材料和试剂

真空过滤单元（0.2 μ米）（VWR，目录号：10040-436）
T150烧瓶（Cyto One，目录号：CC7682-4815）
24 - 孔板（的Cyto 一，目录号：CC7682-7524）
26号针（BD，目录号305110-269）
1 ml注射器（BD，货号：309659）
用于超速离心机转子的厚壁聚碳酸酯管（贝克曼库尔特，目录号：343776）
螺帽管2 ml（Axygen ，目录号：SCT-200-CS）
闪烁管（Perkin Elmer，目录号：6000292）
一次性无菌细胞提升器（Fisher Scientific，目录号：08-100-240）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
Dulbecco的基本必需培养基（DMEM 培养基）（Gibco ，目录号：11960-044）
胎牛血清（双子，目录号：900-108）
HEPES（Fisher S Cientific，目录号：BP310-1）
青霉素链霉素，10,000 U / ml（Gibco，目录号：15140-122）
谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030-081）
胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25200-056）
胶原蛋白（Sigma，目录号：C9791）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S5-3）
Myriocin（开曼群岛，货号：63150）
伏马菌素B1（Cayman，货号：62580）
Tris（Fisher S Cientific，目录号：BP 152-5）
完整的不含EDTA的迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，目录号：04693159001）
OptiMEM （Gibco，目录号：31985-070）
无FA BSA（Fisher，目录号：BP9704-100）
氯仿（Fisher，目录号：C297-4）
甲醇（Fisher，目录号：A452-4）
液氮
C8神经酰胺（Avanti，目录号：860508）
鞘氨醇（Avanti，目录号：860490）
蓟马toyl辅酶A（Sigma，目录号：P9716-10MG ）
24：1辅酶A（Avanti，目录号：870725）
氢氧化钾（Fisher，目录号：P250-500）
DTT（Sigma，目录号：D0632）
EDTA（Fisher，目录号：S311-500）
5'磷酸吡rid醛（Sigma，目录号：P9255）
L-丝氨酸（Sigma，目录号：S4500）
L- [ 3 H（G）]-丝氨酸（Perkin Elmer，目录号：2477301）
Ecolite -Scintillation流体（MP Biomedicals公司，目录号：882475）
Beta max闪烁液（MP Biomedicals，目录号：880020）
无丝氨酸MEM（Gibco，目录号：11095-080）
氯化镁（Fisher S Cientific，目录号：M87-100）
DMEM完全培养基（请参阅食谱）
C8神经酰胺（请参阅食谱）
鞘氨醇（请参见食谱）
棕榈酰CoA（请参阅食谱）
24：1 辅酶A （请参阅食谱）
不含脂肪酸的BSA（请参阅食谱）
1 mM C8-神经酰胺（请参阅食谱）
甲醇（请参阅食谱）
肉豆蔻素（请参阅食谱）
伏马菌素B1（请参阅食谱）
氯仿：甲醇（2：1）（请参阅食谱）
10x磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4 （请参阅食谱）
碱性甲醇（请参阅食谱）
碱性水（请参阅食谱）
地高辛（请参阅食谱）
磷酸吡rid醛5'（请参阅食谱）
L-丝氨酸库存（请参阅食谱）
0.05％胰蛋白酶（请参阅食谱）
闪烁液（请参阅配方）
胶原蛋白（请参阅食谱）
胶原蛋白涂层（请参阅食谱）

设备

细胞培养罩（LABCONCO，目录号：36213043726）
-80 °C冰柜（Thermo Scientific，型号：8155）
CO 2 培养箱（Thermo S Cientific，型号：3110）
康特斯Dounce玻璃均质机（VWR，目录号：KT885300-0007）
带有台式转子的台式冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810）
台式超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima MAX-XP）
TLA 120.2转子（Backman Coulter，S / N：16U1971）
反闪烁（Backman C Oulter，M Odel：LS6500）
水浴（Thermo Scientific，型号：2354）
氮气（Airgas，目录号：NI UHP300）
CO 2 气（Airgas，目录号：CD USP50 ）
Vortexer （Vortex-Genie 2，型号：SI-0236）
台式高速离心机（Thermo Scientific，型号：accuSpin Micro 17）

程序

L- [ 3 H（G）]-丝氨酸的提取
L- [ 3 H（G）]-Serine只能在适当的预防措施下在指定和授权的地方使用和存放。
将放射性废物处置在专门指定的废物容器中。
在提取前后取2 µl丝氨酸，并测量放射性以计算L- [ 3 H（G）]-丝氨酸的回收率。
将0.2 ml的[ 3 H]-丝氨酸分配到2 ml螺帽管中，然后将0.5 ml 氯仿：甲醇（比例为2：1）加入管中。
将试管涡旋1分钟。
在室温下，以高速离心机将试管以16,200 x g 离心2分钟。
将上层水相转移到新鲜的2 ml螺帽管中。
将试管放入家用真空瓶中30分钟，以去除痕量有机溶剂。
提取后测量放射性以计算L- [ 3 H（G）]-丝氨酸的比活度。
使用提取的[ 3 H]丝氨酸测量细胞和膜中的SPT活性。
提取的[ 3 H]-丝氨酸将产生较少的背景，即在SPT分析中用myriocin处理时计数较低。

完整HeLa细胞中脂质抑制丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）活性的测定
在DMEM完全培养基中培养HeLa细胞，并将细胞维持在37°C和5％CO 2 的CO 2 培养箱中。
在第1天，板HeLa细胞（7×10 4 细胞/孔）在胶原包被的24 - 孔平板用1ml的DMEM完全培养基中。
见食谱胶原涂层的过程在24 - 孔板中。
将细胞分为4组，分别用于对照，C8-神经酰胺，myriocin处理和蛋白质分析。
每组准备4口井，并使用平均值进行计算。
十四烷是SPT的特异性抑制剂，是该测定的阴性对照。
在第2天，向细胞中加入10 µM C8-神经酰胺或1 µM桃红霉素，并在CO 2 培养箱中孵育1小时，请参见C8-神经酰胺和桃红霉素制备方法。
用甲醇-BSA复合物孵育对照细胞。
1小时后，取出C8-神经酰胺或myriocin，并在室温下用0.25 ml PBS轻轻洗涤细胞。
通过向无丝氨酸MEM培养基（5 µCi / ml无丝氨酸的培养基）中的细胞中加入0.25 ml提取的3 H-丝氨酸，并将细胞在CO 2 培养箱中于37 °C 孵育1 h，来测量SPT活性。
1小时后，取出放射性丝氨酸，并在室温下用0.25 ml PBS轻轻洗涤细胞。
加入400 µl碱性甲醇终止反应，并使用塑料细胞提升器刮擦细胞。
将细胞转移到2 ml螺帽管中。
总鞘脂类在提取碱性条件。如下文在小号挠度H.
参阅˚F igure 1A中戴维斯等人。（2019 ）和˚F igure 2A中{人萧，2015＃20} 人萧等人。（2015 ）用于结果。

透化HeLa细胞中SPT活性的测定
板HeLa细胞（7×10 4 细胞/孔）在包被的24胶原- 孔板，孵育在CO 2 培养箱中培养24小时。
将细胞分为4组，分别用于对照，C8-神经酰胺，myriocin处理和蛋白质分析。
每组准备4口井，并使用平均值进行计算。
24小时后，用Opti-MEM中制备的0.02％洋地黄皂苷透化HeLa细胞。
加入250μl0.02％洋地黄皂苷并在37 °C 下孵育细胞3分钟。
3分钟后，取出洋地黄皂苷并在室温下用0.25 ml PBS轻轻洗涤细胞。
预温育培养基中的制备，50mM的HEPES pH 8.0中，1mM EDTA和20微摩尔吡哆5 ' 磷酸。
用预温育培养基稀释C8-神经酰胺或myriocin，并预热至37 °C 。
向透化的细胞中加入200 µl带有或不带有10 µM C8-神经酰胺或1 µM十四烷的预培养培养基。
在CO 2 培养箱中于37 °C 孵育细胞30分钟。
30分钟后，添加标签介质到每个孔的200μl的，包含2 微居里萃取[的3 H] -丝氨酸，1米中号L-丝氨酸，和50 μ 中号棕榈酰-辅酶A 在预温育培养基中制备。
将细胞在CO 2 培养箱中孵育60分钟。
60分钟后，取出标签纸。
加入400 µl碱性甲醇终止反应，并使用塑料细胞提升器刮擦细胞。
将细胞转移到2 ml螺帽管中进行脂质提取。
总鞘脂类在提取碱性条件。如下文在小号挠度H.
参阅˚F igure 1A中戴维斯等人。（2019 ）和˚F igure在2A-B 人萧和瓦滕伯格（2012 ）为结果。

HeLa细胞裂解液的制备
将3 x 10 6 HeLa细胞接种到装有DMEM完全培养基的T-150烧瓶中。
在CO 2 培养箱中培养HeLa细胞48小时，以达到90-95％的融合度。
除去DMEM完全培养基，并在室温下用4 ml PBS洗涤细胞。
向细胞中加入4 ml 0.05％的胰蛋白酶，并在室温下孵育2分钟。
2分钟后，取出胰蛋白酶，将细胞在37 °C 下孵育5分钟。
用10 ml冰冷的DMEM完全培养基收获细胞。
通过以72 x g 离心10分钟收集细胞。
用10 ml冰冷的PBS洗涤细胞。
将细胞重悬于1.6 ml溶胀缓冲液（10 mM Tris pH 7.5、15 mM KCl 和1 mM MgCl 2 ）中，并在冰上孵育15分钟。
为此，从25x储备液中加入534 µl 1 M蔗糖，7 µl 200 mM EDTA和80 µl蛋白酶抑制剂混合物。
注意：通过将1个蛋白酶抑制剂片剂溶解在2 ml 水中制成2 5x原料。

使用7毫升Dounce匀浆器使用杵B将其在冰上匀浆30到40次。
离心匀浆以在4 °C下用转桶式转子以72 x g的速度除去未破碎的细胞和细胞核10分钟，并收集上清液。
用1 ml注射器将无细胞裂解液通过26号针头10次。
等分试样100 微升裂解物至1.5mL管中，搭扣用液氮，并储存在冷冻- 80 ℃，直至进一步分析。

总膜的制备
无细胞裂解物，准备将如上所述在小号挠度D.
将1 ml无细胞裂解液转移到每个干净的厚壁超离心管中，然后在TLA 120.2转子中于4 °C 以434,513 x g 离心20分钟。
丢弃目标。
用500 µl膜重悬缓冲液（250 mM蔗糖，25 mM Tris，pH 7.4和20 µl蛋白酶抑制剂混合物（来自25x储备液））重悬膜沉淀，并用Dounce匀浆器使用杵笔B匀浆10次。
用1毫升注射器将膜通过26号针头10次。
将100 µl 膜分装到1.5 ml试管中，并用液氮速冻并保存在-80 °C 直至进一步分析。

脂质抑制无细胞裂解物或总膜中丝氨酸棕榈酰转移酶活性的测定
在2 ml螺帽管中进行体外SPT活性，反应总体积为200 µl。
为了用短链神经酰胺测定SPT活性，在有或没有10 µM C8-神经酰胺或1 µM阿霉素的预孵育缓冲液中于冰上孵育40分钟的无细胞裂解物（总蛋白100 µg）或膜（总蛋白50 µg）。分钟
预孵育缓冲液包含50 mM HEPES pH 8.0、25 mM DTT，2 mM EDTA和20 µM PLP。
40分钟后，添加100 µl标记混合物，然后充分混合。
标记混合物包含2 mM丝氨酸，100 µM棕榈酰CoA，2 µCi 提取的[ 3 H]-丝氨酸。
将试管在37 °C下孵育60分钟。
加入400 µl碱性甲醇终止反应。
总鞘脂在提取碱性条件。如下文在小号挠度H.
参阅˚F igures 1A，1B，2A和3A中戴维斯等人。（2019 ）用于结果。

用长链神经酰胺测定SPT活性
在膜中产生长链神经酰胺，用20 Myu M 鞘氨醇和50 Myu M 24 孵育50 Myug膜：1 CoA或1 Myu M Myriocin或50 Myu M Fumonisin -B1，最终体积为100 Myu L在缓冲液中含有20 mM HEPES pH 7.4、25 mM KCl ，2 mM MgCl 2 和0.1％不含脂肪酸的BSA。
伏马菌素-B1 是神经酰胺合酶的抑制剂。
将该反应混合物在37 °C下孵育60分钟，以通过内源性神经酰胺合酶生成具有24：1酰基链的神经酰胺。
60分钟后，加入100 μ 标记混合物的升，并在37温育额外60分钟管℃下。
标记混合物包含50mM的HEPES pH 8.0中，1mM的DTT，10mM的EDTA，20 μM PLP，2mM的丝氨酸，100 μ 中号棕榈酰辅酶A和2 μ 次萃取[ 3 H]丝氨酸。
该反应通过停止增加400 MYU 模式L碱性甲醇和脂类提取物在碱性条件下所描述的下面小号挠度H.
参阅˚F igure 2B-C在戴维斯等人。（2019 ）用于结果。

碱性条件下总鞘脂的提取
向装有细胞或膜或含有400 µl碱性甲醇的裂解液的试管中加入100 µl氯仿。
将试管涡旋并在高速离心机中以16,200 xg 的速度离心1分钟。
加入500 µl氯仿，然后加入300 µl碱性水和100 µl 2 N NH 4 OH分离水相和有机相。
将试管涡旋1分钟，然后在高速离心机中以16,200 xg 旋转1分钟。
吸出上层水相。
向下部有机相中加入1 ml碱性水，充分涡旋，然后以16,200 xg 离心1分钟。
吸出上层水相，并再次重复上述步骤6。
将350 µl下层有机相转移至闪烁瓶中，并在氮气下干燥。
加入5 ml闪烁液，充分涡旋并使用闪烁计数器对放射性进行计数。

数据分析

I N的体外表达和体外SPT活性为总鞘脂中的[ 3 H]-丝氨酸（CPM / Mg / Min）。
在这里，我们提供了从先前进行的实验获得的结果和详细步骤来计算我Ñ体内和i的体外SPT活性与来自先前进行的实验获得的结果。
Ť 能够1 示出的结果体外SPT活动从HeLa细胞的膜。

表1. HeLa细胞总膜中丝氨酸棕榈酰转移酶的活性

管号

控制（CPM）

肌球蛋白（CPM）

管1

659

55

管2

649

43

管3

571

45

意思

626

47

标清

48

五

将CPM值归一化为总蛋白mg（用于SPT分析的50 µg蛋白）
对照：626.5 / 0.05 × 1 = 12 ，，530 CPM / mg

十四霉素：47.6 / 0.05 × 1 = 952 CPM /毫克

将值转换为每分钟（进行60分钟的SPT分析）
对照：12530/60 = 208.8 CPM / mg / min

肌球蛋白：9 52/60 = 15.8 CPM / mg / min

在体内和i的体外SPT活性表示为[ 3 H] SER 总共鞘脂INE（CPM /毫克/分钟）。
的表达我在体外SPT活性[ 3 H] -丝氨酸到TAL鞘脂（皮摩尔/毫克/分）
在底物（标记混合物）总放射性为1 ，280 ，980 CPM。
SPT反应混合物包含200 nMol 的丝氨酸。
考虑20 0 纳摩尔丝氨酸的相当于1 ，280 ，980 CPM。
使用此公式从该值计算比活，
丝氨酸的nMol / 底物中的CPM × SPT分析得出的平均CPM = X nMol ，

例如1,200 / 1 ，280 ，980 × 626 = 0.097 纳摩尔[的3 总共鞘脂H]丝氨酸。

对照SPT活性的平均值为626 CPM。
将上述值转换为每毫克蛋白质0.097 / 0.05 × 1 = 1.94 nMol / 毫克蛋白质。
将上述值转换为每分钟1.94 / 60 = 0.032 nMol / mg / min。
从纳摩尔到转换值皮摩尔由MULT iplying上述值由1000 （0.032 × 1 ，000 = 32 皮摩尔/毫克/分钟）。
体外SPT活性表示为[ 3 中总的鞘脂H] -丝氨酸（皮摩尔/毫克/分钟）。

菜谱

DMEM完全培养基
500 ml DMEM培养基
50 ml FBS
10 ml HEPES pH 8.0 5 ml谷氨酰胺和5 ml青霉素-链霉素
C8-神经酰胺将
10 mg C8-神经酰胺溶解在1.174 ml甲醇中，作为20 mM储备液，并储存在-20 °C下
鞘氨醇
10 mg鞘氨醇溶解于3.34 ml甲醇中，作为-20 °C下10 mM的储备液
Palmitoyl CoA将
10 mg的Palmitoyl CoA溶解在1.99 ml DMSO中，作为5 mM储备液，并储存在-20 °C
24：1 辅酶
A将5 mg的24：1辅酶A溶于857.2 µl的DMSO中，制成5 mM储备液，并储存在-20 °C下
不含
脂肪酸的BSA在PBS中以2％的储备液制备的不含脂肪酸的BSA，并使用0.2 µm注射器式过滤器过滤并灭菌，并储存在4 °C下
1毫米C8-神经酰胺
每次新鲜时，将2.5 µl的BSA复合物2.5 µl的20 mM C8-神经酰胺与47.5 µl的不含2％脂肪酸的BSA混合

甲醇：BSA 复合物
每次新鲜时，将2.5 µl甲醇与47.5 µl 2％不含脂肪酸的BSA混合

Myriocin将Myriocin
溶解为1 mM的甲醇溶液，并储存在-20 °C
伏马菌素B1将
1 mg 伏马菌素B1溶解在92.4 µl DMSO中，作为15 mM储备液，并储存在-20 °C下
氯仿：甲醇（2：1）
混合2体积的氯仿和1体积的甲醇
10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的
15.4毫KH 2 PO 4 ，1.55 M氯化钠和28 mM的钠2 HPO 4·水中7H 2 O，如果需要，用HC L将PH调节至7.4
碱性甲醇将
0.7克氢氧化钾溶于100毫升甲醇
碱性水在100毫升水中
添加100微升2 N NH 4 OH
毛地黄皂苷
在DMSO制备1％毛地黄皂苷作为库存，并稀释至0.02％中的Opti-MEM
在水中以20 mM的储备液
制备5' 磷酸吡stock醛，并在-20 °C下储存
L-丝氨酸原液
以50 mM的储备液在水中制备丝氨酸并储存在-20 °C

0.05％胰蛋白酶将
0.25％胰蛋白酶用磷酸盐缓冲液7.4稀释至0.05％，然后过滤灭菌并在4 °C下储存
闪烁液
我们使用Ecolite 闪烁液来测量水溶液中的放射性，使用Beta max来测量有机溶剂中的放射性
胶原蛋白将
10 mg胶原蛋白溶于10 ml 0.1 N乙酸中，在室温下混合3 h，然后在PBS中将胶原蛋白稀释至50 µg / ml，并在4 °C下保存
胶原涂覆
下平衡胶原至室温和1ml添加到每个孔中的24 - ，在室温下孔板，孵育5 min.After孵育，通过移液完全除去所有胶原胶原是可重复使用至少10次。

Acknowledg 发言：

该测定方案是根据Rutti 等人（2009）的方法开发的，这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）向BW提供的RO1HL131340资助

完成利益

作者没有利益冲突要披露

参考文献

Breslow，DK，Collins，SR，Bodenmiller，B.，Aebersold，R.，Simons，K.，Shevchenko，A.，Ejsing，CS和Weissman，JS（2010）。Orm家族蛋白介导鞘脂稳态。Nature 463（7284））：1048-1053。
Davis，D.，Kannan，M. and Wattenberg，B.（2018）。Orm / ORMDL蛋白：Gate Guardians和Master Regulators。Adv Biol Regul 70：3-18。
戴维斯（DL），盖布尔（Kable ），Suemitsu ，J.，邓恩（TM）和瓦滕贝格（BW）（2019）。生物化学杂志294（13）：5146-5156。
Ferreira，CR，Goorden，SMI，Soldatos，A.，Byers，HM，Ghauharali-van der Vlugt，JMM，Beers-Stet，FS，Groden，C.，van Karnebeek，CD，Gahl，WA，Vaz，FM，江，X. and Vernon，HJ（2018）。脱氧鞘脂前体表明在患有丝氨酸可及性的原发性和继发性紊乱的个体中鞘脂代谢异常。Mol Genet Metab 124（3）：204-209。
Gable，K.，Gupta，SD，Han，G.，Niranjanakumari，S.，Harmon，JM和Dunn，TM（2010）。丝氨酸棕榈酰转移酶活性位点的致病突变引起催化混杂.J Biol Chem 285 （30）：22846-22852。
Han，G.，Gupta，SD，Gable，K.，Niranjanakumari，S.，Moitra，P.，Eichler，F.，Brown，RH，Jr.，Harmon，JM和Dunn，TM（2009）。赋予丝氨酸-CoA底物特异性的哺乳动物丝氨酸棕榈酰转移酶的亚基 .Proc Natl Acad Sci USA 106（20）：8186-8191。
Hanada，K.（2003）。丝氨酸棕榈酰转移酶，鞘脂代谢的关键酶。Biochim Biophys Acta 1632（1-3）：16-30。
Hanada，K.，Hara，T.，Nishijima，M.，Kuge，O.，Dickson，RC和Nagiec，MM（1997）。酵母LCB1的哺乳动物同源物编码丝氨酸棕榈酰转移酶的一种成分，该酶催化第一个步骤在神经鞘脂类合成。生物化学杂志272（51）：32108-32114。
Hornemann，T.，Penno，A.，Rutti，MF，Ernst，D.，Kivrak-Pfiffner，F.，Rohrer，L.和von Eckardstein，A.（2009）。丝氨酸棕榈酰转移酶的SPTLC3亚基产生短链类鞘氨醇。。碱生物化学杂志284（39）：26322-26330。
Hornemann，T.，Wei，Y.和von Eckardstein，A.（2007）。哺乳动物的丝氨酸棕榈酰转移酶是一种高分子质量的复合物吗？ Biochem J 405（1）：157-164。
Ikushiro，H.，Hayashi，H.和Kagamiyama，H.（2001）。鞘脂单胞菌EY2395T菌株的水溶性同型二聚丝氨酸棕榈酰转移酶。纯化，鉴定，克隆和过量生产 .J Biol Chem 276（21）：18249- 18256。
Lowther，J.，Naismith，JH，Dunn，TM和Campopiano，DJ（2012）。丝氨酸棕榈酰转移酶的结构，机理和调控研究。Biochem Soc Trans 40（3）：547-554。
Nagiec，MM，Baltisberger，JA，Wells，GB，Lester，RL和Dickson，RC（1994）。酿酒酵母的LCB2基因和相关的LCB1基因编码丝氨酸棕榈酰转移酶的亚基，这是鞘脂合成中的初始酶.Proc Natl Acad Sci美国91（17）：7899-7902。
Rutti，MF，Richard，S.，Penno，A.，von Eckardstein，A.和Hornemann，T.（2009）。一种确定丝氨酸棕榈酰转移酶活性的改进方法。J Lipid Res 50（6）：1237-1244。
Siow，DL和Wattenberg，BW（2012）。哺乳动物ORMDL蛋白介导神经酰胺生物合成中的反馈响应。J Biol Chem 287（48）：40198-40204。
Williams，RD，Wang，E.和Merrill，AH，Jr.（1984）。肝脏长链碱基合成的酶学：大鼠肝微粒体中丝氨酸棕榈酰转移酶的表征。Arch Biochem Biophys 228（1）：282-291。
Siow，D.，Sunkara，M.，Dunn TM，Morris，AJ，Wattenberg，B.（2015）。ORMDL /丝氨酸棕榈酰转移酶的化学计量确定ORMDL3表达对鞘脂生物合成的影响。J Lipid Res .56（4）：898- 908。