材料和试剂

乙醇湿巾（Livingstone，目录号：LWMS）
抹灰（活石，目录号：ASP23N）
Needles 23G（BD Biosciences，目录号：367288）
BD真空容器一次性使用支架（BD Biosciences，目录号：364815）
BD CPT柠檬酸钠真空容器玻璃细胞制备管（BD Biosence，目录号：362782）
10 微升XL Biotix 过滤嘴（Interpath ，目录号：M00119FC）
100 微升气溶胶防护提示（Interpath ，目录号：24600）
1000 微升气溶胶防护提示（Interpath ，目录号：24800）
Falcon 5 ml圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤网盖，12 x 75 mm（体外技术，目录号：FAL352235）
1.5毫升Eppen 多夫TM 安全锁定微量离心管（Sigma-Aldrich公司，目录号：T9661）
Countess细胞计数室载玻片（Life Technologies，目录号：C10312）
无菌注射器过滤器0.22 µm（Millipore，目录号：SLGVV255F）
1.5 ml和15 ml离心管
PPE（实验室外套，安全眼镜，一次性手套）
MilliQ 水
冰盒和冰
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：1187093）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10100147）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2438）
青霉素-链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
T淋巴细胞CD3（BD Biosciences，目录号：560365 ）
B淋巴细胞CD19（BD Biosciences，目录号：555415 ）
非经典单核细胞CD16（BD Biosciences，目录号：560475 ）
5-（Pentafluorobenzoylamino ）荧光素二-β-D- 吡喃葡萄糖苷（PFB- FDGlu ）（赛默飞世尔科技，产品目录号：P11947）
PE-Cy7小鼠抗人类CD14抗体（BD Biosciences，目录号：557742）
PE-Cy7小鼠IgG2a，k同种型对照（BD Biosciences，目录号：557907）
1 x DPBS（不含Ca 2+ / Mg 2 + ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
1 M HE PES（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（Merck，目录号：E5134）
氢氧化钠（Merck，目录号221465）
台盼蓝0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：T10282）
培养基（500毫升）（请参阅食谱）
0.1 M EDTA溶液（500 ml）（请参阅食谱）
荧光激活细胞分选（FACS ）缓冲液（500 ml）（请参阅食谱）
CBE 50 mM 储备溶液（请参阅食谱）（Sigma-Aldrich，目录号：C5424-5MG）
PFB- FDGlu 37.5 毫米原液（见食谱）

设备

管架至hol 1.5、5、15 ml 试管
二级生物安全柜
微量移液器（P10，P100，P1000）
S1移液器灌装机（Thermo Fisher Scientific，目录号：9521）
带有15毫升锥形管插入件的贺利氏Multifuge X1离心机（Thermo Fisher Scientific）
离心机（Eppendor f，型号：5415 R）
Countess II FL自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific）
电热板电磁搅拌器
磁力搅拌棒
磁力搅拌垫
pH计
4 °C 冰箱
-20 °C 冷冻室
37 °C 5％CO 2 培养箱
涡流
流式细胞仪配备有488nm的激光器和530nm处-FITC过滤器（即，BD LSR Fortessa X-20）
分析用电脑

软件

BD FACSDiva TM 软件（BD Biosciences）
FlowJo 软件（美国俄勒冈州Tree Star）
GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚的GraphPad Software Inc.）

程序

Asepti Ç 技术
使用适当的PPE在II级生物安全柜中进行实验，以保持安全性和无菌性。

人外周血单个核细胞（PBMC）的分离
手臂朝下进行静脉穿刺。将静脉血收集到8毫升的BD Vacutainer细胞制备试管（CPT）中，在采血后保持试管直立。立即离心前，转化管8次再混合所述血液样品。
在室温（21 °C ）下以1800 x g的速度在离心斗式离心机中离心20分钟，加速和减速设置为9。
用无菌玻璃移液管收集PBMC层（在血浆下方为发白层）并转移至15 ml管。更具体的从CPT管收集PBMC层细节和图像请参阅下面的生物-p rotocol p ublication https://bio-protocol.org/e2103（Puleo 等人，2017）。
添加房间temperatur Ë 1X DP BS在300带来体积至15ml，并转化管5倍，然后离心15分钟X 克在室温下。
吸出上清液，然后将沉淀重悬于10 ml加热过的（37 °C ）培养基中以进行细胞计数。
用台盼蓝将PBMC悬浮液1：1稀释，将混合物转移到细胞计数室玻片上，并使用自动细胞计数器对PBMC进行计数。
确定所需的体积以获得1 x 10 6个单元。
注意：细胞制备试管应在采血后2小时内离心，因为如果放血时间更长，GCase 活性会下降。

将PBMC分配到Eppendorf管中
加1×10个6 PBMC的每Eppendorf管，具有总共三个Eppendorf管为每个主题的，如图Ť 能够1.一种管接收CBE（管1）和一个管接收d MSO（管2），每个的这些之后，添加PFB-FDGlu 底物。第三管是同种型对照。

表1. PBMC在Eppendorf管中的分布

管

CBE

二甲基亚砜

PFB- FDGlu

1个

+

--

+

2

--

+

+

3

--

--

--

将CBE或DMSO添加到合适的试管中
在室温下将试管以300 x g 离心5分钟，倒出上清液。
轻轻重悬细胞于96 微升培养基。
将2μl 的50 mM CBE储备溶液添加到试管1中，以达到1 mM的最终浓度，然后将2μl 的DMSO 添加到试管2中。
涡旋管轻轻混合。
在5％CO 2 和37 °C下孵育60分钟。

将PFB-FDGlu 底物添加到合适的试管中
在60分钟温育后，加入2 微升的37.5 毫PFB- FDGlu 原液进入管1和2，以实现0.75的终浓度毫米。
涡旋管轻轻混合。
在5％CO 2 和37 °C下孵育30分钟。
注意：如果要使该协议适用于PBMC以外的其他细胞类型，建议执行时程实验以确保测定保持在线性范围内。

反应终止
要终止反应，请加入1 ml冰冷的FACS缓冲液。
通过在4 °C下以300 x g 离心5分钟沉淀沉淀细胞，并倾析上清液。

CD14阳性单核细胞染色
将细胞重悬在95 微升冰冷的缓冲液流动，并添加5 微升的抗CD14抗体的进入管1和2。
如果使用BD，则将5μl 同型对照抗体添加到试管3中。对于其他品牌的同型对照，请确保以与BD抗CD14抗体相同的浓度使用。
涡旋管轻轻混合。
避光放置于4 °C 孵育20分钟。
向试管中加入1 ml FACS缓冲液，在4 °C下以3 00 x g 离心5分钟，并弃去上清液。
将细胞重悬在350 微升FACS缓冲液。
将每个细胞悬液通过细胞滤网盖放入与流式细胞仪兼容的5 ml聚丙烯管中。
将试管在4 °C下避光保存，直到流式细胞仪数据采集为止。
注意：可以包括针对淋巴细胞或单核细胞群体的其他表面标记抗体。我们已成功使用的抗体是T淋巴细胞CD3，B淋巴细胞CD19 和非经典单核细胞CD16。然而，固定细胞并进行细胞内染色不利于PFB-FDGlu 信号，因此不建议使用。

数据采集
使用FACSDiva 或等效的细胞仪和软件在BD LSR Fortessa X-20细胞分析仪上采集数据，每管最少收集50,000个事件。
从FACSDiva 软件导出FCS文件。

数据分析

一个门控策略

使用FlowJo 软件分析FCS文件。为了保持客观性，请使用管3（同型对照管）创建以下所述的门，然后通过选择门系列并将其拖到“组”选项卡下的“所有样品”选项卡上，将门应用于管1和2。
首先，针对前向散射（FSC：图1A），然后针对侧面散射（SSC：图1B）绘制高度与面积的关系，以进行双峰和碎片排除，以确保分析中仅包括单个单元格。分别标记这些“单一FSC”和“单一SSC”。
使用FSC（大小）和SSC（粒度）参数来控制单核细胞群（图1C），并标记此“单核细胞”。
接下来，针对SSC-A绘制CD14-PE-Cy7荧光图，并选择CD14阳性群体（图1D），从中可以测量GCase 活性。同种型阴性对照管可用于鉴定和消除抗体的非特异性结合，因为同种型对照信号之上的任何信号均可解释为真正的CD14阳性荧光。将CD14阳性群体标记为“ CD14 + 单核细胞”。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902944--1349 Nicolas Dzamko 706808 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.代表性的双轴流式细胞仪图描述了用于评估活单核细胞中GCase 活性的门控策略。使用BD LSR Fortessa 细胞分析仪获得事件。第一，二，单峰门是毫安日，使用FSC（甲）和SSC（乙），随后门控的PBMC（Ç ），然后CD14 + 单核细胞（d ）。然后，对单核细胞群体中PFB-FDGlu 代谢产生的中值荧光强度进行定量（E ）。

B 计算GCase 活性

将GCase 活性表示为指标，方法是将未CBE处理的细胞的中值荧光强度除以CBE处理的细胞的中值荧光强度。要查找每个试管中PFB - FDGlu 代谢产生的中值荧光强度，请右键单击试管名称下的“ CD14 + 单核细胞”选项卡，单击“添加统计”，然后同时选择“中位数”和“ FL1- A”（或用于检测PFB-FDGlu 荧光的等效通道）。单击“添加”，一个显示PFB-FDGlu 代谢中值荧光强度的标签将出现在“ CD14 + 单核细胞”标签下。

C 统计分析

使用GraphPad Prism软件执行统计分析，以比较感兴趣的组之间的GCase 活性指数。例如，在我们的原始研究文章（Atashrazm 等人，2018）中进行了分析，以比较PD患者（n = 48）和健康对照（n = 44）之间的GCase 活性，该数据可以在图3F中找到。

笔记

该测定还可以在已冷冻保存的PBMC上进行。我们建议解冻后约2小时的恢复潜伏期，然后再开始测定。
我们在不同批次的PFB-FDGlu上经历了较大的差异，建议在每个实验中使用一个批次号。
重构后，长时间存储也使PFB-FDGlu 性能下降。我们建议在1周内使用重构的PFB-FDGlu 。

菜谱

培养基（500毫升）
将440 ml RPMI 1640与5 ml青霉素/链霉素100x，5 ml L-谷氨酰胺和50 ml 胎牛血清混合
滤波器sterili ž e和储存在4 ℃下进行长达一个月
0.1 M EDTA溶液（500毫升）
使用电磁搅拌垫加热将18.61 g EDTA与500 ml MilliQ 水合并
用氢氧化钠（NaOH）调节pH值到8.0
在125 °C下高压灭菌25分钟以进行灭菌
在室温下存放几个月
荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（500 ml）
将DPBS（不含Ca 2+ / Mg 2+ ）与1 mM EDTA，25 mM HEPES和5％v / v FBS 合并以产生FACS缓冲液
过滤器消毒的d储存在4 ℃下数月
CBE 50 mM储备溶液
带来一个5 CBE的毫克小瓶至室温，并在无菌条件下与616.9结合微升DMSO，以实现50的储备溶液毫
作为一次性使用的等分试样在-20 °C下存放几个月
PFB- FDGlu 37.5 毫米原液
带来PFB-之一5毫克小瓶FDGlu 至室温，并在无菌条件下与结合
154 微升二甲基亚砜（DMSO），以实现37.5原液毫
作为一次性使用的等分试样在-20 °C下保存不超过一周

致谢

该方案源自已发表的研究（Atashrazm et al。，2018），该研究由迈克尔·J·福克斯基金会（Michael J Fox Foundation）进行帕金森氏病研究，并与Shake it up Australia基金会共同资助。重要的是要注意，该衍生协议本身是根据早期的开创性研究改编而成的，该研究建立了使用PFB-FDGlu 评估GCase 活性的方法（Lorincz 等，1997； van Es 等，1997； Rudensky 等，2003）。。

利益争夺

作者没有宣布任何金融或非金融竞争利益。

伦理

所有人类血样均在知情同意下获得。实验是根据相关准则和法规进行的，并得到了悉尼大学人类研究伦理委员会的批准（＃2016/363）。

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