上称出目标化合物，并使用微量移液器添加DMSO- d 6 以溶解该化合物并获得储备溶液。如果化合物最初不完全溶解，则可以一次用吹风机缓慢加热少于1分钟，然后涡旋30秒。可以重复进行直到固体完全溶解。

制备10的新鲜缓冲溶液毫PBS，5 毫的MgCl 2 的buff ER校正至pH 7.4 。
该缓冲液是该规程中所用蛋白质所需的缓冲液。应该在此处准备适合所研究蛋白质的缓冲液。具有低质子含量，例如PBS，或者缓冲器氘化的（例如，三- d 11 ）是优选的以最小化来自缓冲器的背景信号。同样，质子化缓冲液的浓度应降至最低。

在制备样品前解冻蛋白质。
从-80中取出蛋白质 °C冷冻机，并将其放入干冰盒中，以运送到NMR仪器。以含有蛋白质出冰的埃氏并等待其置于室温下解冻COM + pletely 。在所有实验结束之前，请勿将蛋白质放回冰中。在某些情况下，可以将蛋白质冷冻回去，但前提是必须足够稳定。对于此方案，我们准备了小心的等分试样，以防止进行实验后残留任何蛋白质。

在0.5 ml Eppendorf管中加入10 µl配体溶液。
使用微量移液器和吸头将配体溶液添加到干净的新Eppendorf中。丢弃尖端。将Eppendorf放在Eppendorf架子上。

将130 µl缓冲液添加到Eppendorf中，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将缓冲液添加到含有配体溶液的Eppendorf中。丢弃尖端。在设置8处将Eppendorf关闭并涡旋30 s。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

向Eppendorf中加入20 µl D 2 O，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将D 2 O 添加到含有配体溶液和缓冲液的Eppendorf中。丢弃尖端。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

将40 µl的蛋白质（浓度为50 µM）添加到Eppendorf（终体积为200 µl）中。测定中的最终蛋白质浓度为10 µM，最终配体浓度为500 µM。
在设置8处使含有蛋白质的Eppendorf涡旋涡旋30 s。使用微量移液器和吸头将蛋白质添加到含有配体溶液，缓冲液和D 2 O 的Eppendorf中。丢弃吸头。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

将所得溶液转移到3 mm NMR管中。
在橡胶奶嘴的帮助下，用长巴斯德移液器小心地吸取溶液。然后将溶液小心地转移到试管中，将移液管完全放入，然后轻轻按下奶嘴将其取出以释放溶液。轻轻摇动NMR试管几次（朝向地板），以确保液体完全移至试管底部。

盖好并离心NMR管。
盖上NMR管，将其置于手动离心机中，并离心几分钟，以确保表面没有气泡（因为这会导致NMR实验中的磁场优化不佳（匀化））。

将试管放在NMR光谱仪中，用于waterLOGSY 1-D NMR检测。
将NMR管放置在3 mm旋转器（涡轮）中，并使用适当的NMR深度计将管正确放置在旋转器中。TRANSF ER采样/微调到NMR波谱仪磁体或者通过手动放置，或通过使用附连到磁体的低温恒温器的样品输送机器人的。

用于图书馆筛选的waterLOGSY 协议
对于文库筛选，重要的是仔细选择实验中放在一起的化合物。通常可以一次使用三个配体，然后使用DMSO溶液– 缓冲液的量会相应改变。文库筛选方案的示例是使用初始储备蛋白C = 50 µM。

溶解配体（在DMSO- d 6中的化合物以获得10 mM的储备溶液）。
在准确的天平上称出目标化合物，并使用微量移液器添加DMSO- d 6 以溶解该化合物并获得储备溶液。如果化合物最初不完全溶解，则可以一次用吹风机缓慢加热少于1分钟，然后涡旋30秒。可以重复进行直到固体完全溶解。

重复此步骤最多两次，以添加需要筛选的所有配体。

准备10 mM PBS，5 mM MgCl 2 缓冲液的新缓冲溶液，校正至pH 7.4 。
该缓冲液是该规程中所用蛋白质所需的缓冲液。应在此处准备适合所研究蛋白质的缓冲液。具有低质子含量，例如PBS，或者缓冲器氘化的（例如，三- d 11 ）是优选的以最小化来自缓冲器的背景信号。同样，质子化缓冲液的浓度应降至最低。

将10 µl配体溶液加入0.5 ml Eppendorf管中。
使用微量移液器和吸头将配体溶液添加到干净的新Eppendorf中。丢弃尖端。将Eppendorf放在Eppendorf架子上。重复此步骤以添加其他配体溶液。

将130 µl缓冲液添加到Eppendorf中，并将溶液涡旋30秒钟（如果使用3个配体）。
使用微量移液器和吸头将缓冲液添加到含有配体溶液的Eppendorf中。丢弃尖端。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

向Eppendorf中加入20 µl D 2 O，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将D 2 O 添加到含有配体溶液和缓冲液的Eppendorf中。丢弃尖端。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf ，并将其放回原位。

将40 µl的蛋白质（浓度为50 µM）添加到Eppendorf（终体积为200 µl）中。分析中的最终蛋白质浓度为10 µM，最终配体浓度为500 µM（每种）。
在设置8处使含有蛋白质的Eppendorf涡旋涡旋30 s。使用微量移液器和吸头将蛋白质添加到含有配体溶液，缓冲液和D 2 O 的Eppendorf中。丢弃吸头。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

将所得溶液转移至3 mm NMR管中。
在橡胶奶嘴的帮助下，用长巴斯德移液器小心地吸取溶液。然后将溶液小心地转移到试管中，将移液管完全放入，然后轻轻按下奶嘴将其取出以释放溶液。轻轻摇动NMR试管几次（朝向地板），以确保液体完全移至试管底部。

盖好并离心NMR管。
盖上NMR管，将其置于手动离心机中并离心几分钟，以确保表面没有气泡（因为这会在NMR实验中造成严重的匀场）。

将试管放在NMR光谱仪中，用于waterLOGSY 1-D NMR检测。
将NMR管放置在3毫米旋转器（涡轮机）中，并使用适当的NMR深度计将管正确放置在旋转器中。然后通过手动放置或通过使用与磁体低温恒温器相连的样品传输机器人将其转移到NMR光谱仪磁体中。

waterLOGSY 竞争协议
对于使用Y6-ScFv VH进行的竞争实验，制备方法与基本waterLOGSY 方案相似。在此通过使用C = 312 µM的初始储备蛋白和C = 116.6 µM 的初始储备抗体（蛋白质和抗体的比例为1：1）来举例说明。蛋白质的浓度决定了实验中使用的缓冲液的量。可以使用其他蛋白质浓度，并相应更改缓冲液量。

重复步骤B1和B2。
在准备样品之前解冻蛋白质和抗体。
将蛋白质和抗体从-80 °C的冰箱中取出，并将它们放入一盒干冰中，以携带到NMR仪器中。从冰中取出含有蛋白质的Eppendorf，让其在室温下静置完全融化。在所有实验结束之前，请勿将蛋白质放回冰中。在某些情况下，可以将蛋白质冷冻回去，但前提是必须足够稳定。对于此方案，我们准备了小心的等分试样，以防止进行实验后残留任何蛋白质。

重复步骤A3。
向Eppendorf中加入146.4 µl缓冲液，并将溶液涡旋30秒钟。
使用微量移液器和吸头将缓冲液添加到含有配体溶液的Eppendorf中。丢弃尖端。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。
重复步骤A5。
将6.4 µl蛋白质（浓度311.8 µM）添加到Eppe ndorf中。
在设置8处使含有蛋白质的Eppendorf涡旋涡旋30 s。使用微量移液器和吸头将蛋白质添加到含有配体溶液，缓冲液和D 2 O 的Eppendorf中。丢弃吸头。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

在Eppendorf中加入17.2 µl抗体（浓度116.6 µM）（终体积为200 µl）。
在设置8处涡旋含有抗体的Eppendorf 30 s。使用微量移液器和吸头将蛋白质添加到含有配体溶液，蛋白质，缓冲液和D 2 O 的Eppendorf中。丢弃吸头。关闭Eppendorf并在设置8处涡旋30秒钟。重新打开Eppendorf，并将其放回原位。

重复步骤A6-A8 。

数据分析

仪器仪表
固相核磁共振波谱仪，在高场（400+ MHz）下运行，配备有适用于1 H检测的探针，z轴脉冲场梯度功能以及有效的样品温度调节功能（默认298 K）。探针温度可以根据蛋白质要求和稳定性来改变。

直径为3 mm的NMR管最适合5 mm的低温探针（或3 mm的微型探针），但也可以与常规的5 mm NMR探针一起使用，尽管会降低灵敏度。如果没有用于3毫米试管的样品传输微调器（涡轮），可以将这些窄管直接放置在常规5毫米试管中，以使用5毫米微调器进行运输。或者，可以单独使用5 mm的试管，这要求将本方案中的所有样品体积均按三倍比例缩放以产生用于600 µl分析的最终体积。

对于文库筛选，需要一个自动进样器以实现高样品通量，无人值守的操作和过夜数据收集。

此处列出的命令与Bruker NMR光谱仪的操作有关-遵循其他供应商的等效协议。该协议适用于运行TOPSPIN 3.5或更高版本的Bruker AVIII光谱仪。

每个样品的布鲁克设置（+/-蛋白）
记录具有H 2 O水抑制作用的标准1 H NMR光谱
加载参数设置WATERSUP （1D NOESY预设序列）。
执行用于1 H NMR检测的标准仪器设置方案：将样品置于探针中：调整探针的1 H通道（atma ），锁定样品（锁定H 2 O / D 2 O），匀场样品（梯度匀场例行程序，例如）。克。，吨opshim ），标定1 H脉冲（pulsecal ）。
收集1 H参考光谱并检查存在的配体的真实性。
记录1 H waterLOGSY NMR光谱
罗广告参数设置：SCREEN_WLOGSY。
根据上述设置协议确定的负载1 H脉冲e标定。
waterLOGSY 筛选的推荐参数：
脉冲程序：ephogsygpno.2（ephogsy 是该实验的最初实现方式，用于蛋白质水合研究，通过梯度光谱观察到的被称为增强蛋白质水合，Bruker仍将其名称保留为waterLOGSY 序列）

恢复延迟（d1）：2 s

选水180用于水激励的°脉冲（p7：sp21）：7.5 ms 高斯（Gaus1_180i.1000）

混合时间（d8）：1秒

水抑制180 ° 选择性脉冲（p12：sp1）：2 ms sinc （sinc1.1000）或正方形轮廓（Squa100.1000）

光谱宽度：16 ppm

采集时间（AQ）：2 s

获得的数量（NS）：≥128（取决于仪器的灵敏度）

不要旋转样品。

数据处理
1 Hz线加宽lb = 1的过程数据（要执行的命令ef ）。

相谱，使得结合的小分子的共振为负（反相）。蛋白质信号应以负强度出现（图1）。

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图1 。典型的结果是化合物没有聚集并与蛋白质结合。蓝色为该化合物的质子NMR。红色为单独的化合物的waterLOGSY 。除与水交换的NHs和OHs（5.6至6.0 ppm）外，所有峰均仍向上（正），没有聚集，因此显示负信号。绿色表示化合物与蛋白质的waterLOGSY 。该化合物的所有峰均为负值，表明已结合。光谱中看到的正峰是2.6 ppm 的DMSO 峰和残留的水峰（即使在4.7 ppm抑制后仍观察到）。该特定溶液包含蛋白质制备物中的残留Tris ，在3.7 ppm处观察到。

ACKN owledg 发言：

CJRB和THR的工作得到了Bloodwise （12051）的资助，THR也得到了医学研究理事会（MR / J000612 / 1）和惠康基金会（100842 / Z / 12 / Z）的资助。

利益争夺

作者没有利益冲突要声明。

参考资料

Dalvit ，C.，Pevarello ，P.，Tato，M.，Veronesi，M.，Vulpetti ，A。和Sundstrom ，M。（2000）。通过从大量水中磁化转移来鉴定对蛋白质具有结合亲和力的化合物。Ĵ Biomol公司NMR 18（1）：65-68。
Dalvit ，C.，Fogliatto ，G.，Stewart，A.，Veronesi，M。和Stockman，B。（2001）。作为基本NMR筛选方法的WaterLOGSY：实用方面和适用范围。Ĵ Biomol公司NMR 21（4）：349-359。
Lepre ，CA（2011）。基于NMR的片段筛选的实践方面。方法酶493：219-239。
Huang，R.and Leung，IKH（2019）。通过WaterLOGSY进行的蛋白质-小分子相互作用。方法酶学方法615：477-500。