材料和试剂

注意：所有材料和试剂在室温下均稳定。奇异假单胞菌菌株通常以在室温下可行的稳定培养运输。

一次性i 循环回路（Fisher，目录号：22-363-602）
培养皿（VWR，目录号：25384-168）
50 ml锥形管（Fisher，目录号：14-432-22）
1.5 ml微量离心管（Fisher，目录号：05-408-129）
1-10 µl移液器吸头（Fisher，目录号：07-000-854）
20-100 µl移液器吸头（Fisher，目录号：07-000-867）
200-1,000 µl移液器吸头（Fisher，目录号：07-000-350）
一次性撒布机（Fisher，货号：14-665-230）
分光光度比色皿（VWR，目录号：97000-586）
0.22 µm真空过滤器套件（Fisher，目录号：09-761-1）
FACS收集管（Fisher，目录号：50-187-1139）
96孔平底板（Sigma-Aldrich，目录号：M2936-100EA）
变形杆菌KAG107（组成型表达DsRed的BB2000 ）（Gibbs et al。，2008）（可应要求提供）
奇异变形杆菌菌株KAG966（BB2000Δ IDS 组成型表达GFPmut2）（吉布斯等人，2008）（根据要求提供）
胰蛋白（（Fisher，目录号：DF0123-17-3）
酵母提取物（Fisher，目录号：DF0127-17-9）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-500G）
Oxoid CM55琼脂（Fisher，目录号：OXCM0055B）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7893-500ML ）
Bacto -agar（Fisher，目录号：DF0140-01-0）
硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506-500G）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126-100G）
磷酸氢二钠钠（Na 2 HPO 4 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71645-1KG）
磷酸氢钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：1051041000）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：795429-500G）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：320331-500ML）
RNA-Protect溶液（Qiagen，目录号：76526）
LB汤（1 L）（请参阅食谱）
CM55群琼脂（1升）（请参阅食谱）
LSW-琼脂（1 L）（请参阅食谱）
介质（1 L ）
LSW补充混合物（50毫升）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱）

设备

Vortexer （Fisher，目录号：14- 955-163）
热板（VWR，目录号：97042-690）
搅拌棒（VWR，目录号：58947-114）
ģ 小姑娘培养管（VWR，目录号：47729-580）
250毫升杜兰瓶（VWR，目录号：89051-796）
2升Erlenm ë 揭掉烧瓶（VWR，目录号：89090-858）
Milli-Q净水系统（Millipore）
pH计（VWR，目录号：89231-662）
Genesys 10S紫外可见分光光度计（Thermo Fisher，目录号：840-208100）
BD FACSAria II FACS系统（BD Biosciences）
Tecan公司无限200 Pro的板器（Tecan集团有限公司。）

软件

BD FACSDiva 7.0（BD生物科学）
Microsoft Excel 16.0（Microsoft，Inc . ）
Tecan公司的iControl 3.4.2仪（Tecan集团有限公司。）

程序

这个协议描述了如何的两种不同菌株之间建立混合共蜂拥测定奇异变形杆菌和如何恢复每种菌株的细胞从使用fluoresc混合群烯CE 活化细胞分选（FACS）。回收细胞以测量在群合并期间由Ids信号系统诱导的表型变化引起的生长速率变化。我们使用两种奇异毕赤酵母菌株KAG107和KAG966，它们分别具有红色和绿色的荧光标记。该协议可以适用于在其他群体阶段或其他下游应用中恢复小区。在此过程的最后，介绍了如何使用此协议生成用于RNA-Seq文库制备的细胞的示例。

仪器的设置，特别是FACSAria 细胞分选仪和Tecan 读板仪，应在制备实验样品之前预先进行设置。

细菌培养物的接种和生长
日1

使用接种环和无菌技术在LSW-非群琼脂平板上划线培养目的菌株的稳定培养。在37孵育℃下过夜。
用无菌移液器吸头挑选单个菌落，并使用无菌技术在玻璃培养管中接种5 ml LB培养基。摇动在3 7 °C下孵育过夜。
第二天通过在微波炉中将预制琼脂融化并将25毫升等分试样倒入无菌培养皿中，设置CM55群琼脂平板。放在本生灯或层流柜中固化，使其盖子部分覆盖板2小时。固化24小时后，板可在室温下保存。浇注和固化的一致性对于群体行为的可再现性很重要。接种奇异疟原虫后，改变每板琼脂的量或固化时间可能会导致无法预测的群体行为。

日2

使用分光光度计测量过夜培养物的OD 600 （通常，过夜培养物将达到OD 600 3.0-3.5），然后通过在无菌1.5中用新鲜LB培养基稀释过夜培养物的相关体积，制成1 ml OD 600 1.0归一化培养物。ml Eppendorf管。可以将培养物标准化为OD 600 0.1而不是OD 600 1.0；这样可以将步骤A 5中的群集时间延长6个小时左右，而不会影响实验结果。在组织实验时间时，以这种方式更改OD可能会很有用。
对于使用一种以上菌株的实验（例如，共群分析），请按所需比例将部分标准化培养物（至约200 µl的总体积）添加到新鲜的Eppendorf 管中。涡旋混合。
通过吸取1 µl混合标准化细胞培养物到板中心来接种CM55群琼脂板。在37 °C下孵育，直到第一个虫群环完成（包括固结）并出现第二个虫群环（约8小时）。重要的是，在此时间段开始协议中的下一步，以消除由于缺乏群体培养同步性而导致的实验错误。为此，应在第一个蜂群圈出现后每30分钟用肉眼检查一下板。一旦第二群虫环开始从与已完成的第一群虫环相对应的巩固区域中出现，极有可能准备好进行收获。示例图像可以在图1中看到。一旦板达到类似于图1B的状态，板就准备就绪。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ Figs jpg \ Fig 1.jpg

图1.单个P. mirab ilis 群体培养的成群环的图像。A.在CM55琼脂平板上的群体培养已完成单个群体环并开始整合。B.第二个虫群环出现后的虫群文化相同，可见于第一个虫群环外的微弱带。C.完成第二个群体环后，进行相同的群体文化。箭头显示了群体环外边缘的位置。

使用光学显微镜确认第二群环的出现。细长的蜂巢细胞应形成一个密集的密集区域（距离板中心约1 cm）出现的可见筏。通过板的直接成像，相衬，落射荧光，明场或DIC图像的10倍或40倍放大倍数足以区分活动的，细长的成群细胞与较短的固定合并细胞。图2显示了群集细胞和合并细胞的示例相衬和绿色荧光蛋白（GFP）表荧光图像。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2. 巩固细胞（C ）和成群细胞（D ）的相衬（A，B ）和GFP荧光（C，D ）显微图像。以40倍放大率拍摄的图像。以1:10的比例将荧光细胞添加到非荧光群体中，以便可以看到单个细胞。比例尺= 40 µm。

为FACS准备细胞
用一次性移液器吸头刺穿琼脂，从其余实验样品中取出并处理接种物。有必要丢弃此细胞子集，因为它不参与自我识别行为。可以在视频1中看到一个演示。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ video 1.jpg

视频1. 使用移液器吸头从温暖的平板上去除接种物

通过将1-1.5 ml无菌PBS移液到琼脂板上，将剩余的细胞从琼脂板上洗净，并用接种板铺布器轻轻地将其从表面上提起。收集完所有细胞后，将板稍微倾斜以将PBS /细胞混合物集中在一侧，然后将其吸移到在冰上冷却的1.5 ml微量离心管中。
用冰冷的PBS在50 ml锥形管中稀释细胞悬液，直到混合物几乎不混浊（OD 600 0.05），并倾倒2 ml到冷却的FACS收集管中。

FACSAria 设置
在这里，我们描述了对BD FACSAria 上的荧光标记细菌进行分选的设置。我们假设您熟悉FACSAria的操作和C＆ST的预校准，液滴延迟，侧流角和折断。在执行此测定之前，用户应接受有关操作FACSAria的培训。我们建议在生成实验样本进行下游分析之前，先进行一次练习以确定排序设置。

在实验开始前30分钟打开FACSAria 并控制PC。加载FACSDiva 软件。
安装70 PSI高压喷嘴。
在FACSDiva Cytometer 菜单中将样品温度设置为4 °C 。如果分类收集室可以控制温度，请将其也设置为4 °C 。
将贴有标签的FACS收集管插入分类收集室。
将样品安装到FACSAria 样品注入室并加载。
安排FACSDIVA 工作区，使得前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）可以相对于彼此被绘制。
设置分类门以保留大约1,000-50,000的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的颗粒（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ Figs jpg \ Fig 3.jpg

图3. 通过FACSAria 运行的奇异毕赤酵母颗粒的侧向散射（SSC）与正向散射（FSC）图表。标记为P2的区域表示已设置为将单个粒子与双峰分离的分类门。

设置第二个图表，该图表测量红色荧光强度与绿色强度的关系：每种颜色对应于感兴趣的菌株。设置分类门以隔离荧光强度约为10 3 或更高的颗粒（图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ Figs jpg \ Fig 4.jpg

图4.单个P. mirabilis 分选颗粒（图2中的P2子集）的红色荧光蛋白（RFP）强度（PE-德克萨斯州Red-A，Y轴）与GFP强度（FITC-A，X轴）的图表）。设置RFP +和GFP +门分别隔离红色和绿色粒子。

在“排序布局”窗口中，选择收集管的相关门，将“精度”设置为“纯度”，并将“粒子计数”设置为1,000,000。
在“排序布局”窗口中按“排序”，开始分类到收集管中。定期检查管子是否溢出。如果是这样，请从“排序布局”窗口中暂停排序，从“采集仪表板”关闭偏转板，换掉收集管，然后从“排序布局”窗口重新开始排序。
达到分类的颗粒计数后，卸载样品。要清洁FACSAria ，将装有20％漂白剂溶液的试管装入细胞分选器并运行10分钟，然后装入装有Milli-Q水的试管并运行10分钟。
注意：可通过FACS分离RNA-Seq文库制备样品。如果这样做，则应使用1x PBS从群体平板上收获细胞，并分选到装有500 µl RNA-Protect溶液的微量离心管中。我们建议将单个样品的分选时间限制为10分钟，以免因收获和分选导致转录无效。多个FACS运行可以合并为一个样本。然后可以通过标准试剂盒（例如Qiagen RNEasy Mini）分离RNA以用于下游应用。

蜂拥而至后衡量增长恢复
记录每种条件下分类的颗粒数。通常，将分选100,000至1,000,000的颗粒。一个菌株比另一个菌株具有更高的分类颗粒数。
通过将确定体积的分选细胞混合物添加到确定体积的无菌PBS中，将细胞混合物归一化至标准化浓度（通常为100,000个细胞/ ml）。将标准化的细胞混合物放在冰上。
立即出现ÿ排序和归一化后，设置生长复苏测定上平底96 - 孔板中。对于此处描述的Tecan读板器，无需覆盖或密封板。对于每种分选的细胞混合物，将50 µl分选的细胞混合物添加到含有250 µl LB肉汤的孔中。如果有足够量的细胞混合物可用，则在相邻的孔中设置技术复制品。运行含有300 µl LB肉汤的阴性对照孔。仔细注意哪些混合物在哪个孔中。
打开Tecan读板器和控制PC。插入96 - 与样本孔板到板阅读器。确保595 nm吸收率滤光片组在滤光片插槽中。
使用Tecan读板仪测量孔的OD 595 。打开Tecan iControl软件并运行以下程序：
温度37°C

盘子：Costar 96 Flat透明

板的一部分：选择包含实验样品的孔

运动周期：持续时间23 h：50 min：0 s

吸光度测量595 nm，闪烁25次
震动900 s，幅度1 mm，线性模式
振动898 s，幅度1 mm，线性模式
等待（定时器）2 s
每30分钟进行一次OD 595 测量，持续24 h。

Tecan iControl软件将自动导出到打开的Excel电子表格。保存结果文件以供进一步分析。

数据分析

该Tecan公司的iControl 软件输出时间进程文件作为。xlsx 电子表格文件，可以使用大多数统计信息和图形包对其进行分析和可视化。通常，通过绘制每个目标菌株随时间变化的光密度变化，可以很容易地看到生长恢复。Tipping and Gibbs （2019）中的示例图如图5所示; 此处，菌株之间未观察到差异。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902925-1302 Karine Gibbs 813547 \ Figs jpg \ Fig 5.jpg

图5.领土排斥不会导致长期的增长缺陷。对于KAG107和共温菌株KAG966的液体培养，随着时间的推移，在600 nm处的光密度被测量。使用通过FACS从共群菌落中分离的细胞接种液体培养物，其中从群体前沿主动排除了KAG966菌株。经Tipping和Gibbs （2019）许可转载。

可以通过计算每个时间点的Kruskal-Wallis检验来衡量菌株之间差异的统计显着性。我们建议每个实验至少进行三个生物学重复。

笔记

重要的是在收获到PBS 后立即开始FACS，以避免样品之间的差异。同样，在通过FACS分离出足够的细胞后，应立即进行生长恢复的测量。考虑在FACS设备附近培养细菌培养物和群体板，以避免由于运输时间而引起的可变性。其他FACS仪器和酶标仪也可以用于该测定，但是操作方案会有所不同。使用前寻求设备培训。

菜谱

LB汤（1 升）
胰蛋白10 10克

酵母提取物5克

氯化钠5克

Milli-Q H 2 O至1 L

混合在成分一2.0升Erlenm ë 揭掉烧瓶中，与热的热板上搅拌直到所有成分溶解，使250毫升等分试样和高压釜中。食谱改编自Belas 等。（1991）。

CM55群琼脂（1 升）
Oxoid公司CM005540克

Milli-Q H 2 O至1 L

混合在成分一2.0升Erlenme 揭掉烧瓶中，与热的热板上搅拌直到所有成分溶解，使250毫升等分试样和高压釜中。食谱改编自Belas 等。（1991）。注意：CM55琼脂对反复加热很敏感：一旦融化，应使用等分试样倒入板中，其余部分则丢弃。

LSW-琼脂（1 L ）
该介质具有两个成分：主介质，以及在倒入板之前立即添加的补充混合物。每升培养基添加12 ml 顺铂混合物。

介质（1 L ）

胰蛋白10 10克

酵母提取物5克

甘油（超纯）5毫升

氯化钠0.4克

细菌琼脂20克

Milli-Q H 2 O至1 L

混合成分i Ñ 一个2.0升Erlenm ë 揭掉烧瓶中，用在热板上搅拌直到所有成分溶解热，使250毫升aliqu OTS和高压釜中。食谱改编自Belas 等。（1991）。

LSW补充混合物（50毫升）

1 M MgSO 4 溶液2 ml

甘油4毫升

1％（w / v）烟酸溶液2 ml

Milli-Q水至50毫升

将成分添加到50 ml锥形管中，摇晃或涡旋混合，然后通过0.22 µm过滤器进入新鲜的无菌锥形管中进行灭菌。

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将其作为10倍的浓缩库存进行存储很方便。用无菌Milli-Q水稀释至工作浓度。

10x PBS股票

氯化钠80克

氯化钾2克

磷酸氢二钠钠（Na 2 HPO 4 · 2H 2 O）14.4 g

磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）2.4克

Milli-Q H 2 O至1 L

混合在成分一2.0升Erlenm ë 揭掉烧瓶中，使在杜兰瓶和高压釜250毫升等分试样。
使用前立即稀释至工作浓度。10x储备液的pH值应为6.8，工作1x储备液的pH值应升至7.4。
用pH计或石蕊试纸测量，必要时用浓盐酸（HCl）或10 M氢氧化钠溶液（NaOH）调节。食谱改编自Sambrook 等。（1989）。

致谢

我们感谢哈佛大学的鲍尔核心设施，特别是克莱尔· 雷顿（Claire Reardon）和扎卡里· 尼齐欧莱克（Zachary Nizioleck ）在FACS方面的帮助，以及雅各布· 奥斯特曼的蜂群板图像。这项工作是由大卫和露西尔·帕卡德基金会，乔治·默克基金会和哈佛大学资助的。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考文献

Alteri ，CJ和Mobley，HLT（2016）。多功能VI型分泌系统。微生物学光谱4（2）：10.1128 / microbiolspec.VMBF-0026-2015。
Aoki，SK，Webb，JS，Braaten，BA和Low，DA（2009）。接触依赖性生长抑制作用导致大肠杆菌中可逆的代谢下调。细菌学杂志191（6）：1777-1786。
Basler，M.，Ho，Brian T.和Mekalanos ，John J.（2013年）。针锋相对：细菌细胞间相互作用期间的VI型分泌系统反击。细胞152（4）：884-894。
Belas ，R.，Erskine，D。和Flaherty，D。（1991）。变形杆菌中的转座子诱变。细菌学杂志173（19）：6289-6293。
Brunet，Yannick R.，Espinosa，L.，Harchouni ，S.，Mignot ，T。和Cascales ，E。（2013）。成像VI型分泌介导的细菌杀伤。细胞报告3（1）：36-41。
加西亚（EC），佩罗（Perault），人工智能，马拉特（SA）和宾夕法尼亚州科特（2016）。通过伯克霍尔德菌接触依赖性生长抑制系统蛋白进行细菌间信号传导。PROC国家科科学院科学美国阿113（29）：8296-8301。
Gibbs，KA，Urbanowski ，ML和Greenberg，EP（2008）。细菌中自我认同和社会认同的遗传决定因素。科学321（5886）：256-259。
Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis ，T。（1989）。分子克隆：实验室手册。纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社。
史密斯，JM（1964）。组选择和亲属选择。自然201（4924）：1145-1147。
Rauprich ，O.，松下，M.，Weijer ，CJ，西格特，F.，Esipov拍摄，SE和Shapiro，JA （1996）。奇异变形杆菌的周期性现象蜂群生长。 Ĵ 细菌学 178（22）：6525-6538。
Souza的，DP，奥卡，GU，Alvarez的-Martinez的，CE，比森-Filho的，AW，Dunger ，G.，胡贝卡，L.，卡瓦尔坎特，NS，阿莱格里亚，MC，巴博萨，LRS，萨利纳斯，RK，古佐，CR和Farah，CS（2015年）。通过IV型分泌系统杀死细菌。自然通讯6（1）：6453。
Tipping，MJ和吉布斯，KA（2019）。来自奇异变形杆菌自我识别系统的同伴压力控制着协作群运动的参与。PLOS病原体15（7）：e1007885
Virta ，M.，Lineri ，S.，Kankaanpää ，P.，Karp ，M.，Peltonen ，K.，Nuutila ，J。和Lilius，EM （1998 ）。通过生存力染色和生物发光测定补体介导的细菌杀伤。应用环境微生物学64 （2）：515 - 519。
Wenren，LM，Sullivan，NL，Cardarelli，L.，Septer ，AN和Gibbs，KA（2013）。依赖于VI型依赖的出口，奇异变形杆菌中的两个独立的自我识别途径相互关联。MBio 4（4）。DOI：10.1128 / mBio.00374-13。