材料和试剂

50毫升试管（IWAKI AGC TECHNO GLASS，货号：2345-050）
1.5 ml管（Eppendorf，目录号：0030125215）
60 mm培养皿（Corning，目录号：353002用于分离前的卵泡或Greiner Bio-One，目录号：628979用于分离后的卵泡）
35毫米皿（IWAKI AGC TECHNO GLASS，货号：1000-035）
吸取TE 提示：
1,000-μ升提示物（Thermo Scientific，目录号：H-111-R 100ns的-Q）

10- μ 升提示（格雷纳生物一个，目录号：771251）

1-L过滤器（Corning，目录号：431098）
1升储物瓶（Corning，货号：430518）
50 ml 移液器（一号，目录号：2-4132-06）
在京都大学舞鹤水产研究所或东京大学三崎海洋生物所培养的成年海鞘（Ciona intestinalis Type A）
卵母细胞成熟和排卵的积极因素（例如合成的Ciona 血管加压素（CiVP ）肽（序列：CFFRDCSNMDWYR，二硫键：1-6，Kawada 等人，2008）
卵母细胞成熟和排卵的不利因素，例如，
U0126（Promega，目录号：V1121）

RO-3306（Abcam，产品目录号：ab141491）

MMP-2 / MMP-9抑制剂II（Calbiochem ，目录号444249）

DMSO（Nacalai tesque ，目录号：13407-45）
REI-SEA海洋粉末（REI-SEA IWAKI，目录号：274513）
人造海水（ASW）（请参阅食谱）
1 mM CiVP （请参阅食谱）
10 mM U0126（请参阅食谱）
10 mM Ro-3306（请参阅食谱）
10 mM MMP-2 / MMP-9抑制剂II（请参阅食谱）

设备

1升烧杯（IWAKI AGC TECHNO GLASS，目录号：0988-01-01-66）
水箱（宽75厘米，深45厘米，高45厘米）
水泵（REI-SEA IWAKI，型号：RMD-151，最大流量：19 L / min）
气泵（TECHNO TAKATSUKI，型号：HP-30，最大流量：30 L / min）
便携式移液器控制器（德拉蒙德，目录号：4-040-101-J）
镊子（Rubis ，目录号2-5149-08、2-5149-12 ）
剪刀（一号，目录号：2-539-11）
不锈钢筛（TOKYO SCREEN有限公司，目录号。小号：TS-50-20-39（孔径：180 μ 米）; TS-50-20-41（孔径：150 μ 米）; TS-50- 20-45（孔径：9 0 μ 米）; TS-50-20-47（孔径：63 μ 米）; TS-50-20-50（孔径：38 μ 米）; TS-50-20-53（孔径：20 μ 米），https://www.tokyo-screen.com/.en/）
立体显微镜（蔡司，型号：用于解剖卵巢和分离卵泡的SteREO Discovery V8； Leica Microsystems，型号：配备Leica DFC 310 FX摄像头的Leica M205 FA，用于在孵育前后记录卵泡）
微型载玻片（WATSON Bio Lab，目录号：177-401C）

软件

徕卡Aplication Suite高级荧光（LAS-AF）
斐济软件（http://fiji.sc/ ;Schindelin等。，2012）
Microsoft Excel（Microsoft Corporation）

程序

从卵巢中分离Ciona 卵泡
将成年海鞘（20至60人）放在水箱中，保持恒定的照明，ASW循环（19升/分钟）和气泡（中度水平）在18 °C下放置四到五天。
隔离卵巢如图2 F RO 米6-8海鞘和将其收集到50毫升管ASW。
注意：所有步骤均应在室温（20 °C）下执行。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 子囊摘除卵巢的卵巢。一。成人海员概述。Os ，Oral虹吸管; 如，房虹吸。乙。INCI SE中的透明外衣[ 虚线中（A）] ，用剪刀和打开用钳子外衣。C.用镊子拾起子房，用剪刀隔离子房。D.离体卵巢和其余组织。

洗卵巢三次每次通过倒转试管几次和卵巢的重力下落用45ml ASW的。
用5-6毫升ASW将卵巢收集到正常的60毫米培养皿（Corning）中（图3A）。
切开使用两个镊子下卵巢一个š tereo显微镜（ZEISS，视频1）。
注意：如果不需要IV期（成熟和排卵）的卵泡（图3B-3C），请用镊子轻轻摇动卵巢以将其取出。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-4-05 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ video 1.jpg

视频1. 切开Ciona 卵巢。该玻璃海鞘卵巢小心切开，用两个镊子轻轻摇动。

用5-6毫升新的ASW将卵巢转移到另一个60毫米的皿中。
使用两个镊子在许多部位撕开卵巢，并轻轻摇动卵巢以释放未成熟/排卵前的卵泡。
重复小号TEPS 甲6- 甲7五点- [R六次（图3D-3H），并收集所有的分离的毛囊（图3I）到所述第一筛（见下文，图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. Ciona 卵巢的解剖和卵泡的收集。A.来自海鞘的孤立子房。B.用两个镊子切开卵巢。黑点代表IV期卵泡（虚线）。C.（B）中IV期卵泡的放大图像。DH。小号eries解剖卵巢。我。在I-IV期得到的收集的卵泡。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ Figs jpg \图4.jpg

图4 。ASW中的不锈钢筛系列。该系列筛，以便从最低酮（20-层叠在ASW没有任何气泡μ 米目筛）。通过倒入和抽吸ASW洗涤分级的卵泡，并在每个筛子上收集。

Ciona 卵泡的分离和分离
在带有ASW 的1-L尖嘴中准备一系列不锈钢筛（图4）。
注意：不要在网格之间产生气泡。

传送所有的收集到的毛囊（图3I）到上部筛（图4 ，180 μ 米）。
将50-60 ml ASW轻轻倒入不锈钢筛中，以洗涤卵泡，然后从筛子侧面吸ASW（图4）。
注意：将ASW的表面保持在距网孔约1厘米的高度，以免干燥卵泡。

重复小号TEP 乙3四分或五次，并通过与1000吹打收集从筛到60毫米细胞排斥培养皿（格雷纳生物一个）卵泡μ 升的移液管尖端。
注意：由于排卵前卵泡粘在上面，请勿使用普通的60毫米培养皿（Corning）。

将ASW吸到下部筛网的1-cm高度，然后取下上部筛网。
注：180- μ 米筛主要包括卵巢的碎片。

重复Ste ps B3-B5并收集感兴趣的发育阶段卵泡。
注意：在松原等人的图2A中显示了卵泡的整个发育阶段的代表性图像（包括I-IV期）。（2019）。

分离未成熟/排卵前卵泡使用10-（每个样品约20个卵泡）μ 米移液管的立体显微镜（ZEISS）下尖端（格雷纳生物上）。
注意：未成熟/ P 重新排卵卵泡可以从150-分离μ 米或90- μ 阶段IV-移除样品的米级分，当毛囊被用于成熟和排卵（参见图2B在Matsubara等人，2019。）。

将20个卵泡转移到带有2 ml ASW的新的35毫米培养皿的中心，并记录每个卵泡的位置（图5，左图）。
注意：请勿使用60毫米的抗细胞培养皿（Greiner Bio-One ）。卵泡的运动使得难以区分单个卵泡。

使用立体显微镜（Leica）和LAS-AF软件以最大放大倍率（160 x ）拍摄每个卵泡（图5，右）和微型幻灯片的图像。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ Figs jpg \图5.jpg

图5.记录卵泡的位置以及GVBD和排卵的状态。将分离的卵泡附着在35毫米培养皿上，并记录其位置（左）。在孵育之前和之后拍摄单个卵泡的图像（右）。GVBD- 和/或排卵-FOLL 我克莱斯被标记，并计算比率（左）。

合成CiVP 诱导Ciona 卵母细胞成熟和排卵
分离出大约40个晚期II卵泡（对照组和CiVP 分别为20 个）。
混合15 μ 升合成的CiVP （1mM）的肽或无菌的MilliQ 在1ml ASW的在1.5毫升试管中。
将肽或无菌MilliQ 加入到35毫米的卵泡皿中，并轻轻混合均匀。
在20 °C下孵育卵泡24小时。
使用立体显微镜（Leica）以最大放大倍数（x160）用微型载玻片拍摄卵泡图像，并记录每个卵泡的位置（图5）。
评估每个卵泡的GVBD和/或排卵状态。
注意：GVBD和排卵分别通过生胚囊的失调和卵泡外细胞层的破裂，然后排卵卵泡的释放来评估。

化学物质（例如，MEK抑制剂，U0126）对Ciona 卵母细胞成熟和排卵的抑制作用
隔离大约40个早期III卵泡（对照组和U0126分别为20个）。
注意：分别使用10 mM Ro-3306和10 mM MMP-2 / MMP-9抑制剂II 分离晚期III卵泡以抑制卵母细胞成熟和排卵。

拌3 μ 升U0126的（10毫摩尔）在1毫升的ASW或DMSO在1.5毫升试管中。
将化学药品或DMSO加入35毫米培养皿的卵泡中，并轻轻混合均匀。
在20 °C下孵育卵泡24小时。
拍摄图像卵泡与使用微尺度滑动一个在最大放大倍数（X160）立体声显微镜（Leica），并记录每毛囊（图5）的位置。
评估每个卵泡的GVBD和/或排卵状态。

数据分析

将卵泡和微型载玻片的每个图像导出为JPEG或TIFF文件，并使用Fiji软件将其打开。使用线选择工具，将100μm的微型载玻片刻度设置为距离的参考。用卵形选择工具围绕卵泡，并在孵育前通过卵形长轴的长度测量卵泡的大小（图6A），并将结果导出到Microsoft Excel（图6B）。分析实验组之间的卵泡大小分布（例如，对照与CiVP 通过Student）的吨- 测试并确认没有显著差异（图6B）。将GVBD和/或每个卵泡的排卵注释为大小信息，计算GVBD和排卵率（图6B），并将结果显示为图表（图6C）。重复实验三到六倍，并执行学生的牛逼- 试验Microso位英尺ë 艾克赛尔（松原等，2019）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903023--1346 Honoo Satake 837300 \ Figs jpg \图6.jpg

Figu 重新6 。体外卵母细胞成熟和排卵测定的数据分析。A.每个卵泡的大小是通过测量Ë 斐济软件llipse配合。B.将每个卵泡的GVBD（G）和排卵（O）的信息标注为卵泡的数量和大小。C.计算GVBD和排卵率，并用柱状图表示。

菜谱

ASW（人工海水）
溶解200克REI-SEA海洋粉末在5-L 吨AP水

将比重调整为1.026并过滤除菌

存放在20 °C 的1-L储存瓶中长达1个月

1 毫米CiVP
d issolve在无菌的MilliQ

储存在-20 °C达6个月

10 毫米U0126
溶于DMSO

储存于-20 以℃ 的黑暗长达2周

10 毫米Ro-3306
D 溶于DMSO

储存在-20 °C达6个月

10 mM MMP-2 / MMP-9抑制剂II
溶于DMSO

储存在-20 ℃下进行长达3个月

致谢

我们非常感谢国家生物资源项目（京都大学舞鹤水产研究站或东京大学三崎海洋生物站）提供了海生动物。这项工作得到了日本科学促进会SM（JP16K18581和JP17J10624）和HS（JP16KK07430）的部分资助。

利益争夺

作者宣称不存在利益冲突。

参考文献

Delsuc ，F.，Brinkmann，H.，Chourrout ，D。和Philippe，H。（2006）。被膜而不是头针是脊椎动物的近亲。自然439（7079）：965-968。
Kawada，T.，Sekiguchi，T.，Itoh，Y.，Ogasawara，M.和Satake ，H.（2008）。一种新的血管加压素/催产素超家族肽及其受体的鉴定，该肽来自海鞘Ciona intestinalis。肽29（10）：1672-1678。
S.Matsubara，A.Shiraishi，T.Osugi ，T.Kawada 和H.Satake （2019）。最接近的姐妹脊椎动物群对卵母细胞成熟和排卵的调节。Elife 8：e 49062。
Prodon ，F.，Chenevert ，J。和Sardet ，C。（2006）。在海鞘卵母细胞成熟过程中建立动物-植物极性。Dev Biol 290（2）：297-311。
萨托（N.），罗萨（R.K. ）和西川（T.）（2014）。柠檬酸盐的进化和三门系统。Proc Biol Sci 281（1794）：20141729。
Schindelin ，J.，阿尔甘-Carreras，I.，雄犬，E.，Kaynig ，V.，Longair ，M.，Pietzsch ，T.，Preibisch ，S.，Rueden酒店，C.，萨尔费尔德，S.，施密德，B ，Tinevez ，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri ，K.，Tomancak ，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。Nat Methods 9（7）：676-682。
Silvestre，F.，Cuomo，A.和Tosti ，E.（2009）。离子电流活性和分子调节海鞘（Ciona intestinalis ）卵母细胞的成熟和生长阶段。Mol Reprod Dev 76（11）：1084-1093。
../../../../../Downloads/Creative%20commons%20grey