材料和试剂

移液器技巧
1.5 ml反应管
50 ml锥形离心管（Starlab ，目录号：E1450-0200）
15 ml锥形离心管（Starlab ，目录号：E1415-0200）
薄纸（Tork ，目录号290163）
5 ml血清移液器（Starlab ，目录号：E4860-0005）
10 ml血清移液器（Starlab ，目录号：E4860-0010）
5 ml圆底FACS管，例如Falcon TM 圆底聚苯乙烯管（Thermo Fisher Scientific，Falcon TM ，目录号：352054）
6- 瓦特ELL CytoOne ® 板，组织培养物处理的（STARLAB ，目录号码：CC7682-7506）
24- 瓦特ELL CytoOne ® 板，组织培养物处理的（STARLAB ，目录号码：CC7682-7524）
10厘米轮CytoOne ® 盘子，组织培养物处理的（STARLAB ，目录号CC7682-3394）
T-150 CytoOne ® 烧瓶中，组织培养物处理过的，通风（STARLAB ，目录号码：CC7682-4815）
热科学TM Sterilin TM 100 毫米方培养皿（赛默飞世尔科技，热科学TM ，目录号：11349273）
天然橡胶刮板（Deutsch＆Neumann，目录号：2260001）
速效流TM 无菌一次性过滤器单元与硝酸纤维素膜：0.2 微米孔径（热科学TM ，的Nalgene TM ，目录号：10261741）
来自C57BL / 6J小鼠的原代骨髓巨噬细胞（BMDM）：有关BMDM培养的一般信息，请参阅Bourgeois 等，20 09
L929细胞系（ATCC，目录号：CCL-1）
纯化的抗小鼠CD16 / 32抗体（BioLegend公司，目录号：101302）
FITC抗小鼠/人类CD11b抗体（BioLegend ，目录号：101205）
PE抗小鼠F4 / 80抗体（BioLegend公司，目录号：123110）
超纯优质水，适用于痕量金属分析（Sigma-Aldrich，目录号：14211）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11584486）
胎儿小牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich公司，目录号：F7524）
青霉素/链霉素（西格玛奥德里奇，目录号：P4333）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含Ca 2+ 和Mg 2+ ，液体（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
FeCl 2 ∙4H 2 O（Sigma-Aldrich ，目录号：220299）
8-羟基喹啉（Sigma-Aldrich ，目录号：H6878）
钙黄绿素-AM（BioLegend公司，目录号：425201）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2438 ）
胰蛋白酶溶液10x（Sigma-Aldrich，目录号：59427C）
EDTA二钠二水合物盐（AppliChem，目录号：131669.1211）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
完整的DMEM（请参阅食谱）
L929条件培养基（请参阅食谱）
BMDM介质（请参阅食谱）
的储备溶液制备钙黄绿素-AM，的FeCl 2 和8-羟基喹啉（见配方）
钙黄绿素-AM染色溶液（见食谱）
FeHQ 解决方案（请参阅食谱）
胰蛋白酶溶液（请参阅食谱）
FACS缓冲区（请参阅配方）

设备

移液器，例如Pipetman 模型（Gilson）
电动单通道移液器（吉尔森的Pipetman ® 概念100-1 ，200 微升）
组合式轨道线性摇动水浴箱（格兰特仪器公司，型号：OLS200）
适用于细胞培养的层流罩，例如微生物安全柜（Szabo- Scandic ，SafeFAST Premium 212）
CO 2 培养箱（活页夹，型号：CB 170）
自动细胞计数器，例如CASY细胞计数器和分析仪（罗氏，型号：TTC-2KA-2037）
冷冻离心机（海蒂诗，型号：Rotina 38R）
冷藏台式离心机（Peqlab ，PerfectSpin 24R冷藏微量离心机）
流式细胞仪配备有适当的激光器和滤波器，用于检测的钙黄绿素的荧光，例如BD LSRFortessa TM （BD Biosciences）中

软件

BD FACSDiva 软件（BD Biosciences，版本：8.0.1）
FlowJo 软件（FlowJo ，版本：7.6.5）

程序

BMDM收获和准备
为了区分原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDM），在BMDM培养基和10 cm正方形组织培养皿中于37°C，5 ％CO 2下培养鼠骨髓细胞（从一个胫骨和股骨中分离）10天。
注意：有关BMDM的一般培养，请参阅Bourgeois等。（2009）。

从10厘米见方的培养皿收获的BMDM通过用刮轻轻天然橡胶刮板24 在实验之前ħ d 着y培养10 和离心机在300 X 克，20℃6.5分钟。
吸出培养基并将BMDM沉淀重悬于1 ml BMDM培养基中。
通过使用自动细胞计数器准确确定BMDM细胞浓度。
转移2.5×10 5 的BMDM到24孔板中，用300总体积供给微升BMDM平台。
注意：对于每种实验条件，必须准备至少3份未经处理的和FeHQ 处理的BMDM的技术重复样品（总计：最少6 x 24孔/条件）。此外，包括一份未经处理的BMDM复制品作为流式细胞仪分析的未染色对照。

将BMDM 在37°C，5 ％CO 2 下孵育过夜。

BMDM刺激
刺激的BMDM与相应的试剂（例如，所希望的条件下的LPS，细胞因子，细菌或真菌病原体）。
在37°C，5 ％CO 2 下孵育BMDM 。

BMDM染色和流式细胞仪分析准备
在BMDM刺激结束前30分钟，在水浴中将PBS加热至37°C，新鲜制备足够量的FeHQ 溶液，并调整所有必需的材料以用于随后的BMDM染色程序。
紧随BMDM实验结束前，准备黄绿素-AM染色解决方案，并将其存储在黑暗中。
注意：钙黄绿素-AM为在水性缓冲溶液水解高度敏感。因此，为了确保最大的BMDM染色效率，请在此步骤之前尽快并尽可能准确地工作。

通过将24孔板快速倾斜到一叠薄纸上，除去BMDM介质。
洗3次的BMDM用300 μL 预加热的PBS并通过快速倾斜24孔板上的薄棉纸所使用的堆栈除去洗涤溶液中。
注：完全去除含FCS细胞培养基，因为FCS残差改变黄绿素-AM染色的BMDM的。始终将用过的纸巾叠丢入相应的安全废物中。

添加300 微升钙黄绿素-AM染色溶液/孔与机动单通道移液器和孵化的BMDM在37℃，5 ％CO 2 15分钟。
除去钙黄绿素通过快速倾斜24孔板上的薄棉纸新鲜堆-AM染色溶液。
洗3次的BMDM用300 μL 预加热的PBS并通过快速倾斜24孔板上的薄棉纸所使用的堆栈除去洗涤溶液中。
添加300 微升PBS中，以未处理的条件和300的的BMDM 微升FeHQ 解决的的BMDM FeHQ 在治疗过的条件与机动单通道移液器孵育的BMDM 37℃，5 ％CO 2 30分钟。
注意：BMDM在FeHQ 溶液中孵育超过30分钟将对BMDM膜的完整性产生不利影响。因此，随后的BMDM收获和流式细胞仪分析也应尽快进行。

通过将24孔板快速倾斜到新鲜的薄纸叠上，除去溶液。
洗3次的BMDM用300 μL 预温PBS和通过快速倾斜24孔板上的薄棉纸所使用的堆栈除去洗涤溶液中的
使用电动单通道移液器每24孔添加250μl 胰蛋白酶溶液，并将BMDM在37°C，5 ％CO 2 下孵育5分钟。
地点24孔板在冰上，并添加750 微升冰冷却的完全DMEM 中以防止进一步的胰蛋白酶消化到孔中。
分离的BMDM通过上下吹打以1 ，000 微升单通道移液管，在黑暗中的每个技术复制的细胞悬浮液转移到一个分开的1.5ml反应管中并储存在冰上。
收获所有BMDM后，将悬浮液在400 x g ，4°C下离心5分钟。
吸出培养基，重悬沉淀BMDM在300 微升FACS缓冲液，并转移至5ml圆底FACS管。
处理所有BMDM样品，并将FACS管放在黑暗中的冰上。
ANALY ž Ë 在配备有合适的激光器和滤波器用于检测的流式细胞仪BMDM样品钙黄绿素的荧光与激发最大值〜490nm和发射最大值〜510nm的（Sabnis，2010）尽快。

数据分析

使用适当的流式细胞仪分析软件，在FSC-A与SSC-A的二维点图上显示样品，并在BMDM群体上显示门（图3A）。
为了区分双峰，请在FSC-A与FSC-H点图上对单个单元进行门控（图3A）。
通过测量未染色的对照样品，在钙黄绿素直方图上定义未染色和钙黄绿素+ 细胞（图3A）。
ANALY ž Ë 通过记录所有BMDM样品钙黄绿荧光。
确定MFI （钙黄绿素的）（中位数荧光强度）的钙黄绿素+ 的BMDM。
计算QIP如MFI差（钙黄绿素未处理的和之间）FeHQ -处理每每个实验条件下的BMDM：

QIP = MFI （未处理的细胞） - MFI （FeHQ 处理的细胞）

在柱状图中可视化BMDM在不同条件下的QIP，并进行统计分析（图3B）。

图3.感染后在BMDM中的QIP分析。一。QIP 分析的门控策略。在n FSC-A对FSC-H点图上进行双重鉴别后，记录钙黄绿素+ 细胞的MFI （钙黄绿素）。B. 的BMDM感染了一个MOI = 5（病原体：宿主细胞比= 5：1）热灭活的（70℃，10分钟）白色念珠菌（钙）或光滑念珠菌（CG）12小时并随后被分析用于QIP更改。因此，由于在感染刺激下降低的QIP，BMDMs在用假丝酵母刺激的过程中上调了其胞质铁水平。MFI，中值荧光强度（*** P 值<0.001）。

笔记

该FeHQ 溶液应该BMDM孵育之前调整大约30分钟钙黄绿素-AM染色溶液，并应在之间，以确保铁充足的复合物形成混合几次2+ 离子和8-羟基喹啉。
如之前提到的那样，钙黄绿素-AM染色溶液应新鲜直接制备BMDM刺激结束前，并立即用于随后的染色BMDM由于高水解敏感性钙黄绿素在水溶液中-AM。例如，10 在水性缓冲液分钟下降š 的BMDM染色效率的钙黄绿素-AM对大约50 ％。
收获BMDM样品应该是ANALY Ž ED 通过流式细胞术尽快，由于FeHQ 的的BMDM示出在延长的细胞膜完整性的不利影响载荷已加工的样品的存储。
该测定法非常准确，并且可以很好地重复观察到的BMDM中的生物学效应。然而，速效项目的一般振幅可以独立生物实验之间变化，由于QIP是的函数钙黄绿素的荧光，因此，依赖于钙黄绿素的BMDM的-AM染色效率。
为了研究铁对细胞质的吸收，仅应使用溶液处理BMDM，其中含铁化学物质已在超纯，高质量水中以最低的痕量金属浓度（例如，适用于痕量元素分析的等级）稀释。否则，Fe 2+ / Fe 3+ 将在磷酸盐缓冲溶液中形成水不溶性复合物，因此会扭曲BMDM吸收铁。
该方案还可以应用于体外和体内的其他免疫细胞类型。从而，1等分试样X 10 6 从所需细胞类型（例如，非贴壁细胞或体内的细胞群）应被转移到1.5ml反应管中，用200孵育微升钙黄绿素-AM染色溶液分别FeHQ 在37°溶液C在台式热混合器中，无需在黑暗中搅拌。可以减少之间的PBS洗涤步骤。然而，在预实验中，所需的最终钙黄绿素-AM浓度，FeHQ 组成和温育时间为FeHQ 装载应进行详细用于通过滴定每个感兴趣的细胞类型优化。

菜谱

完整的DMEM
向DMEM中添加10 ％热灭活的胎牛血清（hiFCS ）和1x 青霉素/链霉素
在4°C下储存最多一个月
注意：对于热灭活，将融化的FCS在56°C的水浴中孵育30分钟，每10分钟翻转FCS瓶一次。hiFCS 可以等分保存在-20°C下长达6个月。

L929条件培养基

L929条件培养基的制备

注意：以下描述了用于制备L929条件培养基的方案（Bourgeois等，2009）。

在12 ml完整DMEM和10 cm圆形组织培养皿中培养产生M-CSF的L929细胞，直到在37°C，5 ％CO 2 汇合
通过用天然橡胶刮板轻轻刮擦，从一个10厘米圆形组织培养皿中收获L929细胞，并将细胞悬浮液转移到一个装有80 ml完整DMEM的T-150细胞培养瓶中
将L929细胞孵育3天，直到在37°C，5 ％CO 2 汇合时
吸出培养基，每个T-150细胞培养瓶中加入100 ml DMEM
注意：在此步骤中，至关重要的是使用DMEM（不带hiFCS ）而不是完整的DMEM（由hiFCS 补充）。

将L92 9细胞在37°C，5 ％CO 2 下孵育10天
收集上清液，并通过无菌一次性过滤器过滤
将50 ml等分试样在-20°C下存储最多12个月

L929条件培养基的测试

在6孔板中的3 ml完整DMEM中用浓度递增的L929条件培养基（0-20 ％）培养鼠骨髓细胞，并在37°C，5 ％CO 2 下孵育8天
注意：来自先前已测试批次的L929条件培养基（或市售的重组M-CSF）可用作巨噬细胞分化的阳性对照。

通过胰蛋白酶消化收集粘附的BMDM，并通过使用自动细胞计数器确定BMDM的细胞产量
孵育的BMDM用抗CD16 / 32抗体和巨噬细胞特异性细胞表面标记物（例如，细胞CD11b，F4 / 80），以验证巨噬细胞d 通过FACS分析ifferentiation
注意：经由L929骨髓细胞培养BMDM分化-conditioned介质收率〜98 ％的CD11b + F4 / 80 + 巨噬细胞。

从细胞产量和FACS分析推导用于BMDM分化的L929条件培养基的最佳浓度
BMDM介质
加入15 ％L929条件培养基以完成DMEM
在4°C下储存最多一个月
储备液的准备
对于Calcein -AM储备液，将50μg 固体Calcein -AM 溶解在50μl 无水DMSO中以制备1 mM储备液。将等分试样在-20°C的光线下冷冻在琥珀色反应管中长达4个月。避免多次冷冻/解冻
对于FeCl 2 储备液，将FeCl 2 溶解在超纯的优质水中，并在-20°C的温度下冻结1 mM储备液
对于8-羟基喹啉储备液，将8-羟基喹啉溶解在无水DMSO中，通过用PB S 稀释制备200μM 储备液，并将等分试样储存在-20°C
钙黄绿素-AM染色溶液
稀1 微升的1个mM的钙黄绿素-AM库存（FC 1 μM ）的1ml PBS，涡旋并存储在黑暗中的溶液直到使用
立即在新鲜制备的Calcein -AM染色溶液中孵育BMDM，以确保最大的BMDM染色效率
FeHQ 解决方案
5添加微升1 毫的FeCl 2 （FC 。5 μM ）至945 微升PBS和涡流
随后，添加50 微升的200 μM 8 hydroxyqu inoline（FC 10 μM ）和涡流
在进行BMDM处理之前，每10分钟将FeHQ 溶液混合一次，以确保充分形成Fe 2+ 离子和8-羟基喹啉的络合物
胰蛋白酶溶液
添加500 微升10×胰蛋白酶至4.5毫升的PBS和1 00 微升500 毫摩尔EDTA（pH值= 8.0）
注意：对于一般的胰蛋白酶消化，至关重要的是使用不含Ca 2+ 和Mg 2+的PBS。

将胰蛋白酶溶液在37°C的水浴中孵育直至使用
F ACS缓冲区
溶解0. 5克BSA（FC 1 在50ml PBS％）
过滤灭菌并在4°C下将FACS 缓冲液存储最多1个月

致谢

该协议得到了奥地利科学基金项目InnateFun （FWF-I3319-B22）的支持，部分得到了EC-FP7计划向KK的项目FUNGITECT（HEALTH-F3-2013-602125）的支持。我们要感谢Du 等人的研究。（2015年）和Siegert 等人。（2015）建立这种优雅的方法。

利益争夺

作者宣称不存在利益冲突。

参考文献

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