材料和试剂

1. 1.5毫升Eppendorf管

2. 培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150239 ）

3. 移液器技巧

4. 6孔组织培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：15213338）

5. 微型盖玻片25 x 50 mm和25 x 25 mm（ VWR，目录号：48382-136和48366-089）

6. PVC密封膜（Phytotechlab ，产品ID：A003）或Parafilm（VWR，目录号：52859-079）

7. 漂白液（克罗林，高露洁棕榄）

8. Tween-20，聚山梨酯（VWR，目录号：97062 ）

9. 3D打印的种子电镀指南（https://www.thingiverse.com/thing:4016917）

10. 的Murashige 和Skoog，MS培养基（DUCHEFA Biochemi ，目录号：M0222）液体介质

11. MES，2-（N- 吗啉代）乙磺酸（Duchefa Biochemi ，目录号：M1503）

12. 蔗糖（Duchefa Biochemi ，目录号：S0809）

13. KOH（VWR，货号：470302）

14. 植物琼脂（Duchefa Biochemi ，目录号：P1001）

15. DMSO（西格玛奥德里奇，目录号：276855）或其他车辆

16. AZD8055（Selleckchem ，目录号：S1555）

17. 浸油（Zeiss，目录号：444960）

18. 用于建立该方案的转基因拟南芥品系发表于Dauphinee 等人。（2019年）

19. Milli-Q（MQ）水

20. 液体0.5x MS介质（请参见食谱）

21. 固体0.5x MS介质（请参阅食谱）

22. 漂白溶液（请参阅食谱）

23. DMSO中的ConA 1 mM 库存（请参阅食谱）

设备

移液管为100-1,000微升和1-10 μ 升
镊子（Dumont，货号：11251-10）
4°C冰箱
拟南芥生长室等/生长室：20-22°C，湿度50-70 ％，1 50 μM的光
共焦激光扫描显微镜（CLSM; Zeiss，LSM 800）

软件

斐济，ImageJ的版本，其中包含一组插件（https://fiji.sc/，对于本研究，我们使用versio ns 1.51s和2.0.0-rc-69 / 1.52i）
AuTToFlux 存储库，其中包含三个ImageJ宏和三个R脚本文件（https://github.com/jonasoh/AuTToFlux/archive/master.zip）：
CalibrateThreshold.ijm
ImageProcessor.ijm
荧光强度
评估校准
Control-vs- Reporter.R
通量与时间
R（https://www.r-project.org，我们使用3.5.2和3.5.1）
RStudio（https://www.rstudio.com/，我们使用的版本为1.1.453和1.2.1186）
Git（https://git-scm.com/downloads，我们使用的是2.24.1版本）
R包：
dply r（https://CRAN.R-project.org/package=dplyr）
ggplot2（https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2）
读取器（https://CRAN.R-project.org/package=readr）

程序

种子灭菌（40分钟）
P 花边CA 。15 μ 升的记者和控制线种子放入1.5毫升Eppendorf管的。通常，目标是在实验中计划的每个治疗和时间点至少具有四到六个生物学重复。
添加CA 。1.5毫升的漂白剂溶液。
培育种子约。30分钟，激动。
在无菌条件下，用移液管吸出漂白剂溶液。
向种子中加入无菌水。混合并用移液器吸出。
用无菌水至少清洗3次以洗去残留的漂白液。
种子可以在无菌水中或按照程序C中所述进行春化处理。

接种种子（40分钟）
用1 ml移液器将单粒种子转移到含有0.5x MS固体培养基的培养皿中。保持CA 。2 - 的相同行中的种子根避免缠绕到5mm之间的距离。保持CA 。行5之间厘米的距离（图? 重新小号2A- 2 B）。建议对此步骤使用接种平板指南（图1，图2A，https： //www.thingiverse.com/thing：4016917）。
用封口膜或密封膜条密封板。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 拟南芥串联标签自噬通量测定。A. 9厘米培养皿的3D打印种子接种指南。B. 拟南芥使用种子电镀导（左半部分），并铺板种子个烯生长与板垂直放置5天（右半部分）。将拟南芥幼苗置于6孔板中进行处理。请注意，根部应轻轻浸没（白色箭头），并且不要在表面上浮动（红色箭头）。D.将苗安装在CLSM的载玻片（左）或盖玻片（右）上。E. 根分化区的大概起点F. 图像0、1和2分别代表报告基因系中分化区液泡的好，坏和丑陋质量扫描。G. 使用CalibrationThreshold.jim 宏在校准过程中生成的真空层掩模。请注意，丑陋的扫描F.可能会导致液泡检测完全或部分失败。H. 在所有分析图像上检测到的液泡总面积（建议的上限阈值为2）与。EvaluateCalibration.R 脚本生成的阈值。I. 车辆的Flux-vs- Time.R 脚本输出，以及使用ggplot2在R中生成的复合处理。比例尺= 1.5厘米（BD）; 50 μm（E，F）。

春化（24-48小时）
在4°C下于黑暗中孵育平板24-48小时。

生长于垂直板秒（5个d AYS ）
将板置于生长条件下（150 μM光照，22°C持续16 h，0 μM光照，20°C持续8 h）。确保板完全垂直，以确保根在培养基顶部生长（图2B）。
在平板上种植幼苗，大约保持10 分钟。5 天后，根长应达到约1 。2厘米

药物治疗（2-24小时）
吸取3 ml 0.5x MS液体到6孔组织培养板的孔中。添加所需浓度的化合物。
使用软镊子，从平板上轻轻地挑出幼苗，然后转移到0.5x MS液体中（每孔不超过20棵幼苗）。
将培养基从孔中轻轻吸移到孔中的幼苗上，以淹没根部（白色箭头，图2C）。
用密封膜或封口膜密封板。
在相同的生长条件下孵育平板所需的时间。

安装样品（1英里）
用移液器吸取一滴大约ca 的培养基。50 μ 升，从在25井毫米X 50毫米的盖玻片。
使用软镊子，从井中轻轻摘下幼苗，然后将其放在培养基滴中，确保根直。避免在转移过程中干燥根部！
在盖玻片上放置多达6个幼苗。
用25 mm x 25 mm的盖玻片覆盖根部（图2D）。
如果需要，可将其浸入物镜，并将样品放在显微镜载物台上。

设置共聚焦激光显微镜的扫描参数（30分钟，仅需一次）
为了估计最佳的扫描设置范围，建议使用三种对照处理（500 nM AZD 8055持续4 h，500 nM ConA 持续6 h和相应量的媒介物（例如0.05％DMSO））进行中试实验。
配置两个通道的顺序扫描设置：
用于检测mWasabi的通道1 ：在488 nm处激发，发射检测范围为490-564 nm 。
用于检测TagRFP的通道2 ：在561 nm处激发，发射检测范围为564-700 nm 。
可取的是使用可用的最灵敏的检测器系统中的（即，磷砷化镓或路政署detcors 用于蔡司或徕卡CLSM，分别地）。
建议使用40倍物镜以获得最适合自动分析的图像。
为每个帧设置通道之间的切换，以最小化通道之间的串扰并优化针孔尺寸。如果可能，对每个通道使用1 AU的针孔。
如果可能，请使用16位分辨率来提高强度的分辨率。
用AZD 8055处理的样品将具有最弱的荧光，应用于将激光强度和检测器增益（主增益）调整到尽可能低的值，而不会导致像素过饱和。
用ConA 处理过的样品至少在绿色通道中将具有最强的荧光，应用于将激光强度和检测器增益（主增益）重新调整到尽可能低的值，而不会导致像素过饱和。
经DMSO处理的样品可用于验证调整后设置的适用性。
此外，可以通过降低扫描速度或增加平均次数来降低噪声。根据我们的经验，以每帧约10秒的速度扫描所产生的图像具有适合进一步分析的质量，同时还可以为实验提供可接受的时间。

扫描（CA 。每次处理30分钟）
该测定被优化用于测量表皮根细胞中的自噬活性。下游图像分析依赖于绿色荧光通道中液泡的自动检测。因此，最佳情况下，应在焦平面上成像，在焦平面中每个细胞液泡都被清晰可见的细胞质包围。
大多数CLSM软件都具有在选定位置进行扫描的选项，这将大大减少实验所需的时间。
在根的分化区开始处标记位置（图2E）。
开始快速扫描模式（实时扫描），并通过表皮细胞的液泡将每个位置的焦平面重新调整到中间部分（图2F，有或没有皮质细胞质）
重新调整所有位置后，获取并保存图像。请注意，自动统计分析将使用图像名称中提供的信息。请使用以下规则在图像名称中引入必需的参数：
用下划线（_）分隔参数
命名文件如下：行_ 处理_seedling X _image Y （例如，Reporter_50uM.C12_seedling1_image2.czi ）
其中line 和treatment 是文本变量或字符串，用于标识所使用的行（“ Reporter”或“ Control”）和处理（即“ 50uM.C12”）。一种治疗方法必须命名为“车辆”。X 和Y 是表示幼苗和图像重复的数字，因此分别代表生物学和技术重复。请注意，“种子”和“图像”是固定字符串，并且仅数字X 和Y 在图像之间变化。

数据分析

在分析之前需要处理数据。该处理分四个步骤完成：（i ）将共焦图像转换成.TIF文件；（ii）调整阈值以优化对液泡的识别。首次使用该协议时必须执行此步骤，如果需要，可以重新进行单个实验；（iii）定量液泡中的荧光强度；（iv）定量比值和数据作图，以作为对照对报告基因系，或比对时间和浓度。

我们提供了演示数据（https://github.com/jonasoh/AuTToFlux），可用于确保分析按预期进行。

建立分析管道
有关更详细的说明，请参见视频1（https://youtu.be/6oY3CyvGFPk）。

将所有要处理的图像放入一个文件夹中。如果要处理多个实验，请将它们作为子文件夹放在一个文件夹中。
下载并安装Fiji，这是ImageJ的版本，其中包含用于此研究的一组插件（https://fiji.sc/），我们使用的版本为1.51s和2.0.0-rc-69 / 1.52i。
下载并安装R（https://www.r-project.org，我们使用3.5.2和3.5.1）和RStudio（https://www.rstudio.com/，我们使用版本1.1.453和1.2。 1186）。
克隆GitHub存储库（https://github.com/jonasoh/AuTToFlux）或将其下载为zip文件。如果要克隆存储库，则可以使用RStudio自动执行此任务：在RStudio中，启动一个新项目（文件->新建项目->版本控制-> GIT，然后输入以下URL：
https : //github.com/jonasoh/ AuTToFlux。该库被自动克隆到选定位置。
在首次运行R脚本之前，您需要确保已安装其依赖项。使用RStudio的界面来安装软件包，然后安装软件包ggplot2，dplyr 和readr ，或者通过在控制台中键入以下命令来手动安装它们：

install.packages （c（“ ggplot2”，“ dplyr ”，“ readr ”））

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 1.jpg

视频1. R Studio中的存储库版本控制

将图像转换成TIFF文件
?F 或更详细的说明小号EE V 记意2（https://youtu.be/nKPq0kNvW_U）。

将所有要处理的图像放入一个文件夹中。如果要处理多个实验，请将它们作为子文件夹放在单个文件夹中。
运行图像处理器：启动Im ageJ并转到插件->宏->运行->找到ImageProcessor.ijm 。
图像处理器宏将打开目标文件夹中的所有兼容图像，并将它们另存为.TIF文件（文件扩展名为。tif ）；图像的原始采集日期保存在单独的文件中。使用“位置”功能扫描的实验中的多图像文件被拆分，以便将每个图像保存为单独的.TIF文件。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 2.jpg

视频2.图像处理

选择适当的阈值
?F 或更详细的说明见V 记意3（https://youtu.be/Wkw3VXFj2is）。将ImageProcessor 生成的至少三张TIFF图像复制到一个单独的文件夹中。旨在选择代表最佳，最差和平均质量的图像。

启动ImageJ并转到Plugins-> Macros-> Run->定位CalibrateThreshold.ijm 。这将运行宏。在立即显示的文件选择器中，找到具有代表性图像的文件夹。宏将记录与液泡相对应的区域大小，并将掩码另存为名称中包含阈值的tiff文件，例如，名为* .thr0-3.tiff的文件将对应于使用阈值（0; 3）创建的掩码。结果概述将作为阈值概述.tif 生成（图2G）。
启动RStudio。
打开RStudio项目文件（AuTToFlux.Rproj ）。
要估算哪些阈值可为所有分析图像提供最大的所选液泡面积，请运行EvaluateCalibration.R 脚本（选择R脚本，单击“代码”->“源”，然后选择包含在上一步中生成d 的.CSV文件的文件夹– 注意：在非Windows系统上，您需要输入文件夹的路径名）。
该脚本将绘制在所有分析图像上选择的平均总液泡面积与阈值的关系图。选择与最大面积相对应的阈值（图2H）。
使用从阈值概述和阈值图收集的信息，选择适当的上阈值进行标记。遮罩不应包含任何背景区域。
在继续进行图像阈值处理和数据分析之前，请确保已从包含已处理图像的目录中删除了校准文件夹。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 3.jpg

视频3. 阈值校准

测量荧光强度
有关更详细的说明，请参阅V 记意4（https://youtu.be/6jYqkYXOpiQ）。

运行阈值宏：启动ImageJ->插件->宏->运行->查找并打开宏文件FluorescenceIntensity.ijm 。
选择包含要分析的图像的文件夹，该文件夹先前已使用图像处理器宏进行了转换（步骤B）。
宏将提示您选择在校准过程中较早确定的阈值。对于每个图像，阈值宏会使用GFP通道自动选择与液泡相对应的区域，并将所选区域的遮罩保存为TIFF文件。然后使用掩模对图像相应通道中的RFP和GFP荧光强度进行定量。液泡RFP / GFP荧光强度的比率保存到文件名匹配的.CSV文件中。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 4.jpg

视频4.荧光强度测量

分析数据
为了估计剂量和时间依赖性反应，使用Flux-vs - Time.R将RFP / GFP比率与时间作图。有关更详细的说明，请参阅V 记意5 （https://youtu.be/0_wDY7RN_hk）。

在包含要分析的.CSV文件的文件夹中的文件夹中创建一个info.txt文件。治疗的初始时间（格式为YYYY-MM -DD HH：MM，24小时的时间）是用户指定的通过创建一个制表符分隔文本文件（使用任何电子表格软件，例如，Microsoft Excel）中有两列，这应该保存为info.txt，例如，
治疗开始时间

车辆2018-07-06 09:50

治疗2018-07-06 10:00

启动RStudio。
在从GitHub存储库创建的目录中找到R项目文件，如果尚未打开，则将其打开：
在R中，选择Flux-vs- Time .R ，单击Code- > Source，然后选择包含在步骤D中生成的.CSV文件的文件夹。
实验数据的汇总是根据与媒介物归一化的比例生成的，并按处理量和幼苗数进行分组（图2I）。要绘制数据，我们建议使用ggplot2（https://ggplot2.tidyverse.org/），轴（x =经过的时间，y =归一化的比例，颜色=处理）
进一步的统计分析将取决于实验中存在的处理方式，并且可以使用R或其他软件（例如Origin，JMP）执行。
该数据还可以用于使用估计IC50 R，例如，与所述的辅助DRC 包（里兹等人，2015），或其他软件，如棱镜。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 5.jpg

视频5.通量与时间的关系

为了证明自噬依赖性反应，绘制了对照品系的RFP / GFP比例与报告基因品系的比例。有关更多详细说明，请参见V ideo 6（https://youtu.be/PQRZ1oOBgws）：

启动RStudio。
在从GitHub存储库创建的目录中找到R项目文件，如果尚未打开，则将其打开：
在R中，选择Control-vs- Reporter.R ，单击Code- > Source，然后选择包含在步骤D中生成的.CSV文件的文件夹。
该脚本可以将包含多种处理方式的文件夹作为子文件夹，也可以将不包含子文件夹的文件夹作为一个实验作为其参数。
该脚本总结了RFP / GFP比率（归一化为媒介物）和按品系（对照或报告基因），处理和幼苗数量分组。使用未配对的两尾学生t 检验比较对照组和报告者组的对数转换归一化均值。生成一个名为pvals.txt的摘要表。如果需要从置换派生的P值（即精确的P值），请取消注释R脚本中标记的适当部分。
注意：?F 或两者控制-VS- Reporter.R 和焊剂VS- Time.R ，数据被保存既作为原始数据（如在实验目录摘要-full.txt）和作为每苗汇总统计（总结- perseedling.txt），以利于使用其他统计软件进行分析。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3535--1902885--1285 Alyona Minina 825729 \ video 6.jpg

视频6. 控件与记者

笔记

有关进一步的故障排除步骤，请参见表1。

表1.故障排除

问题

可能的原因

解

数据点数量少

图像上的高噪点

调整扫描设置以减少噪音

在数据分析过程中调整阈值

不集中在液泡的中间部分

确保样品的根在成像过程中没有漂移，并且放置在溶液的最薄层中

FluorescenceIntensity.ijm 宏中的阈值错误

请按照过程中的说明估算最佳值并调整宏

Flux-v- Time.R中分配的组不正确

每个时间点的数据点数量不同

该脚本要求每个组的数据点数大致相等。删除或添加数据点以平衡实验。

时间-V- Flux.R 退出与错误“错误的eval （EI ，ENVIR ）：文件存在（infofile ）是不是真正的”

目录中没有info.txt。

根据说明创建info.txt文件。

表1. 继续

Time-v- Flux.R 提供了意外的结果

info.txt中的时间与图像的获取时间不匹配。

确保info.txt中的时间与显微镜记录的时间相对应。

info.txt中的处理与文件名不匹配。

确保在文件名和info.txt中给处理名称完全相同。

数据点重复

ImageProcessor 已在同一组图像上运行两次。

删除所有。tif 目录中的文件，然后直接从显微镜在文件上重新运行ImageProcessor 。

脚本存在错误“ 文件与命名方案不匹配”。

文件命名错误。

仔细检查所有文件名是否与协议中描述的命名方案匹配。

菜谱

液体0.5x MS介质
0.5x MS含维生素，10 mM MES，1％蔗糖溶解在MQ水中
使用KOH将pH调节至5.8，并在120 °C下高压灭菌20'
最高储存在4°C。2个月
固体0.5x MS介质
调节液体0.5 x MS介质的pH值后，添加0.8 ％的植物琼脂并在120 °C 高压灭菌20 分钟
最高储存在4°C。2个月。如果需要，可将介质在微波中液化
漂白液
5％的Klorin （最终浓度：2.7 g / L 次氯酸钠），MQ水中的0.01％Tween-20
准备在50毫升Falcon试管中并保存在室温下
后约。1个月的Tween-20可能在溶液中形成沉淀，但是，这不会影响灭菌效果
DMD中的AZD 8055 5 mM库存
储存在-20°C下 2年

DMSO中的ConA 1 mM 库存
储存在-20°C下 1年

致谢

该项目得到了卡尔· Tryggers 基金会（授予EAM），加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（与AND）以及瑞典环境，农业科学与空间规划研究委员会（Formas ）的支持，项目编号为2016-20031。此协议，建立了研究进行由Dauphinee 等。（2019）

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

参考文献

Dauphinee，AN，Cardoso，C.，Dalman，K.，Ohlsson，JA，Berglund Fick，S.，Robert，S.，Hicks，GR，Bozhkov ，P.和Minina ，EA（2019）。化学筛选管道，用于鉴定特定的植物自噬调节剂。植物生理学181（3）：855-866 。
Hanamata，S.，Kurusu，T.，Okada，M.，Suda ，A.，Kawamura，K.，Tsukada ，E.和Kuchitsu （2013）。烟草BY-2细胞中自噬通量的体内成像和定量监测。植物信号Behav 8（1）：e22510。
黄河，徐玉，万万，寿X.，钱J.，尤Z.，刘冰，常昌，周T.，Lippincott-Schwartz，J 。and Liu，W.（2015）。饥饿中，核LC3的脱乙酰基驱动自噬的启动。分子池57（3）：456-466。
Klionsky，DJ，Abdelmohsen，K.，Abe，A。，等。（2016）。监测自噬的测定方法的使用和解释指南（第3版）。自噬12 ：1554-8635（在线）。
周成中，钟文成，周洁。，盛芳芳，方正。，魏燕。，陈燕芳，邓小霞，夏冰，林洁（ 2012）。通过改进的串联荧光标记的LC3（mTagRFP-mWasabi-LC3）监测自噬通量，发现高剂量雷帕霉素会损害癌细胞中的自噬通量。自噬8（8）：1215-1226。
Ritz，C.，Baty ，F.和Strebig ，J.C .（2015）。使用R进行剂量反应分析。PLoS 一10（12）：e0146021。