材料和试剂

50 ml锥形管（CentriStar 管，橙色盖）（Corning，目录号：430828 ）
15 ml锥形管（CentriStar 管，橙色盖）（Corning，目录号：430790）
6孔组织培养板（Costar，目录号：3516）
96孔平底组织培养板（Costar，目录号：3596）
猎鹰圆底管，5 ml，带按扣盖（Corning，目录号：352054）
人体外周血白细胞层（LifeSource ）
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）。
1x不含Ca 2+ 和Mg 2+的DPBS （Gibco，目录号：2017-07）
EDTA（0.5 M，pH 8.0）（Invitrogen，货号：15575020）
胎牛血清（基准TM 胎牛血清）（双子生物制品，目录号：100-106）
液氮
不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Invitrogen，目录号：21870-100）
MEM非必需氨基酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M7145-100 ml）
L-谷氨酰胺200 mM（100x）（Invitrogen，目录号：25030-081）
青霉素-链霉素（Invitrogen，目录号：15140-122）
2-巯基乙醇（1,000x）（Gibco，目录号：21985-023）
HEPES（1毫米）（Gibco，货号：15630-080）
丙酮酸钠（含8.5 g / L NaCl的100 mM溶液）（VWR，目录号：25-000-Cl）
台盼蓝溶液，0.4％（Invitrogen，目录号：15250061）
CD14隔离试剂盒（Miltenyi ，CD14 MicroBeads ，人类，目录号：130-050-201）
CD4分离试剂盒（Miltenyi ，CD4 + T细胞分离试剂盒，人类，目录号：130-096-533）
CD8分离试剂盒（Miltenyi ，CD8 + T细胞分离试剂盒，人类，目录号：130-096-495）
人重组IL-6（R＆D Systems，目录号：206-IL / CF）
人重组IL-10（R＆D Systems，目录号：217-IL / CF）
CellTrace TM CFSE细胞增殖试剂盒，用于流式细胞仪（Thermo Fisher，目录号：C34554）
一个NTI-CD3（克隆OKT3）（Invitrogen公司，目录号：16-0037-81）
活力染色（VID）– LIVE / DEAD TM 固定式Aqua死细胞染色试剂盒，用于405nm激发（Thermo Fisher，目录号：L34965）
Fc 阻滞剂– Fc受体结合抑制剂多克隆抗体，功能等级，eBioscience TM （Thermo Fisher，目录号：16-9161-73）
抗CD4 APC，克隆OKT4 （Thermo Fisher，目录号：17-0048-42）
抗CD8 APC，克隆3B5 （Thermo Fisher，目录号：MHCD0805）
1x DPBS + 2 mM EDTA（500 ml）（请参阅食谱）
1x DPBS + 5％FCS（500 ml）（请参阅食谱）
完整的RPMI培养基（1,000毫升）（请参阅食谱）
细胞冷冻培养基（2x库存）（请参阅食谱）

设备

移液器
无菌罩
-80 °C 冷冻室，带Mr. Frosty冷冻容器
离心机（Thermo Scientific TM Sorvall TM ST 8FR离心机）
培养箱（Thermo Scientific TM Forma TM Steri-Cult TM CO 2 培养箱）
水浴
反相显微镜
autoMACS Pro分离器（Mitenyi Biotec ）
流式细胞仪（BD FACSCanto细胞仪，BD Biosciences）
MAGPIX Luminex 200（密理博）

软件

FlowJo 版本10.5.3（FlowJo ）。
xPONENT 软件（Millipore）

程序

第0天：PBMC隔离

注意：本协议中的所有步骤均应在无菌罩中使用无菌技术完成，所有试剂均应无菌。

从健康的供体那里获得人外周血白细胞层或全血。下图1中显示的细胞数数据基于使用50 ml白细胞层样品。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902542--1422 Joseph Podojil 663800 \ Figs jpg \图1.jpg

总的PBMC获得的图1中的细胞数，CD14 + 细胞，CD4 + T细胞，和CD8 + Ť 来自健康供体（N = 12），从获得的cells.Buffy外套LifeSource。首先总的PBMC通过用离心分离收集的Ficoll -Paque PLUS gradient.The收集的PBMC进行计数，和CD14 + 细胞的排序purified.The CD14 - 细胞被进一步分成CD4 + T细胞和CD8 + 经由sorting.The数据T细胞群被表示为获得的细胞的数量，并在每个指示的人群上方显示平均细胞数。

将血沉棕黄层细胞按1：1比例重悬于1x DPBS中，例如，将25 ml 1x DPBS加入50 ml锥形杯中，再加入25 ml 血沉棕黄层样品，将血沉棕黄层-DPBS混合物通过移液均匀混合。
在单独的50毫升锥形杯中，加入15毫升Ficoll-Paque PLUS，然后覆盖35毫升上述棕黄层DPBS混合物。
在室温下，将血沉棕黄层-DPBS混合物加Ficoll-Paque PLUS 的分层试管以400 xg离心30分钟，并在离心机上关闭离心管。
旋转之后，收集PBMC层，并将PBMC放入新的50 Ml圆锥形中。有关制造商的支持协议，请参见以下链接（Https://Cdn.Gelifesciences.Com/dmm3bwsv3/AssetStream.Aspx?Mediaformatid=10061andodestinationid=10016andoassetid = 12637）。
将含有PBMC的50 ml锥形管以300 x g离心10分钟以沉淀PBMC。
用30 ml 1x DPBS 洗涤PBMC沉淀3 次，应通过以3 00 xg离心10分钟将PBMC沉淀。
最后一次洗涤后，使用血细胞计数器计数PBMC。

第0天：CD14 + 单核细胞分离和培养

将500 x 10 6 PBMCs细胞放入15 ml锥形管中，按照制造商操作规程使用人CD14阳性选择珠（Miltenyi ，CD14 MicroBeads ，人，130-050-201 ）完成CD14 + 单核细胞的分离无论是CD14 + 细胞和CD14 - 细胞的级分应该被保存，因为CD14 + 细胞级分将在重组人细胞因子的存在下培养，以产生B7-H4 + 为的巨噬细胞的T细胞共培养部的巨噬细胞。议定书（草案）CD14 - 细胞级分将被用于排序净化任CD4 + T细胞或CD8 + 的协议的巨噬细胞的T细胞共培养物部分所需的T细胞。
在6孔板中以5 x 10 6个细胞/孔（2.5 x 10 6个细胞/ ml）培养纯化的CD14 + 细胞。每个孔中的最终体积为2 ml完全RPMI培养基。
在培养开始时，将所需最终浓度的重组人细胞因子添加到含有CD14 + 细胞的各个孔中。本方案使用重组人IL-10和IL-6（终浓度为10 ng / ml）诱导B 7 -H4在培养后第3天收集到的巨噬细胞表面表达。然而，可以改变所使用的重组细胞因子以允许所需的表面分子在CD14 + 细胞上表达文化。
在5％CO 2 存在下于37 °C 下培养CD14 + 单核细胞3天。

第0天：T细胞分离和冷冻保存

从CD14 - 上面所收集的细胞群，将这些细胞分成任一个的人CD4 + T细胞自动最大排序（Miltenyi公司，CD4 + T细胞分离试剂盒，人，目录号：130-096-533）或人CD8 + T细胞Automax 排序（Miltenyi ，CD8 + T细胞分离试剂盒，人类，目录号：130-096-495 ）。应遵循制造商的规程。
应当对纯化的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞进行计数，并以10 x 10 6 细胞/ ml的速度冷冻保存，每管2 ml细胞在细胞冷冻培养基中。
为此，将T细胞以300 xg 沉淀10分钟，然后将T细胞重悬于完整的RPMI中，并将浓度调整为20 x 10 6 细胞/ ml。
通过将冷冻培养基缓慢滴加到T细胞中，将T细胞（20 x 10 6 细胞/ ml）与冷冻培养基按体积比例1：1混合，然后迅速将细胞等分到预先标记的冷冻管中，每管中T细胞的最终细胞浓度为10 x 10 6 细胞/ ml。
T 细胞应在-80冷冻过夜°C的冷冻室配有Mrs. Frosty Freezing容器（也可以使用聚苯乙烯泡沫塑料盒）。第二天早晨，应将细胞转移到液氮中。

第3天：T细胞制备或巨噬细胞-T细胞共培养

将小瓶中的冷冻T细胞从液氮中拉出，并在37°C水浴中快速融化细胞。
将解冻的T细胞（在冷冻培养基中约2 ml T细胞）转移至15 ml锥形瓶（Corning CentriStar 管，橙色盖）中，然后加入10 ml完全RPMI培养基。
将细胞以300 xg的速度旋转10分钟。
用10毫升1x DPBS 洗涤细胞3 次。
计数从冷冻管收集的T细胞，然后在建立巨噬细胞-T细胞共培养之前，用CFSE标记T细胞。
T 细胞的CFSE标记。
用1x DPBS 洗涤T细胞3 次，最后一次洗涤后，将T细胞以1x DPBS中的20 x 10 6 细胞/ ml重悬。
准备等体积的0.8 μ中号CFSE在1X DPBS在分开的管中。
Q 将CFSE混合物添加到装有T细胞的试管中，然后CFSE的最终浓度为0.4 Myu M （包含要染色的T细胞的试管）。
用箔纸盖住装有T细胞的试管，并在室温下轻轻摇动将T细胞孵育8分钟。
要终止CFSE染色反应，请添加0.5x体积的无菌FCS，并颠倒混合含有T细胞的试管，并在室温下轻轻摇动孵育5 分钟。
继CFSE淬火工序中，含有CFSE标记的T细胞，在300旋转管×g下为10分钟，洗涤T细胞2 次用15ml 1X DPBS。
在需要的应用中使用之前，请重新计数T细胞。
在完全RPMI培养基中以5 x 10 6 细胞/ ml 重悬T细胞。
现在已经准备好将T细胞添加到共培养孔中。

第三天：巨噬细胞共培养准备

卸下6孔板含有IL-10和IL-6空调CD14 Tasu 细胞从培养箱中，并轻轻摇动板以除去非粘附细胞。卸下并丢弃2毫升培养基含有非贴壁细胞本方案利用活的贴壁细胞，即巨噬细胞。
要收获巨噬细胞，请加入1 ml的含2 mM EDTA的1x DPBS，并在37°C下孵育平板15分钟。
进行上述孵育后，向每个孔中加入2 ml 完全RPMI培养基并收集细胞。确保在限制气泡形成量的同时，用移液器充分混匀每个孔，以便可以收集尽可能多的巨噬细胞。
通过以30 0 xg离心10分钟沉淀沉淀的巨噬细胞，用完全RPMI培养基洗涤细胞3 次，并计数巨噬细胞。
在完整的RPMI培养基中以1 x 10 6 细胞/ ml 重悬巨噬细胞。
所述IL-10加上IL-6空调巨噬细胞是准备被添加到共培养物的孔中。

第三天：建立共培养井

对于IL-10加IL-6条件化的巨噬细胞和CFSE标记的T细胞共培养物，将细胞在平底的96孔板中培养。
在添加巨噬细胞和T细胞之前，在平底96孔板上涂抗CD3（0.5 Myu G / Ml，100 Myu L /孔，在37°C的温度下进行2 H的包被孔，洗孔3 用1x DPBS进行2 次）。
在培养板孔上涂上抗CD3的涂层，用200 Myu L /孔的1X DPBS 清洗孔3 次。
平板孔洗涤后洗净培养物，并通过抽吸除去1X DPBS洗涤体积，从上方添加100 Myu L /孔（相当于1 X 10 5 细胞/孔）的IL-10 Plus IL-6条件化巨噬细胞巨噬细胞。
50 从上方添加Myu L /孔（等于2.5 X 10 5个细胞/孔）的CFSE标签的T细胞。
添加完整RPMI的50 Myu L中包含的适当量的物种和同型对照抗体或抗B7-H4 ，例如，如果井中对照Ab或抗B7-H4的最终浓度为10 Myu G / Ml，在完整的RPMI中，应将Anti Ab Control-B7-H4稀释至40 Myu G / Ml，可以将50 Myu L Control Ab或Anti-B7-H4的工作库存添加到每口井中。
将IL-10加IL-6条件化的巨噬细胞和CFSE标记的T细胞共培养物在5％CO 2 存在下于37 °C 孵育3天。

第六天：分析

从培养箱中取出共培养板，轻轻摇动板以去除非粘附细胞，通过移液器混合孔收集非粘附细胞，将细胞转移到干净的FACS管中。
将通过流式细胞术染色分析Live / CD4 + T细胞和Live / CD8 + T细胞的非贴壁细胞，以评估CFSE稀释法测定的T细胞增殖水平。
将细胞以300 xg的速度离心10分钟，然后将上清液收集到干净的微量离心管中，液滴可以在-80°C下新鲜或冷冻使用，并通过Luminex或ELISA测定分泌的IFN- γ的水平。
用10毫升1x DPBS 洗涤沉淀细胞3 次。
最后一次洗涤后，将细胞与100 Myu L LIVE / DEAD TM可固定的Aqua死细胞染色剂（1：1,000在1X DPBS中）在黑暗中于4°C 孵育20 分钟。
用1x DPBS + 5％FCS 洗涤细胞3 次。
最后一次洗涤后，将细胞与100 Myu L 的Fc受体结合抑制剂多克隆抗体（在1X DPBS Tasu 5 Pasento FCS中1：100稀释）在黑暗中于4°C孵育20分钟。
用1x DPBS + 5％FCS 洗涤细胞3 次。
在最后一次洗涤，扩散将细胞与100 μ 升任一抗CD4 APC或抗CD8 APC的：（1 100稀释分别在1×DPBS + 5％FCS），20分钟，在4℃在黑暗中。
细胞洗涤3 次用1X DPBS和再悬浮在300 MYU 大号中1X DPBS Tasu 5 Pasento FCS，并分析了流式细胞仪。

数据分析

在共培养结束时，细胞培养物调节剂应收集评估分泌cytokine.The培养调制器的电平可能需要之前稀释至1:10的完全RPMI 通过Luminex公司或分析ELISA法水平的分泌据报道有细胞因子（Podojil 等，2020）。
对于T细胞增殖数据，实时/ CD4的流式细胞分析+ T细胞或活/ CD8 + T细胞应被选通到流式细胞术直方图，以评估的稀释CFSE.Examples 的CFSE选通S的cheme呈现在图2中。报道了已经增殖的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的百分比，即稀释的CFSE （Podojil 等，2020）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902542--1422 Joseph Podojil 663800 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. CD4分析+ Ť CFSE的第6天细胞稀释液对于T细胞增殖的评估，收集T细胞，在PBS中洗涤，用LIVE / DEAD染色® 可固定水族死细胞染色，封闭Fc封闭分别用抗CD4（OKT4克隆）或抗CD8（3B5克隆）染色。在流式细胞仪上分析T细胞样品，并使用以下门控方案分析结果数据; Singlets（FSC-H对FSC-A） - >活细胞（SSC-A对生存力染色阴性） - > CD4 + 为三种代表性供体评估分割CD4的百分比cells.Flow流式细胞直方图+ T细胞。本文的报告的结果表示作为增殖的CD4 + 和CD8 + T细胞的平均百分比。

笔记

从血沉棕黄层（50ml）中LifeSource 用于获得本analyses.It 是使用新鲜细胞至关重要的，因为CD14 + 从冷冻保存的PBMC样品中纯化的单核细胞不响应作为稳健。
这些图显示了在每个步骤之后从50 ml血沉棕黄层样品中获得的预期细胞数，即总PBMC分离，CD14 + 单核细胞分类，CD4 + T细胞分类和CD8 + T细胞分类（图1）。该选通为确定活CD4的百分比+ T细胞已经增殖的内共培养B7-H4 + 第6天（共培养的第3天）的巨噬细胞是在图2中呈现。
还测试了使用先前激活的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的能力，以确定是否可以通过存在共培养系统获得比对照Ab治疗更高的抗B7-H4治疗响应率。假设是，由于激活后CD4 + T细胞和CD8 + T细胞上会诱导B7-H4受体，因此这会增加IL-10加IL-6条件化巨噬细胞和CFSE标记的T细胞的百分比/数量可通过添加抗B7-H4进行调节的T细胞共培养物，但数据显示，与冷冻保存的CD4 + 相比，活化的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞实际上的增殖程度更大对于T细胞和CD8 + T细胞，这种增加的激活水平可能掩盖了检测抗B7-H4诱导的活性增加的能力。

菜谱

1x DPBS + 2 mM EDTA（500毫升）
498 ml 1x DPBS，不含Ca 2+ 和Mg 2+

2 ml EDTA（0.5 M，pH 8.0）

1x DPBS + 5％FCS（500毫升）
975 ml 1x DPBS，不含Ca 2+ 和Mg 2+

25毫升FCS

完成的RPMI培养基（1,000毫升）
849 ml不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基

100毫升FCS

10 ml MEM非必需氨基酸溶液

10毫升L-谷氨酰胺200毫米（100x）

10 ml青霉素-链霉素

10 ml丙酮酸钠（含8.5 g / L NaCl的100 mM溶液）

10毫升HEPES（1毫米）

1毫升2-巯基乙醇（1,000x）

细胞冷冻培养基（2x库存）
20％二甲基亚砜

80％FBS

致谢

该协议的开发部分由NIH NS30871资助。

利益争夺

作者相对于该协议没有金融或非金融竞争利益。

伦理

本试验的完成，研究必须有IRB批准的全血从健康donors.For集合笔者给出的数据，棕黄层样品购自LifeSource .The 作者收到棕黄层样品都编码和蒙蔽并且IRB由LifeSource 维护。

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