材料和试剂

1. T75烧瓶

2. PCR管（20 µl；NanoTemper Technologies GmbH，慕尼黑，德国）

3. Thermo ClipTip吸头300体积30-300 µl（Dominique DUTSCHER SAS，目录号：228370）

4. Thermo ClipTip吸头12.5体积0.5-12.5 µl（Dominique DUTSCHER SAS，目录号：228606）

5. Monolith TM NT.115系列，高级毛细管（NanoTemper Technologies GmbH，目录号：MO-K025–200 Count）

6. CHO-K1电池（ATCC ，目录号：CCL-61），-80°C

7. Mix＆Go感受态大肠杆菌细胞（Zymo Research，目录号：T3009）

8. GFP剂量试剂盒（Abnova ，目录号：KA0911），4°C

9. pcDNA3.1质粒（Life Technologies，目录号：V79520），-20°C

10. pcDNA3.1 Hygro 质粒（生命技术，目录号：V870-20），-20°C

11. 质粒hPD-L1-eGFP（GeneCopoeia ，CS-GS402 L-M10 / pReceiver-M10），-20°C

12. 具有hPD-L1-eGFP突变体的质粒（GeneCopoeia ，CS-GS406 L-M10 / pReceiver-M10），20°C

13. Geneticin TM 选择性抗生素（Thermo Fisher Scientific，目录号：10131035）

14. DNA聚合酶（CliniSciences 卡帕高保真热启动预拌），-20℃下

15. PCR纯化凝胶提取试剂盒（Machery -Nagel，目录号：740609.250），RT-qPCR

16. 迷你质粒制备试剂盒（Machery -Nagel，目录号：740588.250）

17. 细胞系的Nucleofector ® 试剂盒T（龙沙，目录号码：VVCA-1002）

18. Halt TM 蛋白酶抑制剂鸡尾酒，不含EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：78439）

19. RIPA裂解和提取缓冲液（赛默飞世尔科技，目录号：89900）

20. 胰蛋白酶-EDTA解决方案（默克，目录号：T4049-100 ML）

21. 完全培养基：Ham's F-12K（Kaighn's ）培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21127）

22. 1％青霉素-链霉素（10,000 U / ml ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）

23. 南美10％胎牛血清（FBS）（Biosera ，目录号：FB-1001）

24. PBS（1x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12559069）

25. PBS-T （1 x）的，磷酸盐缓冲盐水与吐温-20（NanoTemper Technologies GmbH产品，慕尼黑，德国）

26. 重组人PD-L1 / B7-H1（Biotechne ，目录号：156-B7-100）

27. （可选）DMSO

28. （可选）甘油

设备

热科学ClipTip 移液器（ClipTip TM 300微升和ClipTip TM 12 。5 微升）
NanoTemper ® 坝段NT.115蓝色/红色滤光片（NanoTemper 技术有限公司，德国慕尼黑）
的Nucleofector TM 2B设备（龙沙，巴塞尔，瑞士）
离心机（Sigma Labourzentrifugen GmbH，型号：SIGMA 3-16KL）
流式细胞仪（BD FACS Aria）
带有LED照明的倒置实验室显微镜（Leica Microsystems）

软件

NanoTemper ® （MO。控制）（https://nanotempertech.com/monolith-mo-control-software）
NanoTemper ® （MO。AffinityAnalysis （86））（https://nanotempertech.com/monolith-mo-control-software/）

程序

细胞培养
在含1％P / S和10％FBS的Ham's F12营养混合物中培养CHO-K1细胞。
每3天传代细胞。
细胞的传代培养需要它们与支持物分离并分离，这是通过蛋白水解酶胰蛋白酶的作用进行的。必须通过添加完全培养基来停止胰蛋白酶的作用。1.5米的体积升0.25％胰蛋白酶的被引入到该烧瓶中，然后将其放置在一个培养箱中（5分钟，在37 ℃下）。可以通过轻轻摇动盒子来辅助拆卸。然后停止胰蛋白酶的作用。的体积3.5米升补充的完全培养基中加入到烧瓶中。细胞进行仔细吹打上下均匀。根据进行MST实验所需的细胞数，计算出细胞悬液的体积和要引入每个烧瓶的培养基的体积。将烧瓶中然后放置在培养箱中在37 ℃下。每两天，培养基被替换，而细胞中观察到。继代培养速率根据所用细胞系的生长速率进行调整。
在达到稳定期之前立即对细胞进行传代培养/传代，当细胞仍以指数形式生长时，将导致总体细胞活力提高，并产生较少聚集的细胞，这将缩短滞后时间。该过程不必很精确。它涉及一个范围内的估计。细胞应在50％到100％之间汇合，随着在细胞培养中获得更多经验，将更易于估计。如有疑问，以60％至90％融合度传代培养细胞是最好的。

细胞转染
转染用的细胞系的Nucleofector细胞® 淇吨科技计划的U 023和的pcDNA 3.1 湿度计质粒表达PD-1-EGFP。在100 µl Nucleofector溶液中，一百万个CHO-K1细胞应使用2微克质粒（图1 ）。
孵育细胞48小时。
选择单元格（使用适当的选择压力）3周。在我们的案例中，使用了10 µl / ml的Geneticin TM 选择性抗菌剂（Thermo Fisher Scientific ）。
通过流式细胞仪选择强烈表达eGFP 的亚群。

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图1.从GeneCopoeia 购买的质粒的PD-L1序列（CS-GS402L-M10 / pReceiver-M10和CS-GS406L-M10 / pReceiver-M10）。限制性酶位点以红色突出显示。

蛋白质提取
在T75烧瓶中铺板过表达R- eGFP 蛋白的CHO-K1细胞。
当CHO-K1细胞达到80％汇合时，使用带LED照明的倒置实验室显微镜（Leica Microsystems）处理。
用3-5 ml PBS洗涤细胞。
胰蛋白酶化用1.5ml胰蛋白酶的细胞。
用3.5 ml完全培养基停止胰蛋白酶消化。
使用SIGMA 3-16KL（Sigma Labourzentrifugen GmbH）在400 x g 和4°C下将细胞离心5分钟。
除去上清液。
用5 ml PBS洗涤细胞。
在400 x g 和4°C下离心细胞5分钟。
除去PBS。
将细胞重悬于裂解缓冲液中，并与300 µl RIPA缓冲液+ 3 µl Halt TM 蛋白酶抑制剂混合物在4°C下孵育30分钟。
在25,200 x g 和4°C下离心细胞45分钟。
分装上清液。
冷冻样品（80 ℃）FO ř进一步调查。

PD-1结合测定
建议：

应在分析缓冲液中逐步稀释配体。通常，通过将一体积的配体溶液转移到等体积的缓冲液中，混合并重复这些步骤来进行1：1连续稀释。通过这种方式，每个稀释步骤的配体浓度降低了50％（图2 ）。
从未准备小于20 微升的样品。否则，由于蒸发，样品材料在塑料微反应管上的吸附和移液错误而遇到问题的可能性会增加。
从未制备小体积（例如，20 微升在大微反应管）（例如，500 微升或更大）。高的表面积体积比甚至导致行为良好的蛋白质也导致表面吸附。始终使用最小的微型反应管（例如PCR管）。
始终用移液器混合很小的体积。不要涡旋。不要翻转管。
避免任何缓冲液稀释作用。试管1中的缓冲液和试管2-16中的缓冲液必须相同。否则，您将在盐，DMSO，甘油或其他添加剂的浓度中创建一个梯度。这将使MST测量值产生偏差。

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图2 。MST的分步过程。一。如何准备系列稀释范围。乙。如何正确填充毛细管。

数据分析

如何使用Monolith确定目标蛋白质的浓度

用热泳仪通过建立一个具有不同浓度点（从0到100 nM ）的范围来获得荧光素校准曲线。每个浓度都与荧光素荧光量（FI单位）相关。吨的浓度他标记的eGFP 使用以下关系，其相关的荧光素单位对测定蛋白质的eGFP 的荧光，量子产率（φF ），和相应的摩尔消光系数[ ε（λ）] 在给定激发波长：

公式BIOPROTOCOL.jpg

由于通过帽扫描提供了FI单位（GFP），因此可以通过校准曲线确定相应的FI单位（荧光素），从而确定标记的eGFP 蛋白的浓度。

参考结果/支持结果：

MST的K D = 8 µM（种间和跨物种）（Magnez 等人，2017）ITC的
K D = 4 µM（Zhang 等人，2004）
K D = 8 µM（hPD-1至hPD- L1）和SPR测得的Kd = 29 µM（mPD-1至mPD-L1）（Cheng 等，2013）

ñ OTES

PD-1 / PD-L1绑定

MST已研究了PD-1，各种PD-L1物种（图3）及其缺失突变体（图4）之间的结合，可导致紧密的解离常数。该缺失突变体用作阴性对照，并且不诱导预期的结合（图4）。

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图3. PD-1和PD-L1之间的结合相互作用的剂量反应曲线。PD-1-eGFP或PD-L1-eGFP蛋白的浓度保持恒定在35 nM ，而配体浓度则在24 µM至0.7 nM之间变化。所有三个曲线均显示为与配体浓度结合的分数，以显示它们的相似性，而与所研究蛋白质浓度的变化无关。观察到人PD-1 / PD-L1相互作用（棕色）的亲和力最高（棕色），Kd 为7.2 µM ，而鼠类变异（深蓝色）的Kd 为8.5 µM 。跨物种相互作用的亲和力最低，其解离常数为8.7 µM（浅蓝色）。实验在22°C的温度下，在中等MST和LED功率下孵育30分钟。

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图4. PD-1 / hPD-L1-eGFP与突变体之间结合相互作用的剂量反应曲线。hPD-L1-eGFP和hPD-L1-eGFP突变蛋白的浓度保持恒定在35 nM ，而配体浓度从24 µM到0.7 nM不等。突变蛋白（绿色）没有结合，导致曲线平坦，而野生型蛋白（紫色）则如前所述（7.2 µM）保持了结合。

缓冲区依赖性

为了确定分析蛋白质及其配体之间相互作用的最佳配方，研究了几种裂解缓冲液和几种用于热泳期间热成像分析的缓冲液。裂解缓冲液调制次的荧光ë 拉贝导致蛋白质。还加入蛋白酶抑制剂混合物以防止目的蛋白质降解。理想的缓冲液必须在16个毛细管之间提供均匀的荧光，且最大耐受性为平均值的10％。热像仪不应显示表明聚集的存在的特征性颠簸曲线，这阻碍了测量的解释（图5）。

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˚F igure 5.过程为ħ 流使用开始的结合亲和力测量实验NanoTemper ® （MO.Control ）。1）选择绑定亲和力。2）填写有关您感兴趣的目标的信息。3）描述缓冲液和当前使用的毛细管类型。您还可以更改激发波长和/或MST功率。如有必要，该软件将在建议部分中提示您这样做。4）填写有关配体的信息。5）参数汇总在屏幕顶部。6）您可以检查毛细管扫描的结果，以验证是否没有荧光变化。MST跟踪使您可以验证没有发生聚合。最后，如果信噪比足够大以得出结论存在结合，则自动拟合剂量响应曲线。7）计算K D ，并在必要时提出建议以改善结果。

Acknowledg 发言：

这项工作是由支持INSERM ，法国国家科学研究中心，的IrCl（研究所倒拉RECHERCHE河畔乐癌症里尔），西里奇ONCOLille （批准INCaDGOS-INSERM 6041）和“赠款Contrat 德计划行政法院札HAUTS 法国” CPER癌症2014-2019 。我们感谢BiCEL的流式细胞仪核心设施和里尔大学的筛选核心设施。该协议被从先前的工作适于（Magnez 等人，2017）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

参考文献

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