材料和试剂

那么，细胞培养24个孔板（Corning ® ，目录号：3524-SLS）
TC盘100毫米（康宁® ，目录号：430167-SLS）
板6 TC - 井（康宁® ，目录编号：3516-SLS）
50 ml F 爱尔康管
12 - 孔板
NIH3T3细胞：来自瑞士小鼠胚胎组织的成纤维细胞，名称为“ 3T3”，缩写为“ 3天转移，接种3 x 10 5 细胞”
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：从c57黑色小鼠胚胎的尸体中分离
Dulbecco改良的Eagle培养基（500 ml）DMEM HIGH GUCOSE不含谷氨酰胺/ 草酸丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：D5671）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）1片/ 200 ml（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
胰蛋白酶EDTA（1x）（Gibco，目录号：15400-054）
凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：10602400001）
因子XIII（Sigma-Aldrich，目录号：233501-100UG-M）
纤维蛋白原（Sigma-Aldrich，目录号：F3879-100MG）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：234265-100G）
氯化钠（VWR CHEMICALS，目录号：27810.295P）
纤溶酶原（Sigma-Aldrich，目录号：P7999-5UN）
新生儿小牛血清（NCS）（Sigma-Aldrich，目录号：12023C-500ML）
青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781-100ML）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513-100ML）
完整的Dulbecco改良版Eagle培养基（DMEM）（请参阅食谱）
纤维蛋白基质（请参见食谱）

配套设备

烧瓶150 TC Cm的排气（康宁® ，目录号：CLS430825-50EA ）
分析天平（赛多利斯，目录编号：CP124S）
相衬显微镜（蔡司）
培养箱内培养细胞（Thermo Scientific的贺利氏® ）
离心机（MSE Mistral 1000）

软体类

GraphPad Prism 7 （GraphPad，https ://www.graphpad.com/ ）
Excel（Microsoft，https：//www.microsoft.com/en-ca/）
与64位Java 1.8.0 捆绑在一起的ImageJ （NIH，https: //imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

维护中细胞系
Progate 细胞补充有0.1 Pasento青霉素/链霉素（10,000单位/毫升），2mM谷氨酰胺和10 Pasento新生小牛血清（NCS）在生长培养基中包含的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）。
当达到约70-90％汇合时使细胞传代。
要传代细胞，请去除生长培养基，并添加5 ml无菌预热磷酸盐缓冲液（PBS），以轻轻洗涤细胞以除去剩余的生长培养基。
注意：剩余的培养基会降低胰蛋白酶的效率。

T中的删除他PBS和外接5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液中。孵育于37细胞5分钟℃。
剧烈搅拌细胞，然后在显微镜下分析细胞，以确保细胞完全脱离。
加入5 ml含有NCS的生长培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA溶液。
通过在室温下以80 xg离心3分钟收集细胞。
除去生长培养基和胰蛋白酶-EDTA溶液。将细胞沉淀重新悬浮在5 ml新鲜生长培养基中。
完全重悬后，将1 ml细胞添加到无菌瓶，100 mm皿或6孔板的新鲜生长培养基中。
将细胞在37°C，95％湿度，5％CO 2 和环境O 2 的气氛中孵育，直到需要或汇合为止。

纤维蛋白基质的制备
在没有指示剂的情况下，将每毫升DMEM培养基中的0.1 U / ml凝血酶加入2.5 ml XIII因子XIII，2 mg纤维蛋白原，2 mg柠檬酸钠，0.8 mg NaCl和3μg纤溶酶原的混合物的50 ml F alcon管中（Lansink 等。，1998）。
300添加MYU 大号到每口井的12混合物- 。孔板让混合物在室温下凝结。

细胞接种和测量
加入0.5 ml DMEM，补充有10％NCS和1％青霉素/链霉素。
纤维蛋白走出称矩阵随着12 - 孔板中添加和播种细胞前。
细胞在种子1 X 10 5 每孔的12 - 孔板含纤维蛋白矩阵，以补充10 Pasento NCS，2 MM谷氨酰胺和1个Pasento青霉素/链霉素获得汇合单层在DMEM（无显示）。
在与上述相同的环境下将平板孵育8-12天。
每2-3天将测试化合物与新鲜培养基一起添加。
收集培养基，每2至3天更换一次新培养基以及新的测试化合物。
相差显微镜用于分析侵入细胞在三维纤维蛋白基质，以10 X 放大图像纤维蛋白凝胶和裂解区。
该纤维蛋白降解吸上清，称出剩余的凝胶，具有12 - 孔板用分析天平。
凝胶重量的减少与纤维蛋白降解的增加有关。

资料分析

使用相差显微镜分析细胞侵入3D纤维蛋白基质的过程。
为了定量纤维蛋白降解，吸出上清液，称重前移出细胞，然后用分析天平称重剩余的凝胶，降低凝胶重量就意味着纤维蛋白凝胶降解增加。
值表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用Student t 检验确定组间的统计显着性。如果P <0.05，则认为值显着。
一组图像和统计分析：

˚F Igure 1. 表达P75NTR调控对纤溶在NIH3T3成纤维细胞，是PDE4相关的。NIH3T3细胞及NIH3T3 P75NTR稳定细胞接种到3维纤维蛋白凝胶，并温育在37 ℃下9天。细胞不处理或受到长期治疗与PDE4特异性Inhib所Itor，咯利普兰（10 MYU中号）8天。阿是10 X 放大倍数图像纤维蛋白凝胶和裂解区。乙是定量降解计算和称重后9天的三维纤维蛋白凝胶中的。显示的所有数据均为代表性均值数据 ±标准偏差三个独立的实验。

注意事项

阴性对照和阳性对照条件应考虑红色，具有血纤蛋白基质但无细胞的孔，或含有细胞但无血纤蛋白基质的孔，并在阴性对照的相同处理下进行处理；血纤蛋白基质+细胞+血纤蛋白原降解。文献中已验证的化合物或已知纤维化的纤维蛋白基质+病变血管细胞作为阳性对照。

菜谱

完整的Dulbecco改良版Eagle培养基（DMEM）
10％新生小牛血清（NCS）

％青霉素0.1 /链霉素（10 ，000 U / ml）的

500 ml DMEM中的2 mM谷氨酰胺

储存在4 °C

纤维蛋白基质
0.1 U / ml凝血酶

2.5 U因子XIII

2毫克纤维蛋白原

2毫克柠檬酸钠

0.8毫克氯化钠

每毫升完整的DMEM生长培养基中含有3 µg纤溶酶原

致谢

家悦玲是资助通过的中国奖学金委员会。我们感谢科斯蒂F. Houslay 对于开发这种试验。该协议本文描述的最初描述Houslay 等。（2 019）。

竞争利益

该作者声明那他们有没有冲突中的兴趣与该目录中此文章。

参考文献

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Houslay ，KF，Fertig，BA，基督教，F.，集博，AJ，灵，J.，芬德利，JE，Houslay ，MD和贝利，GS（2019）。磷酸PDE4A5通过MAPKAPK2减弱纤维蛋白降解威盛P75信号。 Ĵ 生物化学166（1）：97-106。
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