材料和试剂

黑色标记
平方培养皿100 x 100 x 20 mm（Sardstedt ，目录号：82.9923.422）
圆形培养皿35 x 10毫米（Sarstedt ，目录号：82.1135.500）
圆形培养皿60 x 15毫米（Sarstedt ，目录号：82.1194.500）
Safeseal 管1.5毫升（萨尔斯塔特，目录号：72.706）
Parafilm M（Neolab，Bemis，3-1011，PM-996）
过滤消毒的Millex -GV 0.22 Myuemu （Merck公司，目录号：SLGV033RS）
针30 G½英寸0.3 x 13毫米（BD Microlance ，型号：304000）
种子的拟南芥植株的减数分裂的荧光报告构建作为一个标志减数分裂如必胜鸟线呈现在Prusicki 等人，2019以及记者对减数分裂染色体轴和联会复合体（杨等人，2019年和2020年）
NaClO 在H 2 O中的溶液13％（Applichem GmbH，ITW试剂，目录号：213322.0715）
HCl 37％（VWR Chemicals，目录号：20255.290）
琼脂糖（Sigma，目录号：A9539 ）。
食品级琼脂粉（Applichem GmbH，ITW试剂，目录号：A00917,5000）
MS基础盐混合物（Duchefa Biochemie ，目录号：M0221.0050）
肌肌醇（DUCHEFA Biochemie ，目录号：I0609.0100）
烟酸（Duchefa ，目录号：N0611）
盐酸吡ido 醇（Duchefa ，目录号：P0612）
盐酸硫胺素（Duchefa，目录号：T0614）
甘氨酸（Sigma，目录号：G-7126）
无菌dH 2 O
乙酰胭脂红
异丙醇
蔗糖
酸值
Murashi ke 和Skoog培养基（MS培养基），用于植物发芽（请参见食谱）
用于成像的拟南芥Apex培养基（ACM）（请参阅食谱）

配套设备

移液器10/100/1000（例如Eppendorf Research加上移液器）
生长室MobyLux GroBanks （CLF Plant Climatics ，型号：BrightBoy ）。
真空室
玻璃瓶
无尘工作台
细镊子，厚度：0.02 / 0.01毫米（Dumont，Dumoxel ，目录号：0203-4-PO和0203-5-PO）
显微镜解剖（例如，蔡司，型号小号：Stemi2000和Stemi508）
配有水浸物镜的激光扫描显微镜（例如，蔡司，型号：LSM880）（例如，蔡司，型号：W Plan-Apochromat 40 x /1.0 DIC物镜）

软体类

ZEN 2.3 SP1 FP1黑色（Zeiss）（或显微镜系统的相关成像软件）
MetaMorph 版本7.8.0.0（分子设备）
斐济1.52b版本（Image J，https: //imagej.net/Fiji ）（Schindelin 等人，2012年）
Excel（Microsoft Office）
Python编程语言（版本3.6，Python软件基金会）

程序

制备植物材料
拟南芥种子的表面灭菌种子，带有在减数分裂阶段表达的荧光报告分子（Prusicki 等，2019中有一个例子）。一种有效的种子表面灭菌方法是用氯气：将种子倒入1.5 ml管中，并用黑色记号笔标记试管（由于灭菌过程，其他颜色会变暗）。打开试管盖，将试管放入真空室内的球拍中。 25 ml的7.5％漂白剂溶液（用自来水洗脱）。向搅拌器中加入1 ml的37％HCl，快速关闭反应室并施加真空，整个过程应在化学通风橱中进行。吸入氯气！将种子留在室中3-4小时。处理后即可准备锯切种子。如果您打算将消毒后的种子在试管中存放一段时间，则让试管打开超净工作台下一个最低中30分钟Ensur 气体已完全蒸发。
看到的种子在Murashike 和Skoog（½ MS，配方1）的平方的Petri 培养皿富含选择代理根据用电阻的插入的构建体例如。，添加25的Mg / 大号潮霉素乙以选择用于PRO REC8 ：REC8 ：GFP 为已完成（Prusicki et al。，2019）。不同的是，如果目的蛋白在幼苗中表达，则可以通过基因分型或基于荧光检测进行选择。
将平板在黑暗中于4°C下存放3天，然后将其转移至长日条件下（在22 °C / 18 °C下为16h 白天/ 8h夜间模式）进行发芽。
发芽后10天，将幼苗转移到土壤上，并在长日照条件下生长。
根据生长条件和基因型，植物将在3-4周内准备成像。

成像样品的制备
如会话中所示，准备含0.8％，1％和2％浓度的琼脂糖的Apex培养基（ACM）和1,000倍的维生素储备（配方2）。
通过高压灭菌器对ACM进行灭菌。
蒸压当（或者再热）ACM 0.8 Pasento琼脂糖手暖，添加复合维生素的1X工作浓度（例如，向50ml ACM添加50 Myueru 的1,000倍维生素贮存液），倒成小培养皿（35 x 15毫米），用封口膜密封并储存在4°C.
用倾1％琼脂糖的培养基中的ACM - 尺寸的Petri 在4℃下培养皿（60×15毫米）， -密封用封口膜和存储
将ACM与2％琼脂糖分装在无菌的1.5 ml Eppendorf管中，并将其储存在4°C下。

样品安装
用ACM和1％琼脂糖将花序切开并固定在陪替氏培养皿上（视频1）。

视频1. 步骤C1和C2 ，移除大花蕾并选择花蕾进行图像采集

去除花梗根部的所有开放和细长花，但花蕾呈圆形，大小在0.4-0.6 mm之间，包含早期的肌细胞（视频1）。早期具有肌细胞的花蕾的特征可以根据生长条件和基因型而变化，例如，减数分裂被延迟的突变体通常发生在较大尺寸的花蕾中。因此，建议分析具有乙酰胭脂红或类似染色的数个花蕾，以估计哪些花蕾减数分裂通常，处于发育阶段9的花蕾（Smyth 等人，1990）包含经历减数分裂的雄性减数分裂细胞。
移开所选流动芽的上萼片，注意不要触碰花的内部器官，尤其是花药（Vi deo s 2和3）。

视频2.移除萼片以进入选定花蕾中的两个花药，步骤C3和C4

视频3.在步骤C3和C4 之后关闭准备成像的花蕾

移走剩余的花蕾（视频第2和3节）。如果在移除萼片时主花蕾受到损坏，则可以保留下一个最小/最小的花蕾作为备用花。
花序从电梯制备介质，干净切茎的长度协卡（Ca的）0.5厘米（用钳子或更好用针）（视频4）。这将有利于吸收的养分中，并会不断样本中的好条件一较长时间。

4.定位视频的选择和处理的花蕾成像，小号TEPS C5和C6

将样品转移到装有0.8％琼脂糖的ACM 的小培养皿中，将其锚定在板的中间，并用一滴含2％琼脂糖的ACM覆盖花蕾（视频4和图1A和1B）。
它可追多一个花蕾在一个显微镜会话。在这种情况下，准备一个新的样品如先前解释的（起始神父嗡程序C1 中牛逼他生物协议），并找到所有的花蕾尽可能接近在培养皿的中心（视频4）。

1图，样品的安装和定位在显微镜。A. 样品被放置在中间的皮氏培养皿中并通过一滴2 Pasento琼脂糖，覆盖B. 收上来的样品从面板一。Ç 概述和d 放大将样品放在显微镜镜台上，并将样品置于水浸物镜下方。

图像采集
重要的是要有稳定的采集条件，例如室温，湿度等。因此，建议事先打开共聚焦显微镜，然后将样品放在室内，并用几毫升水覆盖已安装的样品。
大约一小时后，您可以开始图像采集。
将样品放在显微镜载物台上，浸入水的物镜中，并用高压灭菌的水将培养皿充满至顶部（图1C和1D）。建议在采集前用异丙醇彻底清洁物镜以降低风险图像获取过程中细菌的生长。
使用视觉功能（或相关软件工具），确定样品中每个花蕾的位置，并使用ZEN black软件上的多位置功能将其保存。
该套装- 。最多的图像采集需要适应的宗旨实验并在2002的荧光团遵循一个完整的减数分裂在时间的特点- 流逝实验，并确定减数分裂的地标使用必胜鸟行中介绍Prusicki 。等人（2019），下面的一组- 最多可使用：
使用λ488 nm的氩激光激发GFP，使用DPSS 561-10激光（λ561）激发TagRFP 。
在顺序线模式下使用两个轨道进行信号检测，然后使用分束器MBS 488/561。在第一个轨道中，使用GaAsP 检测器记录在498和550 nm之间的λ滤波的GFP信号。在第二个轨道中，使用用GaAsP 检测器观察在578和649 nm之间被λ滤除的TagRFP 信号，可以在第二条光道中添加检测叶绿体自发荧光的第三通道，并过滤680至750 nm之间的λ。添加到两个轨道之一。
将Taghole 设置为1 Airy Unity上的Pinhole以进行TagRFP 检测，使用双向扫描功能并将像素驻留时间设置为2μs 左右的值。
用于图像采集的参数（例如激光强度，增益和偏移）必须适合于各个成像条件，其中尤其取决于激光状态，所使用的报告分子以及蛋白质表达水平。一般情况下，样品的生存能力和高分辨率成像之间的妥协必须找到以获得最佳的图像质量，同时维护样品在良好的条件。在我们的例子中，我们设置1 Pasento和4.5 Pasento之间的氩激光的强度，而将DPSS 561-10激光设置在0.3 ％至1％之间，将收集GFP和TaqRFP 信号的检测器增益设置在700至850之间，并将其设置在650至750之间以检测叶绿体自发荧光。 offset参数为0。
对于KINGBIRD线，在2条线上执行平均；对于其他报告器，可能需要不同的设置。
以10分钟的间隔时间获取多个位置的时间流逝。在每个位置上，执行6到7个平面的Z堆栈，步长为每个时间点最大50μm。获得性的Ca. 30 H（Prusicki 等人，2019）。
建议在每个位置和每个时间点都使用自动对焦功能，尤其是对于较长的采集时间。
如果样品仍在进行减数分裂，但需要短暂中断数据采集（例如，在重新调整焦平面或到达最后一个采集周期的情况下），建议将中断时间调整为匹配间隔时间，因此要开始新的时间- 在10分钟间隔结束时获取圈数。

影像处理
将获取的时间的每个位置- 间隔保存为一个单独的文件，例如在ZEN black软件的情况下：处理 复制 子集。
在斐济打开图像并将其作为图像序列保存在单独的文件夹中（另存为 图像序列 格式TIFF 数字必须足以覆盖所有时间点，例如110个时间点需要3位数字）。
使用MetaMorph 打开图像序列（应用程序 查看多个图像序列文件 打开序列 按照说明进行操作），并为每个时间点选择显示感兴趣的单元格的z-stack层，最后，加载选定的z-stacks 。对于每个波长，并将其保存为TIFF文件此步骤有助于纠正漂移样品中的TH éž - 方向，并连同激活在图像采集期间（见自动对焦功能过程D6 ）允许按照相同的细胞来时间间隔的完整持续时间。
新的文件打开在斐济，结合不同的渠道，调整自己的亮度和对比度，并产生ň RGB版本的文件。
答：如果ñ XY漂移检测的，它可以修正通过使用插件Stackreg 从斐济（插件 Stackreg  刚体）（Thevenaz 等，1998）。
视频5中给出了图像处理后的延时序列示例。

V IDEO 5. 实施例的时间流逝实验结果后图像处理如所解释的在小号TEPS E1-E6

资料分析

使用KINGBIRD 线进行地标识别

数据集注释
给一个花药中的每个可见单元格分配一个ID号。可以使用斐济文本工具（图2）将ID号压在RGB.tiff文件的每一帧上。

2图，数据分析。A. 一帧的收购定时短片描绘花药的拟南芥植物携带必胜鸟记者（微管在品红，REC8染色质是绿色和叶绿体是蓝色的）。每个性母细胞被赋予数A，这将是它的ID在电子表格中乙。B. 示例的电子表格用于分析所描述的段落中的数据分析A2。编号的阶段是指号码表1.每个阶段的颜色编码以方便数据组织。

使用Microsoft Excel准备一个包含7列的表格：帧数，以分钟为单位的时间，细胞形状，微管阵列，核位置，核仁位置和染色质状态（图2）。行数将等于获取的帧数对于单个单元格，第一个成像的帧将被计为时间0（图2）。
在每列中填写与表1和图2中注释的分析的细胞参数状态相对应的数字（f 或其他参考文献，请参阅Prusicki 等，2019），例如，如果在时间0时出现该单元格圆形，则必须在第三栏中填写数字4。在每个时间点都对每个单元格参数进行注释。如果在某个时间点看不到单元格，或者无法识别参数状态，请填写表n为不可见。
所有可见的注释细胞的另一种不同的Excel工作表小号（一张纸上每个细胞），该文件构成数据集进行分析作为解释下一届会议。
../../../../../Downloads/Creative%20commons%20grey1个

说明：logonew

表1 。细胞特征性母细胞作为获得具有必胜鸟报告系统。该表提供了举例说明每个所描述的小区特征显微镜图像（甲Dapted 从图小号3和4 Prusicki 等人，2019 。知识共享署名许可）。该可以在此处访问原始表文件（表1 Excel文件）。

../../../../../Downloads/Creative%20commons%20grey1个

说明：logonew

数据集分析
https://gitlab.com/wurssb/arabidopsis-thaliana--landmark-analysis上提供了一个Python脚本，用于对A部分中创建的带注释的数据集进行分析。该脚本包含从数据中提取地标的过程。并采取以下步骤：

通过过滤掉无效或重复的条目来准备要分析的数据。每个条目（由每个细胞参数的观察状态组成）应具有样品的标识符和样品中的特定细胞。
如果没有按固定的时间间隔对数据进行采样，请重新采样到一个公共间隔，但是在重新采样时要小心，因为从短间隔到大间隔可能会删除数据集中的短暂状态，而相反的间隔可能会导致（大）错误插值状态。
蜂窝状态由所有参数状态的集合来定义，例如，图2中在时间点10的单元11具有蜂窝状态：1-1-2-2-2。蜂窝状态发散最多两个不同的参数状态。被定义为相邻状态（或相邻状态）。在那里，蜂窝状态1-1-2-2-1、1-1-2-3-2和1-1-2-3-3而不是1-1- 3-3-3是1-1-2-2-2的相邻状态。
可以丢弃部分观察到的状态，也可以从相邻状态进行内插，同样，在进行内插时要格外小心，例如，根据观察到的过程设置可以安全内插的最大时间间隔。
计算在每种细胞状态下花费了多少时间。
对于每个观察到的蜂窝状态，请列出相邻状态。
对于每个蜂窝状态，使用在特定状态下花费的时间（t state ）和其邻居所花费的时间（t neighbors ）计算邻居分数：

现在可以为地标分配适当的分界值（Prusicki 等人的示例，2019）。表2给出了邻近分析最终结果的示例（表2 Ë Xcel公司文件），WH ERE的所有细胞状态观察到的一起列出了它们的计数（许多情况下，他们已经观察到的），他们的百分比的外观相对于其他蜂窝美和菲娜LLY它们相邻的得分。来源的列于表2的数据中所发表结果Prusicki 等人。，2019。
要评估分析的鲁棒性，请通过替换数据重新采样并多次重新运行整个分析来引导分析。
可以在单个观测值的水平上进行引导，也可以通过对特定细胞或花药的观测值进行重采样来发现分析中可能存在偏差的不同来源。

2表。例如结果的数据分析，在原表文件仍可被访问这里（表2 Excel文件）。

菜谱

Murashike 和Skoog培养基（MS培养基），用于植物发芽
1升成分浓度

MS基础培养基0.5x 2.2克/升

蔗糖1％10克/升

琼脂1％10克

DH 2 Ø --- 补足至1升容积的

KOH --- ---

将MS基础和蔗糖溶解在800 ml的dH 2 O中
用KOH调节pH值至5.8，使最终体积达到1 L
将琼脂加到溶液中
通过高压灭菌，并在室温下储存直至使用
拟南芥Apex培养基（ACM）用于成像

成分

专心

数量

MS- 中碱

MS基础培养基

0.5倍

2.2克/ 升

蔗糖

1％

10克/ 升

琼脂糖

0.8％-1％-2％

8克至10克至20克

DH 2 Ø

---

高达1 L的体积

酸值

---

---

维生素（1,000倍）

肌醇

10％

5克/ 50毫升

烟酸

0.1％

0.05克/ 50毫升

盐酸吡ido醇

0.1％

0.05克/ 50毫升

盐酸硫胺素

1％

0.5克/ 50毫升

甘氨酸

0.2％

0.1克/ 50毫升

DH 2 Ø

---

50毫升

按照之前的配方中所述准备MS碱，小心地将琼脂糖添加到三种不同浓度（0.8％，1％和2％）而不是琼脂中，并在室温下保存
将维生素溶解在dH 2 O中以获得1,000倍的原液
维生素股票灭菌器采用0.22 Myuemu 过滤，分装他们并储存在-20℃

致谢

这项工作得到了MAP和AS的欧盟Marie-Curie“ COMREC”网络FP7 ITN-606956的支持。此外，还非常感谢汉堡大学对AS的核心资助。本文介绍的协议在Prusicki 等人中提出。。（2019），并且进一步描述于Prusicki 等人（2020）。

竞争利益

Arp Schnittger代表所有作者确认，没有任何作者在这项工作中有相互竞争的财务利益。

参考文献

甲Rmstrong，S 。J.，桑切斯- Moran的，E。和富兰克林，FC（2009）。细胞学分析中拟南芥减数分裂染色体。方法分子生物学杂志558：131-145。
Chelysheva ，LA，Grandont ，L.和Grelon ，M.（2013）。十字花科植物减数分裂蛋白的免疫定位：方法1.方法Mol Biol 990：93-101。
克罗默，L.，若利韦，S.，辛格，DK，贝尔西尔，F.，德温纳，N.，德积，G.，小牧，S.，Prusicki ，MA，Schnittger，A.，Guerois 河和Mercier，R.（2019）。Patronus是一种难以捉摸的植物securin，通过拮抗separase防止染色体分离。Proc Natl Acad Sci USA 116（32）：16018-16027。
Darrier ，B.，阿列塔，M.，Mittmann ，SU，Sourdille ，P.，拉姆齐，L.，沃河和可乐，一（2020年）。继联会复合体形成的形成，小麦和大麦高分辨率显微镜。方法分子生物学2061：207-215。
雷尔，A.，菲利普斯，D.，Vrielynck ，N.，中号ë ZARD ，C.，Grelon ，M。和Christophorou ，N。（2018）。的细胞学方法来研究减数分裂重组和染色体动力学在拟南芥从母细胞直男三维图。Plant J 95（2）：385-396。
Lambing，C.和Heckmann ，S.（2018）。解决植物减数分裂：从模型研究到作物改良。Front Plant Sci 9：829。
Martinez-Garcia，M.和Pradillo ，M.（2017）。拟南芥ARGONAUTEs在减数分裂和DNA修复中的功能分析。方法分子生物学1640：145-158。
Melamed-Bessudo ，C.，Shilo ，S.和Levy，AA（2016）。植物的减数分裂重组和基因组进化。Curr Opin 植物生物学30：82-87。
Mercier销售，R.，Mezard ，C.，Jenczewski ，E.，Macaisne ，N。和Grelon ，M。（2015）。分子生物学减数分裂在植物。 Annu 启植物生物学66：297-327。
Nannas，NJ，Higgins，DM和Dawe，RK（2016）。玉米减数分裂过程中分裂平面的后期不对称性和动态重新定位， J Cell Sci 129（21）：4014-4024。
努涅斯-帕拉，P.，Pradillo ，M和桑托斯，JL（2020）。如何进行准确分析中期I染色体构型在同源多倍体中拟南芥。方法分子生物学2061：25-36。
Pelé ，A.，Rousseau- Gueutin ，M.和Chevre，AM（2018）。多倍体植物的物种形成成功与减数分裂重组的调控密切相关 .Front Plant Sci 9：907。
Prusicki ，MA，Keizer，EM，van Rosmalen ，RP，Komaki，S.，Seifert，F.，Muller，K.，Wijnker ，E.，Fleck，C。和Schnittger，A。（2019）。活细胞成像在减数分裂拟南芥。网上生活8：42834。
Prusicki ，MA，滨村，Y和Schnittger，A.（2020）。实用指南活细胞成像减数分裂在拟南芥中。方法分子生物学2061：3-12。
Schindelin ，J.，阿尔甘-Carreras，I.，雄犬，E.，Kaynig ，V.，Longair ，M.，Pietzsch ，T.，Preibisch ，S.，Rueden酒店，C.，萨尔费尔德，S.，施密德，B 。，Tinevez ，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri ，K.，Tomancak ，P. and Cardona，A.（2012）。斐济：一种用于生物图像分析的开源平台。Nat Methods 9（ 7）：676-682。
Sepsi ，A.，费边，A.，雅格，K.，赫斯洛普-哈里森，JS和Schwarzacher ，T。（2018）。Immunofish :.同时可视化蛋白质和DNA序列提供了一个查看减数分裂进程在核的牧草前植物科学9：1193。
Sheehan，MJ和Pawlowski，WP（2009）。玉米减数分裂前期I中快速染色体运动的实时成像.Proc Natl Acad Sci USA 106（49）：20989-20994。
Sims，J.，Chouaref ，J。和Schlogelhofer ，P。（2020）。拟南芥（Arabidopsis）减数分裂细胞（whomi-fish）上的整装免疫鱼，方法分子生物学（ Mol Biol）2061：59-66。
Smyth，DR，Bowman，JL和Meyerowitz，EM（1990）。拟南芥中的早期花朵发育。植物细胞2（8）：755-767。
Sofroni K.，Takatsuka H.，Yang，C.，Dissmeyer N.，Komaki，S.，Hamamura ，Y.，Böttger ，L.，Umeda M.和Schnittger A.依赖CKDA的CDKD活化; 1控制微管动力学和减数分裂过程中的胞质分裂（未出版）。
Stack，SM，Shearer，LA，Lohmiller ，LD和Anderson，LK（2020）。准备玉米突触复合物的扩散以及顺序免疫荧光和荧光原位杂交。方法分子生物学2061：79-115。
Theve 纳兹，P.，Ruttimann ，UE和UNSER，M.（1998）。甲金字塔方式至次像素登记基于强度。 IEEE反式图像处理7（1）：27-41。
Valuchova ，S.，Mikulkova ，P.，Pecinkova ，J.，Klimova ，J.，Krumnikl ，M.，Bainar ，P.，Heckmann ，S.，Tomancak ，P.和Riha ，K.（2020）。成像工厂分化在种系拟南芥花通过光片显微镜。网上生活9 ：E52546。
Wang，Y.和Copenhaver，GP（2018）。减数分裂重组：将其在植物中混合 .Annu Rev Plant Biol 69：577-609。
Wijnker ，E. and Schnittger，A.（2013）。植物减数分裂细胞分裂程序的控制。植物繁殖26（3）：143-158。
羊，C.，滨村，Y.，Sofroni ，K.，乙ö WER ，F.，Stolze的，SC，中上，H。和Schnittger，A。（2019）。SWITCH 1 / DYAD是WINGS APART-LIKE拮抗剂在减数分裂中维持姐妹染色单体的凝聚力。Nat Commun 10（1）：1755。
羊，C.，Sofroni ，K.，Wijnker ，E.，滨村，Y.，卡斯滕斯，L.，原岛，H.，Stolze的，SC，Vezon ，D.，Chelysheva ，L.，欧尔班-Nemeth，Z. ，Pochon ，G.，中上，H.，Schlogelhofer ，P.，Grelon ，M。和Schnittger，A. （201 0 ）的拟南芥对Cdk1 / Cdk2的同源物CDKA ; 1个控制染色体植物减数分裂过程中轴线组装。 EMBO J ： e101625。
Yu，HG，Hiatt，EN，Chan，A.，Sweeney，M。和Dawe，RK（1997），玉米的新着丝粒介导的染色体运动， J Cell Biol 139（4）：831-840。