材料和试剂

塑料平底盒
塑料拉链袋
锤子
厚橡胶手套
试剂玻璃瓶-甲基丙烯酸甲酯会溶解塑料
显微镜载玻片（赫斯特科学目录号：7107）
盖玻片（赫斯特科学目录号：CG12450）
玻璃闪烁瓶（PerkinElmer目录编号：6000097）–甲基丙烯酸甲酯会溶解塑料
砂纸（光滑）CarbiMet S SiC P400（ThermoFisher ，目录号：16080320）
粗砂纸CarbiMet S，60 P60（ThermoFisher ，目录号：16080060）
胰岛素注射器（29 G BD Ultra- fine TM Clifford Hallam，货号：1323684）
1.5 ml 微量离心管（太平洋实验室，Axygen 目录号：MCT175CI）
6 - 周龄的C57BL / 6小鼠（每组10只小鼠）
阳性对照：重组小鼠间接成本ATIN M（OSM）（R＆d系统目录号：495-MO-025），用2％热失活的鼠血清（在自制）
您首选的测试剂/治疗
磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich ，目录号：D8537 ）
异氟烷吸入麻醉（FORTHANE ® ，艾伯维）
乙醇
钙黄绿素（Sigma-Aldrich公司，目录号：C0875-5G）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
氢氧化钠（NaOH）
丙酮
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127-500 g）
甲基丙烯酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：M55909-500 ml）
不稳定的甲基丙烯酸甲酯（dMMA ）
邻苯二甲酸二丁酯（默克，目录号：800919）
粒状钙氯化物的无水（Sigma-Aldrich公司，目录号：C-1016）
硫酸铬（III）（Sigma-Aldrich ，目录号243361）
牛皮肤中的明胶（Sigma-Aldrich ，目录号：G9391）
丁醇（默克，目录号：8222641000）
甲苯（Crown Scientific，目录号：2867322）
Depex 封固剂（Crown Scientific，目录号：360294H）
Tris （Astral Scientific ，目录号：BIO3094T ）
二甲酚橙（Sigma-Aldrich ，目录号：X3500）
二甲苯酚橙染色剂（见配方）

设备

100毫升烧杯
2 L玻璃分液漏斗
通风柜
孵化器
微波炉
研磨机/抛光机（Buehler Phoenix beta，或同等水平）
配备了碳化钨刀片的自动切片机，RM2265 Leica，或等效的切片机
配备了Osteomeasure 图像分析系统（或等效工具）的荧光显微镜，（Osteometrics ，https : //www.osteometrics.com/ ）

软件

骨测量组织形态测量系统（Osteometrics ，https : //www.osteometrics.com/ ）或同等学历
程序

准备用于研究的细胞因子和动物
开始之前先获得机构审查委员会的道德认证
订购小鼠并让它们在实验前2周适应您的设备。我们使用6周龄（适应后）的C57BL / 6小鼠。根据我们原始出版物的数据（Walker 等，2010），我们每个治疗组至少使用6只小鼠来检测颅骨厚度差异10％。

为了标记活跃的骨形成部位，请准备注射用钙黄绿素，如下所示（关于钙黄绿素的注射时间，请参见图1 ）：
的溶液0.01 G钠碳酸氢盐加0.02 克Ç alcein 在10制成毫升0.9％无菌盐水（终浓度2 毫克/毫升）。使用胰岛素注射器（29 G针）腹膜内或皮下注射该溶液，剂量为每10 克体重0.1 毫升（剂量为20 毫克/千克）。钙黄绿素可以以冷冻等分试样形式储存，以备使用时解冻。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902891--1316 Natalie Sims 781881 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 治疗方案示例，显示了钙黄绿素和细胞因子注射的天数以及组织收集（结束）

准备要通过颅盖静脉注射测试的试剂的25 µl等分试样
我们建议将您的试剂分成25微升等分试样（较大和较小的体积尚未经过测试）。例如，我们连续5天以25 µl的体积使用0.2 µg鼠Onostatin M作为我们所有实验的阳性对照，包括2％热灭活的血清作为载体。开始之前，我们为整个实验准备了足够的等分试样，并冷冻了5个等分试样，足够治疗组中的所有小鼠准备每天注射。

注射方案
细胞因子注射
图1显示了注射方案的时间过程。在1〜5天（例如，星期一至星期五），anaesthetise 鼠标2％我soflurane和1升/分钟Ø xygen（或麻醉核准您的机构审查委员会）。使用胰岛素注射器在动物的头骨（耳朵之间）皮下注射25 µl细胞因子（见图2）。皮下注射会在左右顶骨上形成气泡。

钙黄绿素注射液
在第1天和第11天，使用胰岛素注射器通过腹膜内注射，每10 g体重注射0.1 ml （即20 g小鼠将接受0.2 ml）。在第1天，可以在仍然麻醉动物进行颅骨注射的同时进行此操作。

收集组织之前
使足够的多聚甲醛能够固定样品（每个样品约10 ml）。将500 ml PBS 加热至55 °C（使用微波炉最快）。将2 g多聚甲醛溶解在溶液中，并在加热器上保持温暖。在搅拌的同时，添加足够的NaOH以将pH升至8.0；这是溶解多聚甲醛所必需的。使用前冷却至4 °C 。准备要收集的每个动物的标记闪烁瓶。

收集胫骨以进行组织学分析
在第15天，根据您所在机构批准的方法对小鼠进行剔除。解剖出颅盖，使用矢状和lambdoid缝合线作为界标（图2A）。放置在PBS中的4％多聚甲醛的组织24 在4小时℃下。第二天，放倒并处理低聚甲醛溶液，并将样品存储在70％的乙醇中，直到准备将颅盖组织嵌入甲基丙烯酸甲酯中。

制备颅骨SA mples进行组织学分析
当组织已经被固定的，解剖出含有人字缝到矢状缝的中点（在颅盖骨的后半部小号EE图2B）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902891--1316 Natalie Sims 781881 \ Figs jpg \图2.jpg

图2 。注射部位的位置，解剖说明和嵌入式颅骨切面的图像。A. 在显示注射部位的小鼠头部的图像上叠加颅盖结构；B.解剖的颅骨图，显示解剖的切割线。C. 准备好颅骨节段。尽管我们使用C57BL / 6小鼠，但为了清楚起见，我们使用了白色小鼠的图像。

用于将样品包埋在甲基丙烯酸甲酯中的试剂的制备
Destabilizatio 甲基-甲基丙烯酸酯的N（DMMA ）
该步骤对于去除单甲基氢醌是必要的，该单甲基氢醌是MMA中抑制聚合的稳定剂。请注意，所有使用MMA的步骤都必须在通风橱中进行，并且由于MMA会溶解塑料，因此所有步骤都需要使用玻璃小瓶，漏斗和瓶子进行。所有小瓶，漏斗和瓶子都必须干燥，并且在使用MMA之前应先通过粒状氯化钙过滤以除去会破坏包埋过程的水。

通过将0.5 g NaOH 溶解在1 L 的蒸馏水中制成1 L 的0.5％氢氧化钠（NaOH）。
将一个大的分液漏斗放入通风橱中的蒸馏塔中。
将约500毫升MMA倒入大的分液漏斗中。
在分液漏斗中向MMA中添加约300 ml 0.5％NaOH。
剧烈摇晃分液漏斗至少30秒钟，以使NaOH和MMA充分混合。
放置在脱水缸中，并允许各层沉降。
待各层沉降后，并且分液漏斗仍在脱水缸中时，请使用水龙头将下层（NaOH）排入烧杯中。根据您所在机构的协议处理NaOH，将其丢弃（我们将使用大量自来水将其丢弃在水槽中）。
重复小号TEPS C1 d 到C1 克两次; 这将用尽您制成的所有5％NaOH。
然后重复小号TEPS C1D到C1G三次，每次用500毫升蒸馏水的水，而不是将NaOH（水也将沉淀到底层）。
最后，将约100 毫升装满氯化钙的烧杯放入折叠的滤纸中，该滤纸放在re架上的大玻璃漏斗中。在其下方放置一个干净的瓶，以放置不稳定的MMA（d MMA ）。
将dMMA 从分液漏斗通过氯化钙缓慢转移到干净的瓶子中。氯化钙将去除所有痕量的水。
向干净的dMMA中添加少量氯化钙，以吸收过量的水。将dMMA 储存在4°C。
组成分级丙酮
分别溶解至少250毫升的70％丙酮和90％丙酮。

配制浸润液（每个样品至少5 毫升）
在通风橱中工作，将90％dMMA 与10％邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和0.05％过氧化苯甲酰（BPO）混合。例如，对于10个样品，使用63 ml dMMA ，7 ml DBP和0.35 g BPO 大约补足70 ml 。搅拌直至BPO溶解，然后在玻璃漏斗中通过含氯化钙的滤纸过滤以除去所有水。无限期储存在4 °C。

制作包埋溶液（每个样品约20 ml）
将85％的dMMA 与15％的邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和4％的过氧化苯甲酰（BPO）混合。例如，对于10个样品，使用170 ml dMMA ，30 ml DBP和8 g BPO 补足200 ml 。搅拌直至BPO溶解，然后在玻璃漏斗中通过含氯化钙的滤纸过滤以除去所有水。储存在4 °C下最多1周。

为嵌入样本奠定基础。在干净的玻璃闪烁瓶中，加入2.5 ml包埋溶液。为了减少浪费，您可以使用以前使用的渗透解决方案来弥补这一问题。将彼此隔开一定距离的这些艺术品放在37°C的培养箱中直至凝固。

将颅骨样品浸入甲基丙烯酸甲酯中：
注：小号amples应避风亮时不被处理。

通过分级丙酮对样品进行脱水
倾倒所有样品中的70％乙醇，并用70％丙酮代替，在4 °C下储存至少1 h（最多过夜）
从所有样品中取出70％的丙酮，并用90％的丙酮代替，在4 °C下保存至少1小时（最多过夜）。
从所有样品中取出90％的丙酮，并用100％的丙酮代替，在4 °C下保存至少1小时（最多过夜）。
提示关闭从所有样品100％丙酮，并用新鲜的100％更换一个cetone，储存在4 ℃下至少1个小时（最多过夜）
过滤器嵌入解决方案
当样品置于100％丙酮中时，让包埋溶液（步骤C3中制得）在通风橱中达到室温。在室温下在通风橱中工作时，将溶液通过玻璃漏斗中的含氯化钙滤纸过滤，以除去任何水分。

渗透样品
在通风橱中操作，从所有样品中倒出100％丙酮，并用约5 ml包埋溶液替换。嵌入之前，请在4 °C 的黑暗环境中存放至少3晚。

将颅骨样本嵌入甲基丙烯酸甲酯中
设置基准后，可以嵌入颅骨样本。
使样品，包埋溶液和碱液在通风橱中达到室温。
在通风橱中，将15 ml新鲜的包埋溶液放在足以包埋所有颅盖样品的基底上。将其在室温下放置约20-30分钟，以使其变软。
在通风橱中，当底座变软时，将骨骼和样品标签转移到装有底座和包埋溶液的小瓶中。将颅盖放置在靠近小瓶的一侧，然后将样品放在颅盖的上侧向上的底部。用过的渗透溶液可以储存在4 °C下，并为以后的样品打基础（步骤C5）。
将小瓶放入塑料制的平底盒子中，并用水充分，使其达到与小瓶中MMA 相同的水平，以散发产生的热量。确保将小瓶间隔至少5毫米，以便散发热量。在37 °C下放置过夜或直到塑料凝固。
凝固塑料后，将样品放在油炸锅中1小时。
要从样品瓶中取出玻璃瓶，请将每个闪烁瓶放入密封的塑料袋中，并用锤子将玻璃瓶打碎。戴着厚手套以保护手指，从破碎的玻璃小瓶中取出嵌入的塑料骨头。

准备Fol的涂层幻灯片
1. 在500 °C的瓶子中，在60 °C下，将6 g明胶溶解在288 ml dH 2 O中；在微波炉中快速加热水。

2. 配制4 g硫酸铬钾在20 ml dH 2 O中的溶液。

3. 明胶冷却后，加入120 ml 95％乙醇。

4. 然后添加溶解的硫酸铬钾。

5. 要在载玻片固定器/机架中对载玻片进行涂层处理，每个载玻片浸入30秒。

6. 干燥过夜，但如果将其放在盒子中待用则放置2晚（否则，幻灯片会粘在一起）。

准备二甲酚橙站中（见食谱）

切片颅骨样本
在研磨抛光机上，使用P60砂纸向下研磨样品，直到到达要切骨的表面为止。然后用320研磨纸将其弄平。研磨样品的顶部和底部，以便可以将其固定在切片机的样品架中，然后研磨边缘以进行切片（请参见图2 C）。
在切片机上，使用带有70％乙醇的碳化钨刀片使样品漂浮，从矢状缝线的中点截取5-10微米的标准切片并将其放在Fols 涂层载玻片上。将切片放在载玻片上后，使用一滴95％的乙醇使样品更具柔韧性，并沿载玻片轻轻拉伸以除去褶皱。将一小袋装袋塑料放在该部分的顶部，然后将一块干净的干燥显微镜载玻片放在该部分的顶部。将各部分夹在一起（用大的牛头犬夹子），并在37 °C下烘烤过夜。
第二天，从夹具上取下切片，用二甲酚橙染色，脱水，并用DePex 封固剂盖玻片。

颅骨样本染色
虽然可以分析无污点的切片，但是二甲酚橙的污点可以提供良好的对比度，并且更易于观察样品。

两次更换醋酸纤维溶纤剂，分别进行25分钟的去塑作用。
在分级乙醇中重新水合，如下所示：
100％x 3分钟

1 00％x 3分钟

80％x 3分钟

60％x 3分钟

自来水x 5分钟

用二甲酚橙将切片染色3分钟。
用dH 2 O 冲洗。
将样品的两面彻底吸干。
按以下顺序依次通过以下解决方案：
丁醇x 2

1：1丁醇/甲苯x 1

甲苯x 2

带DePex的Coverslip 。
使其干燥，避光。

使用Osteomeasure 或类似的图像分析软件测量颅骨厚度和骨形成率
测量盖玻片p 编组织切片用20倍物镜。测量总颅盖厚度以及颅盖上侧（注射侧）的单面和双面标记表面。不要测量包含矢状缝线的中心800微米。测量矢状缝合线两侧的8-12个视野。
做wnload骨厚度，双标记表面，骨表面，和单标记表面，并计算矿化沉积速率和颅骨厚度。由于通常整个表面都覆盖有双标签，因此我们通常不计算骨形成率，但是如果您的药剂减少了骨形成，这可能很重要。如果任何样品在整个样品中完全缺乏双钙黄绿素标记，则应将它们从分析中排除，因为这很可能反映出缺乏钙黄绿素注射液。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902891--1316 Natalie Sims 781881 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。颅骨样本的成像与测量。A. 用二甲苯酚橙染色的单个颅盖部分的复合图像，显示了钙黄绿素标记；比例尺= 50 μ米。黄色箭头显示将用于此样本的近似测量区域。B.被测样品的例子，显示了在颅盖部分上表面的双标记的测量。

数据分析

比较颅骨厚度和矿物appos 我和灰率数据组之间通过单因素ANOVA来比较多个治疗组。

[R ecipes

二甲苯酚橙染色
组成0.5 M Tris缓冲液：将6.06 g Tris溶于100 ml蒸馏水
加入1克二甲酚橙
调节pH至9.0
无限期在室温下储存在密封瓶中

致谢

作者感谢圣文森特健康生物资源中心的工作人员提供了出色的动物护理和帮助，并感谢约书亚·约翰逊（Joshua Johnson）帮助开发了分析方法。这项工作得到了NHMRC赠款1120978 和1058625的支持。NAS受NHMRC高级研究奖学金的支持。圣文森特学院感谢维多利亚州政府OIS计划的支持。该协议基于Cornish 等人的初步研究。（1993）。

利益争夺

作者没有金融或非金融竞争利益。

伦理

该规程已由圣文森特健康墨尔本动物伦理委员会AEC＃005/16 批准，有效期为2016 年5月，2019年12月。

参考文献

艾伦（Elan），何（EH），何（Ho），PW（PW），梅泽（A .），Hat 田（Hata），J。，牧岛（Makishima），F。吉莱斯皮（Gillespie）和马萨诸塞州马丁（2003）。小鼠骨髓基质细胞系的分化潜能。J细胞生物化学90（1）：158-169。
Blank，M.和Sims ，NA（2019）。通过阶段特异性EphrinB2敲除显示成骨细胞和骨细胞控制骨矿物质沉积和成熟的细胞过程。Curr Osteoporos Rep 17（5）：270-280 。
Cornish，J.，Callon ，K.，King，A.，Edgar，S。和Reid，IR（1993）。白血病抑制因子对体内骨骼的影响。内分泌学132（3）：1359-1366。
达拉斯，SL和LF Bonewald （2010）。从成骨细胞向骨细胞过渡的动力学。Ann NY Acad Sci 1192：437-443。
Falconi ，D。和Aubin，JE（2007）。LIF至少部分地通过调节HAS2及其产物透明质酸来抑制成骨细胞分化。J Bone Miner Res 22（8）：1289-1300。
约翰逊，RW，布伦南，HJ，弗拉纳斯，C. ，普尔顿，IJ，麦格雷戈，NE，Standal ，T.，Walker，EC，Koh，TT，阮，H.，Walsh，NC，Forwood ，MR，马丁，TJ和Sims，NA（2014）。gp130信号在成骨细胞中的主要功能是维持骨形成和强度，而不是促进破骨细胞形成。J Bone Miner Res 29（6）：1492-1505。
Malaval ，L。和Aubin，JE（2001）。白血病抑制因子对成骨细胞分化的双相作用。细胞与生物化学增刊增刊36：63-70。
Malaval ，L.，Gupta，AK和Aubin，JE（1995）。白血病抑制因子抑制大鼠颅盖细胞培养物中的成骨分化。内分泌学136（4）：1411-1418。
Malaval ，L.，Liu，F.，Vernallis ，AB和Aubin，JE（2005）。GP130 / OSMR是唯一可促进颅盖祖细胞分化为成骨细胞的LIF / IL-6家族受体复合物。细胞生物学杂志204（2）：585-593。
McGregor，NE，Murat，M.，Elango ，J.，Poulton，IJ，Walker，EC，Crimeen -Irwin，B.，Ho，PWM，Gooi ，JH，Martin，TJ和Sims，NA（2019）。IL-6在成骨细胞和成骨细胞中同时显示顺式和反式信号转导，但仅反式信号转导会促进骨形成和破骨细胞生成。生物化学杂志294（19）：7850-7863。
McGregor，NE，Poulton，IJ，Walker，EC，Pompolo ，S.，Quinn，JM，Martin，TJ和Sims，NA（2010）。睫状神经营养因子抑制骨形成并在骨生长和重塑中起性别特异性作用。Calcif Tissue Int 86（3）：261-270。
Metcalf，D。和Gearing，DP（1989）。植入可产生高水平白血病抑制因子的细胞的小鼠中的致命综合征。PROC国家科科学院科学USA 86（15）：5948-5952。
Orriss ，IR，Hajjawi ，MOR，Huesa ，C.，MacRae ，VE和Arnett，TR（2014）。优化小鼠和大鼠的原代成骨细胞在体外形成骨所需的不同条件。国际分子医学杂志34（5）：1201-1208。
Quarles，LD，Yohay ，DA，Lever，LW，Caton，R。和Wenstrup，RJ（1992）。小鼠MC3T3-E1细胞在培养中的不同增殖和分化阶段：成骨细胞发育的体外模型。J Bone Miner Res 7（6）：683-692。
Vrahnas ，C.，Blank，M.，Dite ，TA，Tatarczuch ，L.，Ansari，N.，Crimeen -Irwin，B.，Nguyen，H.，Forwood ，MR，Hu，Y.，Ikegame ，M. Bambery ，KR，Petibois ，C.，Mackie，EJ，Tobin，MJ，Smyth，GK，Oakhill，JS，Martin，TJ和Sims，NA（2019）。EphrinB2缺乏的骨细胞中自噬的增加与继发矿物质的增加和骨骼变脆有关。Nat Commun 10（1）：3436。
沃克（EC），麦格雷戈（McGregor），东北，波顿（Poulton），新泽西州（IJ），庞波洛（S. Pompolo ），艾伦（Allan），EH，奎因（Quinn），杰姆（JM），吉莱斯皮（Gillespie），蒙大拿州（Martin），TJ和西姆斯（NA）（2008）。心肌营养素1是破骨细胞衍生的正常骨重建所需的骨形成刺激。J Bone Miner Res 23（12）：2025-2032。
沃克（EC），麦格雷戈（McGregor），东北（NE），波尔顿（Poulton），新泽西州（IJ），索拉诺（Solano），米。Sims，NA（2010）。当通过小鼠中的白血病抑制因子受体进行信号传导时，制抑素M可以独立于吸收而促进骨形成。J临床投资120（2）：582-592。
沃克，EC，张庭，K.，麦格雷戈，NE，波尔顿，I.Ĵ 。，马丁，TJ和西姆斯，N.甲。皮质骨固结需要通过SOCS3 通过gp130 / STAT3 信号在骨细胞中局部抑制皮质破骨细胞。（未发布）