材料和试剂

P ipette提示
6孔板
封口膜
1.5 ml微量离心管
精密保护玻璃（＃1.5，24 x 24 mm; 例如，Marienfeld -superior ;目录号：0117640 ）
玻璃瓶中的标准飞食介质（例如，BDSC玉米面食品）
细胞培养多孔板（例如，Greiner Bio-One，目录号：657160）
果蝇（同基因w 1118 株）
甘油为分子生物学，≥ 99.0％（西格玛- Aldrich公司，目录号：G5516-100ML）
三磷酸腺苷（ATP）（Alfa Aesar ，目录号：J10585）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ML）
甘醇-双乙烯（2-氨基乙基醚）-N，N，N ' Ñ ' - 四乙酸（EGTA），分子生物学级（默克，目录号码：324626-25GM）
氯化镁（MgCl 2 ）（Merck，目录号：M8266-100G）。
氯化钾（KCl ）（默克（Merck），目录号：P9541-500G）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Merck，货号：10197777001）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Merck，目录号：10837091001）
多聚甲醛（Fisher Scientific ，16％w / v水溶液，无甲醇，Alfa Aesar ，目录号：433689M）
山羊血清（Sigma - Aldrich，目录号：G9023-10ML）
一抗（有关示例，请参见表1）
二抗（与Alexa647偶联的山羊抗兔，抗小鼠或抗大鼠IgG的高度交叉吸收抗体; Thermo Fisher，目录号：A-21245，A-21235，A-21247）
GFP抗体（例如，Thermo Fisher，目录号：A6455 ）。
Ñ anobodies（例如，Chromotek ，目录号：gb2AF647）
FLAG抗体（例如，Sigma - Aldrich，目录号：F7425）
的Alexa 氟TM 488鬼笔环肽（赛默飞世，目录号：A12379）
葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：49139）
葡萄糖氧化酶（Sigma - Aldrich，目录号：G2133-50KU）
过氧化氢酶（Sigma - Aldrich，目录号：C100）
氯化钠（NaCl）（Sigma - Aldrich，目录号：204439）
三（羟甲基）氨基甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）
β- 巯基乙胺（MEA）（Sigma-Aldrich，目录号：M6500）
Twinsil 速度（Picodent ，目录号：1300 1002）
浸油（奥林巴斯F型）
2x放松解决方案（请参阅食谱）
1x放松解决方案（请参阅食谱）
解剖解决方案（请参见食谱）
固定液（请参阅食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
dSTORM 成像缓冲区（请参阅食谱）

表1.实施例的初级抗体的，拉贝灵d rosophila IFM部件

蛋白质靶

名称

抗原

主办

稀释

资源

肌动蛋白

肌动蛋白（大鼠）

单克隆抗体与肌动蛋白和关节炎素反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 237

凯汀（Sls700）

凯丁（Ig16）

表位位于接头-Ig16-接头区域。

鼠

1：200

Abcam MAC 155

肌球蛋白重链

肌球蛋白S2

单克隆抗体与Mhc的亚片段2反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 147

投影蛋白

Projectin（Ig26）

表位位于Ig26结构域。

鼠

1：200

Abcam MAC 150

投影蛋白

Projectin（P5）

未知。

老鼠

1：300

DSHB

肌球蛋白

肌球蛋白

抗体与原肌球蛋白TmH-33，TmH-34反应。

鼠

1：400

Abcam MAC 141

肌球蛋白H-34

肌球蛋白H-34

抗体与TmH的34个亚型反应，也与谷胱甘肽S-转移酶2家族和BiP（hsc72）反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 143

肌钙蛋白C

肌钙蛋白C

抗体在飞行肌肉中与肌钙蛋白C异构体F1和F2反应，在非飞行肌肉中与肌钙蛋白C反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 352

肌钙蛋白T

肌钙蛋白T

抗体与Lethocerus，果蝇和蜻蜓肌肉（飞行和非飞行）中的肌钙蛋白T反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 145

Zasp52

Zasp52

表位位于外显子16编码的序列中。“ 1D3-3E4”

老鼠

1：400

DSHB

α-肌动蛋白

α-肌动蛋白

单克隆抗体与α-肌动蛋白反应。

鼠

1：200

Abcam MAC 276

设备

标准果蝇饲养设备
CO 2 垫（例如，FlyStuff flypad ，杰纳西科学，目录号：59-114）
保温箱，设置为25°C
立体显微镜（例如，徕卡显微系统，型号：M80 ）
自制解剖夹板或市售等效物（有关详细信息，请参阅步骤）
精密镊子，带尖尖直头，0.06毫米（Carl Roth DUMONT ，目录号：K342.1）
P2，P20，P100和P1000微型移液器（例如，Gilson，目录号：F144801 ，F12 3600 ，F123615和F123602）
冷冻离心机（例如，Eppendorf ，型号：5424 R，目录号：5404000010）
湿度箱（有关详细信息，请参阅步骤）
647 nm激光源，用于荧光激发（647 nm，Pmax = 300 mW ； MPB通信）
405 nm激光源用于重新激活（405 nm，Pmax = 60 mW ; Nichia）
尼康LU-N4激光装置
尼康Ti -E倒置显微镜镜架，带油浸物镜（CFI Apo 100 x ，1.49 NA Nikon）
尼康完美对焦系统
四通道荧光滤光片套装（Semrock LF405 / 488/561 / 635-A-000，Semrock FF01-446 / 523/600 / 677-25）
单通道荧光滤光片组（Semrock ，目录号：Di03-R635-t1，BLP01-647R-25）
排放过滤器的过滤轮（Thorlabs ，目录号：FW102C）
带通滤光片690/70 H（AHF，目录号：F49-691）
4f光学望远镜在探测器路径中，2 * （Thorlabs ，目录编号：TTL200）
EM-CCD相机（Andor iXon3 897 BV EMCCD）

软件

NIS Elements AR 5.02（尼康）
Matlab R2018b（Mathworks ）或更高版本，带有图像处理工具箱，优化工具箱，并行计算工具箱和曲线拟合工具箱
rainSTORM v3.1.7（可从以下网址下载：http : //titan.physx.u-szeged.hu/~adoptim/? page_id = 582 ）。
最低系统要求：4核CPU，32GB RAM
注意：可在下载页面上找到《用户指南》。

IFM Analyzer v2.0（可从以下网址下载：http : //titan.physx.u-szeged.hu/~adoptim/?page_id=1246）。
注意：在下载页面上可以找到《用户指南》，在下载页面上可以找到示例导出的节文件。

程序

收集苍蝇准备肌原纤维
在小瓶中饲养所需基因型的果蝇，或者翻新解剖用砧木，或者与至少20只雌性原始果蝇杂交，保持瓶子直立直到果蝇开始孵化。
收集刚孵出的苍蝇，并让它们吃新鲜的食物，直到达到所需的年龄。
笔记：

苍蝇应在标准实验室条件下于25°C饲养。
作为野生型，我们使用了同质化的w 1118 菌株。
为了便于分析，我们在禁闭后约24小时解剖了果蝇。

解剖苍蝇个别肌原纤维preparati 上
用2倍松弛溶液和甘油新鲜制备解剖溶液（请参见食谱1和3）
组装必要的设备，包括两个精密镊子，移液器，移液器吸头，解剖垫和在冰上的解剖溶液。
用移液器将200 µl冰冷的解剖溶液吸到解剖垫上。
麻醉果蝇并将它们一次转移到解剖垫上，在仍然麻醉果蝇的情况下，用镊子在立体显微镜下用镊子从胸部去除头，腹部，翅膀和腿。
将胸部移至解剖溶液中并将其撕开。
将半胸椎在解剖溶液中于冰上孵育2小时，或将其在-20° C下储存过夜。
使用镊子分离背侧纵飞行肌（从thoraces DLMS）并将其放置在解剖溶液的Eppendorf管中补充有0.5％的Triton X-100。
通过用200 µl移液器以中等速度吸移约10次来解离DLM。
在10,000 xg f的条件下于4°C 旋转2分钟，然后将肌原纤维重新悬浮于200 µl 1x松弛溶液中进行洗涤。以中等速度将颗粒移液器重新悬浮约10次。
重复离心和洗涤步骤。
重复离心，将纤维重新悬浮于1x松弛溶液中。对于从2个胸腺分离出的DLM，使用20 µl 1x松弛溶液。
注意小号：

有关解剖的视觉指南，请参见Xiao等人，2017年。
我们的自制解剖垫是由硅胶（黑色）浇铸而成的，具有平坦，略带弹性，可水洗的表面，也可以使用市售的乙烯基垫来代替。
所有漂浮的可见组织块的消失都表明有足够的解离，理想情况下，在最后的洗涤/重新悬浮步骤中可以达到解离。

固定单个肌纤维
准备一个湿度chamb 呃
组装湿度箱时，请使用带盖的不透明塑料盒，该盒可保护样品免受光照，这对于处理荧光染料很重要。在盒的底部衬上湿纸巾以增加湿度。在湿度室内的6孔板中盖上一片Parafilm，用作盖玻片的清洁平坦平台。

准备24 x 24毫米的盖玻片，并将其放在Parafilm上。
固定前，将20 µl的myofril悬浮液吸移到盖玻片的中间。
用移液管吸取200 µl固定液（请参阅材料和试剂）到肌原纤维滴剂中，并在室温下固定15分钟。
用200 µl 1x松弛液洗涤3次。
笔记：

潮湿箱的盖子必须正确密封，以在冰箱中过夜保温期间保护样品。
确保样品永远不会完全干燥。
保持正常洗涤强度，肌原纤维将在常规洗涤过程中保持附着在盖玻片上。

dSTORM 成像的免疫染色
在室温下，将样品在200 µl封闭溶液（请参见第5条）中封闭30分钟。
在封闭溶液中加入一抗，并在4°C的湿度箱中孵育过夜（示例请参见表1）。
用200 µl封闭液冲洗5次。
在室温下在封闭溶液（1：600，参见材料和试剂）中添加适当的Alexa Fluor 647共轭二抗2小时，并添加Phalloidin-Alexa488（1：200，Life Technologies）作为独立标记物。
用200 µl封闭液冲洗四次，然后用200 µl过滤的PBS冲洗一次。
将样品浸没在培养皿或6孔板中的4°C的已过滤PBS中，避光保存直至dSTORM 成像。
笔记：

如果在成像过程中检测到高背景，请延长洗涤步骤。
使用Phalloidin Alexa488通道可以在数据处理过程中明确区分H区和I带。
获得理想的标记密度至关重要。必须在恒定的二抗浓度下测试多种一抗稀释液。在STORM成像之前，必须使用共聚焦显微镜检查起始稀释液。
根据一抗的不同，某些样品必须立即处理，而其他样品可以在成像之前保存数周，而质量不会明显下降。

dSTORM的样品制备
重新准备DSTORM 成像缓冲液（请参见配方6）。
将40 µl dSTORM 成像缓冲液放在载玻片上，用包含样品的盖玻片覆盖它，然后用twinsil 速硅胶密封。
如有必要，清洁并干燥盖玻片的外表面。
将样品放在显微镜载物台上。

dSTORM 收购
启动对焦稳定系统。
如果样品仅用Alexa Fluor 647标记，则必须使用“单通道过滤器组”，否则请选择“四通道过滤器组”。
在647nm处利用激发激光器在低功率（30 MW ，0 。06 Pasento AOTF 而< 10瓦/厘米2 ），以选择未损坏，直，并分离肌原纤维（视频1）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003075--1426约瑟夫·米哈利856384 \ video1.jpg

1.视频选择用于DSTORM 成像的肌原纤维进行测量时，我们选择与成像平面平行的笔直的肌原纤维切片。

调整焦点并成像肌原纤维的中央部分。
将ROI大小设置为仅包括样品的激发区域。
捕获和保存快照图像（Figu 重新第1A条和1个C）。
关闭相机的快门。
647牛米提高激光器功率（300 MW 100 Pasento AOTF而≈ 2 。5-3 KW /厘米2 ），触发光电开关状态的荧光染料。等待5-10秒钟，打开快门，以评估眨眼荧光团（视频2）。
笔记：

钍如果ERE的是重叠的分子，因为过于密集标签ING，漂白剂样品1分钟通过同时647 nm激发激光器在全功率（300 MW 100 Pasento AOTF而≈2 。5-3 KW /厘米2 ）和以中等功率（10 mW ，40％AOTF和≈20 W / cm 2 ）的405 nm激光，重复此漂白程序多次。如果闪烁仍然太密集，则必须以较低的标记密度制备新样品。
如果由于激发功率密度不足而导致分子重叠（并且无法进一步提高激光功率），则停止测量，减小激发光斑尺寸并重新开始测量;如果无法减小光束尺寸，则准备新样品具有较低的标签密度。
如果高本底检测（E 。G. ，IR背景当“单通道滤镜套装”的使用或反斯托克斯荧光从第二染料（Gajdos 等人，2020年）的时候，“四通道滤镜套装”用于），除了LP 647过滤器外，还使用690/70发射过滤器。
有关显微镜配置的更多详细信息，请参见Szikora 等，2020 。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003075--1426约瑟夫·米哈利856384 \ video2.jpg

视频2.Examples 的理想和subop timal 标签荷兰国际集团的密度和荧光闪烁behavior.In 理想的情况下闪烁的荧光应该是明亮，从每个other.In此相比明显分开，稀疏的标记结果太少信号，磨片REAS如果标签太密，信号之间不会明显分开比例尺：5 µm。

在20 毫秒或30 毫秒的曝光时间下获取20,000-50,000帧，并将EM增益设置为100。
注意：曝光时间是根据荧光染料的闪烁特性（相机数量和重叠分子的数量）设置的，理想情况下，曝光时间等于单个荧光分子的ON状态寿命。漂白率和再活化效率。

如有必要，可随时以低功率（< 1 mW ）使用405 nm激活激光器。
重复dSTORM 采集程序，以获取每个样品至少6个区域的数据。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003075--1426约瑟夫·米哈利856384 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

1图。结合DSTORM 和平均结构证明了在IFM中可实现的分辨率A，C。Widefield和B，D。Arufa -Actinin（MAC 276）免疫染色的飞行肌肌原纤维的DSTORM 图像E.重建在对旋转和平移配准的STORM图像进行结构平均后，分布中的α-肌动蛋白。

数据分析

使用rainSTORM 评估获取的dSTORM 数据
启动Matlab ，将工作目录更改为rainSTORM 文件夹，然后运行“ startup; rainSTORM ”命令。
注意：在工作区中进行短暂的初始化后，应弹出主rainSTORM GUI。如果启动脚本失败，它将在工作区中显示一条错误消息，错误或警告的可能来源是：旧的Matlab 版本或缺少的工具箱。

单击“浏览”以加载TIFF或ND2堆栈。
选择所需的定位方法（首先使用默认的“最小二乘高斯2D线性Bg ”选项）。
注意：rainSTORM 中提供了其他本地化和背景减除方法。有关更多详细信息，请参见rainSTORM 网页上的rainSTORM_2016_user_guide_ver1.pdf （可从以下网址下载：http : //titan.physx.u-szeged.hu/~adoptim/?page_id=582 ）。。

单击“全部处理”以完成原始测量数据的本地化过程。
等待显示摘要图像，这将指示过程结束。
注意：也可以在Matlab 主窗口中跟踪进度。

使用rainSTORM 对定位进行分析，校正和可视化
选择“简单直方图”重建方法，并将16设置为“重建比例”。注意：在我们的系统中，这会将
超像素大小设置为10 nm。
将验收过滤器调整为以下各项：
对于汤普森精度：'Std X'：0-25 nm和'Std Y'：0-25 nm

PSF尺寸为： '西格玛X'：0.7- 1.5 PX和'西格玛Y'：0.7 - 1.5 Px的

单击“处理所有重新确认”以对超分辨图像进行初始重建。
单击“显示超分辨率图像”以显示重建的图像（图S 1B 和1 D）。
要应用漂移校正（如有必要），请单击“自动漂移校正”按钮。
单击“显示超分辨率图像”以显示重构图像。
单击“报告当前侦察”以保存当前重建。
注意：本地化表以csv文件格式保存，而超分辨率图像和评估直方图则为png 格式。

导出单个节
重建后，单击“ rainSTORM_Image_Viewer ”窗口上的“ 导出框部分”按钮。
可以在超分辨图像上手动选择研究结构周围的矩形区域（“双线”，“单线”或“间隙”）。
注：其结果是，有两个文件，A 。的CSV 和A 。垫。文件导出到文件夹中的原始测量数据文件的名称都产生通过连接“ ROI_Xxx_Yyy ”到原来的文件名，其中XX和歪歪是x和所选区域中心的y坐标。

切换分析工具
清除Matlab 工作区，然后从路径中删除rainSTORM 文件夹。
将工作目录更改为IFM Analyzer文件夹，然后运行“ startup; IFMAnalyser ”命令。

使用IFM Analyzer创建本地化分布直方图
要导入部分，请在“处理部分数据”选项卡上单击“添加文件” （图3A）。
选择最合适的模型：“单线”，“双线”或“间隙”。
如果需要，请调整配件选项。
笔记：

请参阅用户指南以获取更详细的描述（可从http://titan.physx.u-szeged.hu/~adoptim/?page_id=1246下载）。
首先使用默认值并一次仅更改一个参数。
可以在原始研究论文的方法部分（Szikora et al。，2020）中找到有关亚肌节结构的几何参数的其他信息。
单击'Process Selected'按钮以对每个文件进行初始分析，这将预测结构的对称轴（图2A），将二阶多项式拟合到结构上（图2B），并合并本地化以创建本地化分布直方图（图2C）。
笔记：

如果禁用了``自动处理''选项，则必须手动验证每个初始预测，这可以在每次拟合后在弹出窗口中完成，可以在其中调整每个拟合选项。
输出文件保存在四个子文件夹中（initLine ，fitCurve ，histFigure ，histData ）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003075--1426JózsefMihály856384 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2. 创建定位分布直方图使用IFM Analyzer.A。所述structu的对称性的初始预测轴线重（标签用抗ED Projectin （P5）和Alexa Fluor 647）.B 。二次多项式（红线）是C. 使用二阶多项式作为参考线创建的定位分布直方图。

初步拟合后，可以使用“移动到处理直方图”或“移动到合并”按钮将选定的部分移至另一个选项卡进行进一步分析。
注：牛逼，他的结果保存在子文件夹。

使用IFM分析仪对本地化分布组织细胞进行定量
可以在“ 过程直方图数据”选项卡（图3B）中对生成的直方图（位于histData 子文件夹中）进行量化。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003075--1426JózsefMihály856384 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3. 使用IFM分析仪处理本地化数据的步骤A.在过程截面数据选项卡中执行初始拟合，改进的拟合和直方图生成B.在过程直方图选项卡中进行直方图拟合和测量C.在“合并”选项卡中生成本地化数据的高分辨率图像。

可以缩小接受范围以丢弃重叠和焦点不集中的位置。
注意：对于我们的显微镜系统，最佳PSF尺寸为0.9（CCD像素），因此可接受范围设置为0.8-1.0。

设置适当的模型功能：单线和双线结构最好用'Gaussian'选项描述。间隙结构有一个特殊的'Gap'模型。
应根据结构设置“样品类型”。
注意：可以在“配件选项”选项卡中设置其他配件选项，有关详细说明，请参见用户指南。

单击“选定处理”开始定量过程。
注意：可以在“ fittedWithImage ”子文件夹中检查拟合的视觉表示，而每个文件的拟合参数都存储在“ fittedParams /allfittedparams.csv”文件中。

使用IFM Analyzer合并部分中的本地化
为了创建本地化数据的总和超分辨率图像，必须将分析后的部分从“处理部分数据”选项卡移动到“合并”选项卡（图3C）。
注意：可以从histData 子文件夹直接加载文件。

选择列表中的所有元素。
注意：调整选项以更改拟合模型，图像大小或像素大小。

单击“选择处理”以生成汇总的超分辨率图像（图1E）。
注意：最终的合并图像是在' mergeData '子文件夹中以png 格式生成的。

笔记

始终对每个标记的结构至少重复进行至少3次染色实验，以实现代表性且可靠的测量。
尽管所有呈现的测量值都是使用我们定制的dSTORM 显微镜系统获取的，并且收集的数据已使用rainSTORM 本地化代码处理，但我们相信其他SMLM系统（Leica GSDIM，ONI Nanoimager 等）和本地化代码（ThunderSTORM ，RapidSTORM 等）也可以用于为IMF分析仪生成高质量的输入数据文件。
代替GLOX切换缓冲液，也可以使用Everspark 切换缓冲液（Provost et al。，2019）。我们对该缓冲液的初步测试产生了相似的结果，而没有氧气清除系统的时间限制。
我们主要使用常规的免疫荧光标记，但也测试了其他方法，例如可以通过GFP或FLAG等标签定位蛋白质，这些研究很有吸引力，因为通常缺少高质量的一抗，此外，在基于标签的定位方法中，表位的位置是精确已知的。提供了已标记的蛋白和天然蛋白的功能等效性，并已通过适当的测试（例如，抢救实验）进行了验证，这可能是一种非常有效的方法。市售GFP抗体（例如，赛默飞世，A6455 ）和纳米抗体（例如，Chromotek ，gb2AF647）是理想的dSTORM 成像，和FLAG抗体（例如，Sigma Aldrich公司，F7425）也可以使用。
单个肌原纤维的常规免疫荧光标记法的一个潜在缺点是，由于抗体的大小，紧凑型IFM中的抗体渗透/表位可及性可能受到限制。在这方面，由于纳米抗体的尺寸小，有望提供一种抗体。我们的初步数据表明，确实，纳米抗体能够改善可及性，但是，在对分辨率做出强有力的结论之前，还需要进一步优化我们的方法。
到目前为止，果蝇IFM是我们的主要模型系统，但是，我们的第一组初步数据表明，这种方法相对容易适用于从小鼠中分离出的单个肌纤维，最可能也适用于其他非果蝇肌原纤维。

菜谱

2x 放松解决方案
40 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0

10毫米MgCl 2

10毫米EGTA

10毫米ATP

10毫米DTT

2 mM PMSF

储存在-20 °C 并在6个月内使用

1x放松液
将2x松弛溶液与ddH 2 O 1：1（v / v）混合

新鲜准备并在样品制备过程中置于冰上

解剖解决方案
将2x松弛溶液与甘油1：1（v / v）混合

新鲜准备并在样品制备过程中置于冰上

固定液
将2x松弛溶液与16％多聚甲醛和ddH 2 O 2：1：1（v / v）混合

新鲜准备并在样品制备过程中置于冰上

阻塞解决方案
5％（v / v）山羊血清

0.3％（v / v）Trition X-100

在PBS中

储存在4°C 并在一周内使用

dSTORM 成像缓冲液（GLOX）
4％（w / v）葡萄糖

2,000 U / ml葡萄糖氧化酶

40,000 U / ml过氧化氢酶

25毫米氯化钠

22 mM三（羟甲基）氨基甲烷

4 mM三（2- 羧乙基）膦（TCEP）

100 mMβ- 巯基乙胺（MEA）

必须为每个实验重新准备成像缓冲液，因为其使用寿命限制在几（〜3）小时。

致谢

此处更详细描述的协议已在Szikora 等人（2020）中发表。这项工作得到匈牙利科学基金会（OTKA）（JM的K109330和K132782），匈牙利脑研究计划（KTIA_NAP_13-2-2014- 0007和2017-1.2.1-NKP-2017-00002（ME和JM），国家研究，开发和创新办公室（GINOP-2.3.2-15-2016-00001，GINOP-2.3.2-15-2016- 00032授予JM ，GINOP-2.3.2-15-2016-00036授予ME）和OTKA博士后奖学金（PD 128623授予SS），我们要感谢Idylle Labs 通过永恒缓冲区发送Everspark 测试套件。

利益争夺

作者声明没有任何竞争的经济利益..

参考文献

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