材料和试剂

移液器技巧
150毫米TC处理过的培养皿（Corning TM 430599，Thermo Fisher Scientific，目录号：08-772-24）
细胞刮板（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：08-100-241）
Cuvettes （Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：14-955-127）
MagneSphere ® 技术12位置，1.5毫升磁选支架（Promega，目录号：Z5342）
最小的空凝胶盒，1.0毫米（Thermo Fisher Scientific公司，Invitrogen TM ，目录号：NC2010）
空凝胶盒式梳子，迷你，1.0 mm，10孔（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：NC3010）
安玛西亚TM PROTRAN ® Western印迹膜（Millipore公司Sigma，目录号：GE10600041），保存于室温下。保质期：由制造商指定）
3 MM防污纸（Whatman，目录号3030-917）
Falcon TM 圆底聚丙烯5 ml管（Corning TM 352063，Thermo Fisher Scientific ，目录号：14-959-11A）
50 - 毫升锥形管（康宁TM 430291，赛默飞世尔科技，产品目录号：05-538-55A）
刀片（VWR ® ，目录号：55411-050）
Steriflip -GP无菌离心管顶部过滤器（M illipore Sigma，目录号：SCGP00525 ）
10毫升注射器，Luer-Lock TM （Becton Dickinson，目录号：302995）
22G PrecisionGlide TM 针（Becton Dickinson，目录号：305156）
1.5 ml低保留微量离心管（Phenix ，目录号：MH-815S）
12×24毫米的圆底玻璃管（Covaris ® ，目录号：520056）
用0.22一次性无菌瓶顶部过滤器μ 米膜（康宁TM 430513-500 ml或430626- 150毫升，赛默飞世尔科技，产品目录号：09-761-52或09-761-56）
CL- XPosure 胶片（Thermo Fisher Scientific，目录号：34091 ）
用于说明性实验的抗体如下：
中号乌斯正常的IgG（Abcam公司，目录号：ab37355）
中号乌斯α FLAG（Millipore公司Sigma公司，目录号：F3165）
HEPES（赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司，目录号：BP310500），小号撕在室温下。小号HELF寿命：由制造商指定
盐酸（HCl，Thermo Fisher Scientific，目录号：A144-500）
氯化钾（KCl的，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：P217-10），小号撕在室温下。小号HELF寿命：由制造商指定
氢氧化钾（KOH，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：P250-500），小号撕在室温下。小号HELF寿命：由制造商指定
氢氧化钠颗粒（氢氧化钠，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：S318-100），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
六水合氯化镁（MgCl 2· 6H 2 O，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：M33-500），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
氯化钠（NaCl，赛默飞世尔科技，产品目录号：S271-10），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
将2-丙醇（赛默飞世尔科技，产品目录号：A451-4），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
d-蔗糖（C 12 H ^ 22 ö 11 ，赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司，目录号：BP220-212），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
甘油（C 3 H ^ 8 ø 3 ，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：G33-20），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
DTT（C 4 ħ 10 ö 2 s ^ 2 ，GOLDBIO，目录号：DTT10），š torage温度：-20℃。保质期：由制造商指定
完整TM ，无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（西格玛Millipore公司，罗氏，目录号：11873580001），š torage温度：4℃（片剂），-20℃（溶解，见食谱）
的Triton TM X-100（Millipore公司Sigma，目录号：T9284），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
抑肽酶（Millipore公司Sigma，目录号：A6279），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
20毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）（New England Biolabs公司，目录号：B9000S），š torage温度：-20℃。保质期：由制造商指定。用于创建用于蛋白质定量的BSA标准
BSA（Millipore公司Sigma，目录号：A7906），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定。用于预清除磁珠。
苯甲脒（Millipore公司Sigma，目录号：B6506），š torage温度：4℃（粉），- 20℃（溶液，参见食谱）。保质期：由制造商指定
PMSF（Millipore公司Sigma公司，罗氏，目录号：11359061001），š torage温度：室温。保质期：由制造商指定
EDTA（C 10 ħ 18 Ñ 2 的Na 2 ö 10 ，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：S311-500），š torage温度：室温。保质期：由制造商指定
NP-40的替代，蛋白质级洗涤剂，10％溶液（Millipore公司Sigma，目录号：492018），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
的Benzonase ®核酸酶HC（Millipore公司西格玛，Novagen公司，目录号：71205-3），š torage温度：-20℃。保质期：由制造商指定
Bio-Rad公司的蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad公司，目录号：5000006 ），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
的Dynabeads TM 蛋白A或G（赛默飞世尔科技，Invitrogen公司TM ，目录号：10008D或10009D ），š torage温度：4℃。保质期：自生产之日起24个月
Precision Plus Protein TM 所有蓝色预染色蛋白标准品（B io- R ad ，目录号：1610393）
MOPS（C 7 ħ 15 NO 4 S，赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：BP308-500 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
Tris碱（C 4 ħ 11 NO 3 ，赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：BP152-5 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
SDS（Bio-Rad公司，目录号：1610301 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
乙醇（Decon L abs，Koptec 纯乙醇– 190 Proof，目录号V1101）
乙是-T RIS （C 8 ħ 19 NO 5 ，Millipore公司Sigma，目录号：B9757），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
焦亚硫酸钠（Na 2 S 2 O 5 ，密理博西格玛（Millipore Sigma），目录号：S9000），在室温下储存。保质期：由制造商指定
TEMED（Bio-Rad公司，目录号：1610800 ），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
过硫酸铵（APS）（Bio-Rad公司，目录号：1610700 ），š torage温度：室温（粉），-20℃（溶液，见ř ecipes）。保质期：由制造商指定（粉末），6个月或更长时间（溶液）
ProtoGel （30％）37.5：1至丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液（国家诊断，目录号：EC-890），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
超纯TM 水（赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：10977023 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
甘氨酸（C 2 H ^ 5 NO 2 ，赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：BP381-5 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
甲醇（CH 4 O，赛默飞世尔科技，Fisher化学公司，目录号：A452-4 ），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
吐温® -20（M illipore西格玛，Calbiochem公司，产品目录号：655205），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
即时脱脂牛奶，巴氏杀菌特级（签字厨房），小号撕毁在室温下。保质期：由制造商指定
2-巯基乙醇（M illipore Sigma，目录号：M3148），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
溴酚蓝钠盐（C 19 H 9 Br 4 NaO 5 S，Milli Sigma，目录号：B5525），在室温下保存。保质期：由制造商指定
磷酸二氢钾（Na 2 HPO 4 ，Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：P285-500）
无水磷酸氢二钠（KH 2 PO 4 ，Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：S375-212）
西方闪电PLUS-ECL（珀金埃尔默，目录号：NEL103E001EA），š torage温度：4℃。保质期：由制造商指定
70％乙醇
6 N HCl（请参阅食谱）
10x PBS（请参阅食谱）
1x PBS，pH 7.4（请参阅食谱）
1 M HEPES（请参阅食谱）
1 M Tris-base pH 6.8 / 7.5（请参阅食谱）
5 M NaCl（请参阅食谱）
2 M KCl （请参阅食谱）
1 M MgCl 2 （请参阅食谱）
1 M DTT（请参阅食谱）
10 ％的Triton X-100（请参阅食谱）
0.5 M EDTA pH 8.0（请参见配方）
10％APS（请参阅食谱）
50x cOmplete 蛋白酶抑制剂库存（请参阅食谱）
1 M苯甲idine（请参阅食谱）
0.2 M PMSF（请参阅配方）
1.23 MB 为-T ris pH 6.4 / 6.7（请参阅配方）
细胞裂解缓冲液（请参阅食谱）
0.1 M CoIP 缓冲区（请参阅食谱）
0.2 M CoIP 缓冲区（请参阅食谱）
0.5 M的BSA在0.2 M CoIP 缓冲液中（请参阅配方）
20x MOPS运行缓冲区（请参阅食谱）
传输缓冲区（请参见食谱）
TBS-T（请参阅食谱）
4x样品缓冲液（请参见配方）
阻止解决方案（请参阅食谱）
印迹解决方案（请参阅食谱）

设备

-80°C冷冻室
移液器（P20，P200，P1000）
DynaMag TM -15磁铁（Thermo Fisher Scientific，目录号：12301D）
Focused- 超声发生器（Covaris ® ，型号：S220）与12 X 24管适配器（Covaris ® ，目录号：500199）
注意：您可以使用任何类型的超声波仪（例如，超声波处理器）来替换本仪器。我们建议在没有核酸酶消化的情况下进行超声处理以溶解染色质。你与胞质蛋白（注上工作时可以跳过超声步骤小号，或者用核酸整个样本消化TEP C5）。

冷藏台式离心机（Eppendorf，型号：5810R）
冷藏微量离心机（Eppendorf，型号：5418R ）
紫外可见分光光度计（岛津制作所，型号：UV-1900）
Fisherbrand TM Isotemp TM 数字块式加热器（Thermo Fisher Scientific，目录号：88-860-021）
XCell SureLock TM 微型电池（Thermo Fisher Scientific，目录号：EI0001）
电泳电源（Thermo Fisher Scientific，型号：EC-105）；用于SDS-PAGE
迷你反式印迹® 电泳转移细胞（B IO- ř 广告，目录号：1703930）
PowePac TM 基本电源（Bio-Rad ，目录号：1645050）；用于转移
粘土亚当斯章鱼混合器（Becton Dickinson）; 用于裂解物
Rocker平台（Bellco Biotechnology，型号：7740-10010）：用于用抗体过夜印迹蛋白质印迹膜
台式轨道振动器（Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ TM 2000）

程序

收集细胞
使您感兴趣的细胞系达到80％融合。
注意：对于小鼠胚胎干细胞，我们通常从两个150 mm融合的组织培养板（约30 x 10 6 -40 x 10 6 总细胞）开始。使用的培养板数量将取决于您可以从每个培养板上获得多少个细胞（例如，小鼠胚胎干细胞在3D菌落中生长，因此产量非常高）以及要进行免疫沉淀的蛋白质的细胞丰度。

对于贴壁细胞：
吸出媒体。
用冰冷的1x PBS洗涤两次：
将足够的PBS倒在板上以覆盖它并旋转，以除去培养基残留物。
吸出PBS或将板倒置以丢弃它。
将板转移到冰上。
注意：从现在开始，除非另有说明，否则始终将样品和缓冲液置于冰中。

用冰冷的1x PBS（添加PMSF，苯甲idine和抑肽酶）刮擦细胞（使用蛋白酶抑制剂的原液作为1,000x）。通常，每150毫米平板使用3-4毫升PBS。
将刮取的细胞转移到15 ml锥形管中（如果最终体积超过12 ml，则转移50 ml）。
通过用另外的3-4 ml 含蛋白酶抑制剂的1 x PBS 洗涤刮板来收集所有剩余的细胞，然后转移到相同的15 ml锥形管中。
在4°C和300 xg 的冷藏台式离心机中沉淀细胞10分钟。
吸出上清液并在液氮中速冻细胞沉淀，并储存在-80°C直至准备进行。
对于悬浮生长的细胞：
将细胞从培养容器转移到50 ml锥形管中；用1x PBS洗涤培养皿一次，以收集所有剩余的细胞。
在25°C和300 xg 的台式离心机中沉淀细胞5分钟。
将细胞沉淀转移到冰上。
用40毫升冰冷的1x PBS洗涤一次：
将沉淀重悬于PBS中。
在4°C和300 xg 的冷藏台式离心机中沉淀10分钟。
将沉淀重悬于20 ml冰冷的1x PBS中，其中加入PMSF，苯甲idine和抑肽酶。
在4°C和300 xg 的冷藏台式离心机中沉淀细胞10分钟。
吸出上清液并在液氮中速冻细胞沉淀，并储存在-80°C直至准备进行。

打开Covaris 超声仪并设置为4°C
注意：超声仪需要约30-45分钟才能完成脱气和冷却。

裂解核（所有体积均指2个150毫米平板或30-40百万个细胞）
制备细胞裂解缓冲液（见ř ecipe B1; 700 μ 升对于2x 150毫米的板，或30-40百万个细胞），加入蛋白酶抑制剂（PMSF，抑酶肽，苯甲脒，一个d罗氏完整抑制剂-50x股票）和将Triton X-100的最终浓度调节为0.1％（使用10％的原液作为100x）。
重悬700每个粒料μ 升的新鲜制备的细胞裂解缓冲液使用P1000吸管。
将裂解液转移至低保留度的1.5 ml管中，并在4°C下摇动8分钟以裂解（例如，在冷室中使用旋转器）。
在4°C和3,000 xg 的冷冻微量离心机中离心3分钟。
可选：将上清液保留为“细胞质级分”。
注意：此协议专门针对核蛋白进行了优化，但是您也可以在细胞质级分上执行self-CoIP 。

首先用P1000除去上清液，然后用P200除去上清液，而不会干扰核沉淀。
制备0.1M的免疫共沉淀缓冲液（见ř ecipe B2; 700 μ 升对于2x 150毫米的板，或30-40百万个细胞），加入蛋白酶抑制剂（PMSF，抑酶肽，苯甲脒，和罗氏完全inhibitors- 50 X 股票）。
重悬700中的每个核沉淀μ 升的0.1M的免疫共沉淀缓冲液中。
注意：如果您不希望进行核酸酶消化，请直接将核沉淀重悬于0.2 M CoIP 缓冲液中，超声处理裂解物，然后从步骤s C10 跳至C17。

将重悬的细胞核转移到12 x 24 mm Covaris 管中。
对每个样品进行超声处理（峰值功率：100 W，周期/突发：200，占空比：20，处理20秒的8次重复，然后延迟40秒）。
测量样品的体积，同时将其转移回1.5毫升低保留管中。
用0.1 M CoIP 缓冲液加蛋白酶抑制剂将体积调至2 ml 。
将样品等分，以两个管，1毫升被留下未处理的和1ml与治疗乙enzonase （1 μ 升每ml裂解物）。
注意：Benzonase会同时消化DNA和RNA，因此会告诉您自我相互作用是否主要是由蛋白质-蛋白质相互作用介导的，还是需要核酸。如果自缔合是依赖于核酸，可以测试是否RNA或DNA都会参与其中，取代的Benzonase 与任一RNaseI 或DNA酶I （你将需要调整用于消化缓冲液DNA酶I ）。
岩石在4℃下进行3至4小时，以实现完全的Benzonase 消化。
在4°C的冷冻微量离心机中短暂旋转，以拉下液体。
添加5M的NaCl以使最终盐浓度至0.2M（即，20.4 微升，并立即反转管每1ml裂解物）。
在4°C摇动30分钟，以实现完全核裂解。
在4°C下以最大速度旋转冷藏微量离心机20分钟。
将上清液转移至新的低保留1.5 ml管中，并通过Bradford分析进行定量。

定量核裂解液
打开紫外/可见分光光度计。
准备足够的Bradford试剂来量化所有的溶胞产物加6倍额外的样品以制备BSA标准曲线（空白，2.5 微克，5 微克，7.5 微克，12 微克）。每个样品将需要1 ml的Bradford（用ddH 2 O 稀释Bio-Rad蛋白测定染料试剂1：5 ）。
准备BSA标准品，将47.5 微升的0.2M的免疫共沉淀缓冲到2.5 微升的20毫克/毫升BSA（NEB）。这会给你一个1 微克/ 微升BSA解决方案。
将Bradford试剂分装到1.5 ml试管中，如下所示：
1毫升（空白）

997.5 微升布拉德福德+ 2.5 微升BSA（2.5微克标准）

995 微升Bradford + 5 微升BSA（5微克标准液）

992.5 微升布拉德福德+ 7.5 微升BSA（7.5微克标准）

988 微升Bradford + 12 微升BSA（12微克标准品）

998 微升布拉德福德+ 2 微升样品＃1 /未处理

998 微升布拉德福德+ 2 微升样品＃1 / 的Benzonase

对于需要定量的样本数量。

加入BSA /裂解液后，立即颠倒每个试管进行混合。
将每个试管的内容物倒入塑料比色杯中，读取595 nm处的吸光度（用空白溶液自动将仪器清零）。
使用提供的模板补充表S1用BSA读数建立标准曲线，并内插样品浓度。

设置您的自我C oIP 实验并预先清除裂解物和珠子
我们在这里说明了一个典型的自我CoIP 实验，以探索黏着蛋白亚基Rad21 的自我关联及其对核酸的依赖性。具体来说，我们正在使用来自小鼠胚胎干细胞的核裂解物，其具有内源性双重标记的Rad21蛋白（最初在Cattoglio 等人（2019）中描述的B4克隆。该细胞系包含Rad21-SNAP f -3xFLAG等位基因和Rad21- Halo-V5等位基因（图2A）：我们将用FLAG抗体下拉从第一个等位基因表达的蛋白质（图2B），并检查在Western blot中是否也使用V5抗体免疫沉淀了第二个等位基因产生的V5标记蛋白b 很多（图2C），无论在未处理的裂解物，并与处理过的溶胞产物的Benzonase 消化核酸。我们也将检查实验印迹针对免疫沉淀的FLAG蛋白质（图2D）的总IP效率。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ Proofreading_New提交系统\ 1902918--1289 Claudia Cattoglio 809941 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2. Rad21 的自我CoIP Rad21自我CoIP 分析的实验工作流程和结果在这里用于说明协议。C和D中的数据是根据Cattoglio 等人的原始图2F修改的。（2019）。有关详细说明，请参见过程E。IN，输入核裂解物；UT，未处理的裂解物；苯：苯甲酸酶处理的裂解物。

为您的实验创建一个方案，如下所示：
样品号（需要毫克）

样品1：mESC / 未经处理的输入（0.2 mg ）

样品2：mESC / 未经处理的IgG （1 mg ）

样品3：mESC /未经处理的α 标记（1 mg）

样品4：mESC / 苯甲酸酯酶输入（0.2 mg）

样品5：mESC / 苯甲酰酶_IgG （1 mg）

样品6：mESC的/ benzonase核酸_ α FLAG（1毫克）

在这种情况下，每种情况（未经处理和经苯甲酸酶处理）将需要2.2 mg核裂解物。

注：正常IgG的样品（来自免疫前血清中纯化免疫球蛋白）控制非特异性下拉和它必须是你的相同物种的α FLAG抗体（例如，小鼠抗FLAG抗体和正常小鼠IgG）。

用添加蛋白酶抑制剂（PMSF，抑肽酶，苯甲idine 和Roche cOmplete 抑制剂）的0.2 M CoIP 缓冲液将实验所需的裂解液稀释至1 mg / ml 。如果体积超过1.5毫升，请将稀释的裂解物移至圆底试管中（图3a）。
在我们的说明性实验中：

条件浓度（表S1）对于2.2 mg 0.2 M CoIP 缓冲液至1 mg / ml

mESC的/未处理的2.5毫克/毫升880 μ 升1320 μ 升

mESC的/ benzonase核酸2.8毫克/毫升786 μ 升1414 μ 升

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ Proofreading_New提交系统\ 1902918--1289 Claudia Cattoglio 809941 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3.分步自CoIP 协议。该图说明了免疫沉淀目标蛋白所需的所有步骤，在本文中进行了详细描述。

带珠子的Preclear裂解物可减少非特异性结合（请注意，这些珠子将在预分离结束时丢弃）（图3b）。
洗净蛋白A或G D ynabeads 。
注意：根据一抗的种类和IgG亚型选择蛋白A或G（例如，将G蛋白用于兔和小鼠IgG2a抗体，将A蛋白用于豚鼠）。检查磁珠制造商的规格表，以确认您的选择。

大力重悬D ynabeads，直到均匀分散。
对于各条件，吸管20 微升的d ynabeads 每裂解物的毫克（例如，44 微升2.2毫克）到低保持1.5ml试管中。
重悬在500 微升的0.2M的免疫共沉淀缓冲液中。
插入在磁铁分离架上的管，并等待对于5 分钟的溶液来清除。
用移液管吸出CoIP 缓冲液，从磁铁上移开试管，然后再次洗涤（步骤E3a -iii 至E3a -v ）。
从磁铁上移开试管，然后使用稀释的裂解液重悬磁珠，并将其与其余核蛋白一起转移到圆底试管中。
在4°C下用小珠摇动裂解液至少2 h。
使用BSA的Preclear磁珠（请注意，您将使用这些磁珠执行实际的下拉实验）（图3e-3f）
洗净蛋白A或G D ynabeads ; 您将准备一个单独的D ynabeads 池，以用于所有样本。
大力重悬D ynabeads，直到均匀分散。
在1.5毫升管，吸管20 微升的d ynabeads 每个样本（例如，20 微升为6个样品：120 微升）。
注：Ÿ 欧不会吸管d ynabeads 您的输入样本，但我们包括输入预清除珠时以后，以容纳移液误差。

重悬于1 ml的0.2 M CoIP 缓冲液中。
插入管在1.5毫升磁选支架，并等待对于5 分钟的溶液来清除。
用移液管吸出CoIP 缓冲液，从磁铁上移开试管，然后再次洗涤（步骤E4a -iii 至E4a -v ）。
从磁铁上取下试管，然后将磁珠重悬在含0.5％BSA的0.2 M CoIP 缓冲液中（请参阅配方B4）。使用缓冲当量的量的你的珠10倍的体积（例如，1 ，200 微升120 BSA缓冲液微升的小珠）。
在4°C下用BSA摇珠过夜。
注意：为方便起见，我们在将裂解物与抗体一起孵育的同时，将过夜用BSA的珠子进行了预清洁，但是几个小时也足够。

将抗体添加到预先清除的裂解物中（图3c-3d）。
在4°C 下短暂旋转预澄清的裂解液，以除去管盖上的液滴。
取下卡口盖，然后将管子插入DynaMag TM 磁力架。
等待为5分钟，使该溶液澄清。
注意：在进行此过程以及随后的所有磁分离过程中，我们希望将磁架转移到冰箱中，等待溶液清除，以始终保持样品冷却。

将上清液转移到新的试管中而不破坏珠子。
根据IP需要准备尽可能多的1.5 ml低保留管（例如，对于我们的6个样品）。
将预澄清的裂解液分配到新试管中。在我们的说明性实验中，这将对应于：
样品2-3和5-6：移液管1 ml（相当于1 mg）

样品1和4（输入）：100-150吸管微升（相当于0.1-1.15毫克）

添加特异性抗体（4 μ 克由混合每裂解物的毫克），并立即转化管。在我们的说明性实验中：
样品1（mESC / 未经处理的输入）：无抗体

样品2（mESC的/ untreated_IgG ）：4 μ 克小鼠正常的IgG的

样品3（mESC的/ untreated_ α FLAG）：4 μ 克小鼠的α FLAG

样品4（mESC / benzonase_input ）：无抗体

样品5（mESC的/ benzonase_IgG ）：4 μ 克小鼠正常的IgG的

样品6（mESC的/ benzonase核酸_ α FLAG）：4 μ 克小鼠的α FLAG

在4°C下用抗体旋转/摇动裂解物过夜。
注意：孵育抗体过夜时，我们可获得最佳结果，但是您可以测试抗体并尝试缩短时间。

将抗体与预先清除的磁珠结合（图3g-3i）。
取回样品和经过BSA预处理的珠子，并在4°C 下短暂旋转，以除去管盖上的液滴。
将带有预清除磁珠的试管放入磁力分离器架中。
等待为5分钟，使该溶液澄清。
从在0.2M的磁体，重悬珠子去除管免疫共沉淀用缓冲液抑制剂（50 μ 升每样本;在我们的实验说明，50 微升×6个样品= 300 μ 升总）。
Distibute 50 μ 升的悬浮珠粒到每个样品被免疫沉淀（输入除外），并立即倒置以混合。
用抗体和珠子在4°C 旋转/摇动裂解物最少2 h。
将输入样品放在冰上。

洗涤免疫沉淀的样品（IP样品）以去除非特异性结合（图3j）。
准备足够的冰冷的0.2M 免疫共沉淀缓冲液加蛋白酶抑制剂至8倍与400洗每个IP样品微升缓冲液（例如，4个IP样本x 400 微升×8 =12.8毫升0.2 M的免疫共沉淀缓冲液;输入除外）。
在4°C 短暂旋转IP样品，以除去管盖上的液滴。
将IP样品的试管插入1.5 ml的磁力架中。
等待为5分钟，使该溶液澄清。此时，您的免疫沉淀蛋白会通过抗体附着在磁珠上。
使用P1000 移液器卸下CoIP 缓冲液，而不会干扰珠子。
从磁铁上取下试管，然后放回冰上。
加入400μl 的0.2 M CoIP 缓冲液。
注意：确保珠子完全重悬。我们通常以低速涡旋。

重复步骤H4-H7进行总共8次洗涤。
最后一次洗涤后，还用P20 清除所有残留的缓冲液。

洗脱免疫沉淀的物质并准备用于SDS-PAGE的输入和样品（图3k-3l）。
从磁铁上取下试管，然后放回冰上。
洗脱免疫沉淀从珠中加入20蛋白μ 升1X SDS上样缓冲液（配方B8）的。
注意：洗脱量取决于您有多少个样品。我们在这里说明使用10孔丙烯酰胺凝胶的实验，该凝胶可以轻松容纳17μl 。我们还使用12孔或15孔凝胶，并相应地调整洗脱体积或装载较少的材料。

涡旋重悬。
在设定为98 °C 的加热块中将小珠煮沸5分钟。
短暂旋转。
将试管放入1.5 ml的磁力架中。
等待为5分钟。您洗脱的蛋白质现在在上清液中。
将上清转移到新的低保留1.5在冰上ml管（体积要稍多于20 微升）。您将在一块凝胶上上样此未稀释样品的量为17μl ，以估计自CoIP 效率（图2C）。
准备一个新的组管18 μ 升1的X SDS上样缓冲液，并添加2 μ 升洗脱的材料制成。你将加载17 微升此的上的第二凝胶1:10稀释来估计IP效率（图2D）。
准备0.75％的输入以与IP样本一起加载。
混合22 μ 升输入裂解物与25 μ 升2×SDS上样缓冲液和3 μ 升0.2M的免疫共沉淀缓冲液。
注：这削弱了你的inpute 裂解物0.44 μ g ^ / μ 升。装载17 μ 升该稀释的会给你〜7.5 μ 克，其对应于起始原料（1毫克）0.75％。

在设定为98 °C 的加热块中煮5分钟。
短暂旋转，然后将试管放在冰上。

通过SDS-PAGE和Western印迹评估自我CoIP 和CoIP 效率
P repare SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶
注意：如果更方便，则可以从Invitrogen 购买预制的NuPAGE Bis-Tris凝胶。

根据POI的大小选择凝胶百分比。凝胶迁移图可从ThermoFisher Scientific网站上获得（我们的凝胶配方的行为类似于Invitrogen TM 的NuPAGE Bis-Tris预制凝胶）（参考文献33 ）。对于Rad21，我们使用9％的凝胶。
检查表1的食谱。

表1.使用此表准备您的SDS-PAGE凝胶（所有指定的体积均用于1毫米暗盒，1凝胶）

分离胶

试剂

12％

10％

9.5％

9％

8％

1.23 M Bis-Tris pH 6.7

1.8毫升

1.8毫升

1.8毫升

1.8毫升

1.8毫升

30％丙烯酰胺

2.52毫升

2.1毫升

2.0毫升

1.89毫升

1.68毫升

二次蒸馏H 2 O

1.93毫升

2.35毫升

2.45毫升

2.56毫升

2.77毫升

10％APS

42微升

42微升

42微升

42微升

42微升

特美

12微升

12微升

12微升

12微升

12微升

总容积：

6.3毫升

6.3毫升

6.3毫升

6.3毫升

6.3毫升

堆积胶

试剂

4％

1.23 M Bis-Tris pH 6.4

710微升

30％丙烯酰胺

330微升

二次蒸馏H 2 O

1.43毫升

10％APS

20微升

特美

7微升

总容积：

2.5毫升

将两个1毫米凝胶盒放置在稳定的直立位置。
在15毫升的锥形管中，开始准备分离凝胶，并按照表1中指定的顺序添加试剂（Bis-Tris，丙烯酰胺和水）。
上下充分混匀，最后加入APS和TEMED。
及时混合并吸取到凝胶盒中，为堆叠凝胶留出足够的空间。
立即用喷水瓶在凝胶上覆盖70％乙醇。这将使您的凝胶正面整齐而笔直。
等待聚合完成。
注意：固化后，凝胶前沿将显示为整齐的线条，可与上面分层的乙醇区分开来。

抽吸乙醇，并使用喷水瓶用ddH 2 O 彻底洗涤凝胶。
吸出过量的DDH 2 O.
在一个新的15 ml锥形管中，开始准备堆积凝胶，并按照表1中指定的顺序添加试剂（Bis-Tris，丙烯酰胺和水）。
上下充分混匀，最后加入APS和TEMED。
及时混合并吸取到分离凝胶顶部的凝胶盒中，一直到盒顶部。
缓慢放置选定的梳子（在本例中为10孔梳子），确保在孔下面没有气泡形成。
注意：我们通常在插入梳子时用P1000吸去多余的堆积凝胶，然后将其转移回我们准备的15 ml试管中，以免丙烯酰胺溅到工作台上。

等待聚合完成。
运行SDS-PAGE
将凝胶转移到正在运行的盒中（每个盒可容纳2个凝胶）并将其锁定到位。
注意：切记剥离凝胶盒底部的白色胶粘剂。

根据配方B5稀释20倍MOPS运行缓冲液。
注意：切记要添加焦亚硫酸钠。

从凝胶盒中取出梳子。
将运行缓冲液一直充满到两个纸盒之间的内部腔室中。
注意：这将允许您检查盒带是否正确锁定，或者缓冲区是否泄漏。

使用装有22G针头并充满运行缓冲液的注射器轻轻清洗孔。不要打扰井底。
添加其余的运行缓冲区。
注意：500毫升将填充一半或更少的外部水箱。

确定样品的加载顺序。在我们的说明性实验中：

凝胶＃1（α V5印迹，以评估自我免疫共沉淀）

1）空

2）预制蛋白标准

3）mESC /unprocessing_0.75%_input

4）mESC / 未经处理的_IgG_ 未稀释

5）mESC的/ untreated_ α FLAG _undiluted

6）空

7）mESC / 苯甲酸酶_0.75 ％_input

8）未稀释的mESC / 苯甲酸酶_IgG

9）mESC的/ benzonase核酸_ α FLAG _undiluted

10）空

Gel＃2（αFLAG印迹，用于评估CoIP ）

1）预制蛋白标准

2）空

3）mESC /unprocessing_0.75%_input

4）mESC / 未经处理的_IgG_稀释

5）mESC /未处理_αFLAG_ 稀释

6）空

7）mESC / 苯甲酸酶_0.75 ％_input

8）稀释的mESC / benzonase_IgG_

9）稀释的mESC / 苯甲酸酶_αFLAG

10）空

注意：将蛋白质标准品上样至孔1（gel＃1）或孔2（gel＃2）中，以便可以轻松地区分两者。

制备预染蛋白质标准（7 微升加27 微升1×SDS上样缓冲液，17 微升每孔）。
小心地将每个样品17μl 装入P20。与17填充空孔微升1×SDS上样缓冲液中。
将运行中的录像带盒的盖子连接到电源，然后将其放在录像带盒的顶部。
在75 V下运行，直到样品进入分离凝胶。
注意：标记物碰到分离凝胶后，您会看到清晰的条带形成。

将电压增加到130V。
注意：为帮助散热，我们经常将卡带盒放在大型金属块上。

运行直到溴酚蓝碰到卡匣的底部，但要用完之后再用完。
关闭电源。
取下盖子，解锁凝胶盒并取出。
用ddH 2 O 彻底清洗盒带，包括孔，以除去运行缓冲液的任何痕迹。
将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上
组装传输设备（图4）。
用ddH 2 O 预湿两块吸墨膜，切开仅比凝胶稍大即可转移。
注意：戴手套处理薄膜时，只能触摸薄膜的侧面。

取一个适合凝胶固定盒的托盘。
添加一个凝胶固定器盒，黑色面朝下，并倒入足够的转移缓冲液以覆盖它。
加入一块海绵，并确保将其完全浸入转印缓冲液中。
在转移缓冲液中预润湿2张吸墨纸，仅将其切成略大于要转移的凝胶。
将第一个凝胶盒放在纸巾上（向下压），然后用提供的金属刮刀将其打开。
取下顶部，确保凝胶粘附到底部。
用剃须刀刮掉伸出的凝胶底部和堆积的凝胶。
注意：堆积凝胶是胶状的。用刮刀将其从凝胶盒刮至纸巾，以清除所有残留物。

将装有凝胶的试剂盒浸入带有转移缓冲液的托盘中。
从盒中取出凝胶并将其转移到湿吸墨纸的顶部；将空纸盒放在一边。
将印迹膜在转移缓冲液中预湿，然后将其铺在凝胶上。
将一块吸水纸预湿，然后将其铺在膜的顶部。
用空的凝胶盒将凝胶和膜之间可能形成的气泡吹出，用力但要轻柔地按压。
重复步骤J3a -xii 和J3a -xiii 。
预湿另一块海绵，然后将其添加到顶部。
注意：始终预先润湿吸墨纸和海绵，以免产生毛细作用。

小心地关闭凝胶固定器盒，不要打扰三明治，然后将其插入传输槽中。
对第二个凝胶重复步骤J3a -iii 至J3a -xvi 。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ Proofreading_New提交系统\ 1902918--1289 Claudia Cattoglio 809941 \ Figs jpg \ Figure4.jpg

图4.转移“三明治”的组装

插入冷却装置。
完全填充传输槽。
合上盖子，将电缆连接到传输电源。
在100 V和4°C下转移2小时。
阻挡膜
从转印设备中取回已弄脏的膜。
注意：如果您看到染色的分子量转移到您的膜上，您将知道转移成功。

使用足够大的容器在不弯曲的情况下快速冲洗TBS-T中的每个膜。
加入10 ml封闭液（TBS-T中含10％牛奶）。
注意：移液时要紧贴膜，不要放在膜的顶部。

在室温下搅拌至少1小时。
印迹膜
在15 ml锥形管中的印迹溶液（TBS-T中含5％的牛奶）中制备一抗。在我们的说明性实验中：
凝胶＃1：兔αV5，1：2,000（8μl5 ％牛奶中4μl ）

凝胶＃2：兔α FLAG，1：1000（8 μ 升在8ml 5％牛奶）

注意：检查所选抗体的数据表，以找到推荐的Western blot稀释液。从一种抗体到另一种抗体，这可能相差很大。

丢弃封闭溶液，并在印迹溶液中加入抗体。
在4 ℃下搅拌过夜。
注意：在冷室中过夜孵育可增加特异性信号，同时减少迄今为止我们测试的所有抗体的背景噪音。

洗膜
从膜上除去印迹溶液。
用10 ml的TBS-T快速冲洗，除去所有一抗残留物。
用新鲜的10毫升TBS-T代替，搅拌15分钟。
换上新鲜的TBS-T，搅拌5分钟。
重复步骤J6d。
用结合HRP的二抗进行印迹
在TBS-T中的5％牛奶中制备HRP 结合的二抗的1：5,000稀释液。在我们的实验说明，山羊α小鼠HRP （2 μ 升在10毫升的5％牛奶）。
在室温下搅拌至少30分钟。
按步骤J6洗涤膜。
进行化学发光反应
对于每个膜，准备2 ml ECL试剂（1 ml 氧化试剂加1 ml增强鲁米诺试剂）。
将膜转移到新的容器中，并吸出任何TBS-T残留物。
吸取ECL试剂以完全覆盖膜。
温育2分钟，轻轻旋转容器，仍要确保膜完全覆盖。
丢弃ECL试剂并成像Western blot。
注意：您可以使用X射线胶片（我们的首选）或化学发光成像仪器（例如Chemidoc ）。

笔记

最重要的是，您要测试用于免疫沉淀和/或检测每个标签的抗体，以排除与其他标签以及与POI（使用未标记的野生型细胞）的交叉反应性。例如，在探查带有V5标签和带有FLAG标签的Rad21蛋白之间的自我相互作用时，我们发现其中一种FLAG抗体确实在未标记的细胞中检测到了一条具有相同大小的Rad21的条带，这表明可能与野生型Rad21 蛋白（参见图2 – Cattoglio 等人[ 2019 ]中的图补品1 ）。
对于内源蛋白的标准CoIP ，您将需要确定良好的抗体以进行免疫沉淀并检测POI。如果没有可用的方法，则可以像我们对自我CoIP一样执行CRISPR / Cas9内源标签，但是这次用不同标签（例如，带有FLAG-Halo标签的CTCF和V5-在SNAP标签RAD21在克隆C59 汉森等人。[ 2019 ] ）。

菜谱

储备溶液
6 N HCl（500毫升）
戴护目镜和面罩。在通风橱中工作。用250 ml的双蒸馏水（ddH 2 O）稀释250 ml的浓酸（36.5至38.0％）。

10x PBS，pH 7.4（1 升）
向800 ml的ddH 2 O中添加NaCl（80 g），KCl （2 g），Na 2 HPO 4 （14.4 g）和KH 2 PO 4 （2.4 g）。搅拌溶解
戴上护目镜，用6 N HCl调节pH值至7.4（Thermo Fisher Scientific制备6 N HCl溶液，用ddH 2 O 稀释浓酸1：1 ）
用ddH 2 O 将体积调至1 L ，然后将100 ml分配到可高压灭菌的玻璃瓶中
甲上的液体循环utoclave 30分钟
1x PBS，pH 7.4
137毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

10毫米Na 2 HPO 4

2毫米KH 2 PO 4

稀从10倍的蒸压溶液（配方A2）和重新autoc 澡

注意：您也可以购买现成的无菌1x PBS。储存温度：15-30 ° C。保质期：从制备日期算起12个月。

1 M HEPES，pH 7.6（1 L ）
从700 ml的ddH 2 O 开始。添加23 8.3 g的HEPES，使其溶解
加入31.9克KOH（防汗眼罩和面膜）
用ddH 2 O 使溶液升至定量
通过瓶到滤波器P 0.2 μ 米过滤器和等分40毫升到50ml锥形管中
储存在-20 °C长达12个月
注意：用这种方法制得的1 M溶液的pH值为〜7.8，但是将储备溶液稀释20倍后的pH值为7.6。

1 M Tris-碱pH 6.8 / 7.5（1 L ）
从500 ml的ddH 2 O 开始。添加121.1 g的Tris-碱，使其溶解
用6 N HCl将pH调节至6.8 / 7.5 （戴防护眼罩和面罩）
用ddH 2 O 使溶液升至定量
甲上的液体循环utoclave 30分钟
5 M NaCl（1 升）
从700 ml的ddH 2 O 开始。添加292.2 g的NaCl并搅拌使其溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
甲上的液体循环utoclave 30分钟
2 M KCl （500毫升）
从300 ml的ddH 2 O 开始。添加74. 6 g的KCl 并搅拌使其溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
通过瓶顶部0.2滤波器μ 米过滤器
1 M氯化镁2 （1 升）
从800 ml的ddH 2 O 开始。添加203.3 g的MgCl 2 并搅拌使其溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
甲上的液体循环utoclave 30分钟
1 M DTT（10毫升）
从8 ml的ddH 2 O 开始。添加1.54 g的DTT 并将试管倒置以溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
准备1毫升等分试样，并在-20 °C下保存长达12个月
10％Triton X-100（500毫升）
向450 ml的ddH 2 O中添加50 ml的Triton X-100。

0.5 M EDTA pH 8.0（1 升）
从700 ml的ddH 2 O 开始。添加186.12 g的EDTA并搅拌（EDTA 在pH值接近8.0之前不会溶解）
用NaOH颗粒（〜20 g ;戴护目镜和口罩）将pH值调节至8.0
用ddH 2 O 使溶液升至定量
甲上的液体循环utoclave 30分钟
10％APS（10毫升）
向8 ml的ddH 2 O中添加1 g的过硫酸铵，并将试管倒置以溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
准备1毫升等分试样，并在-20 °C下保存长达12个月
50x cOmplete 蛋白酶抑制剂原液（〜10 ml）
将15毫升锥形管中的10片药片溶于10毫升ddH 2 O中
倒置吨UBE直到完全溶解
准备500毫升等分试样，并在-20 °C下保存长达12个月
1 M联am（10 ml; 1,000 x ）
向8 ml的ddH 2 O中加入1.2 g的苯甲idine 并将试管倒置以溶解
用ddH 2 O 使溶液升至定量
准备1毫升等分试样，并在-20 °C下保存长达12个月
0.2 M PMSF（10毫升; 1,000 x ）
向9毫升异丙醇中加入348毫克PMSF ，并将试管倒置以溶解
用异丙醇将溶液升至刻度
准备1毫升等分试样，并在-20 °C下保存长达12个月
1.23 MB 为-T ris pH 6.4 / 6.7（每个250 ml）
向300 ml的ddH 2 O中添加128.7 g的Bi s-Tris，并搅拌直至溶解
将容量调至最大400毫升，并平均分成两个烧杯（每个200毫升）
用浓盐酸将pH调至6.4或6.7 （戴防护眼罩和面罩）
用ddH 2 O 将每种溶液加至250 ml
过滤器灭菌并在室温下储存长达12个月

缓冲液和其他解决方案
细胞裂解缓冲液（10 ml）[最终浓度]：
100 μ 升的1M HEPES的，pH值7.9 [10 mm]的

50 微升的2M的氯化钾[10 mm]的

30 微升的1M的的MgCl 2 [3 mm]的

1.16克蔗糖[〜340毫米]

1毫升甘油[10％]

10 微升的1 M DTT [1 mm]的

ddH 2 O至10 ml

称重蔗糖并添加〜5 ml的ddH 2 O
加入所有剩余的溶液，并用更多的ddH 2 O 使体积达到10 ml
用注射器过滤通过0.2 μ 米过滤器
右在使用之前，添加的Triton X-100至0.1％的最终（使用10％的Triton X-100的库存为100 X 浓溶液）和preotease 抑制剂（抑肽酶，苯甲脒，PMSF和大鹏他蛋白酶抑制剂混合物）
0.1 M CoIP 缓冲液（500 ml）[最终浓度]
10毫升5 M氯化钠[100毫米]

12.5毫升的1 M Hepes pH 7.9 [25 mM]

500 微升的1M氯化镁的2 [1 mm]的

200 微升的0.5M的EDTA pH为8.0 [0.2 mm]的

25毫升10％NP-40替代品[0.5％]

ddH 2 O至500 ml

向100 ml的ddH 2 O中添加所有其他溶液。使体积至500ml，并过滤通过一个瓶顶部0.2 μ 米过滤器

0.2 M CoIP 缓冲液（500 ml）[最终浓度]
20 ml的5 M NaCl [200 mM]

12.5毫升1 M HEPES pH 7.9 [25 mM]

500 微升的1M氯化镁的2 [1 mm]的

200 微升的0.5M的EDTA pH为8.0 [0.2 mm]的

25毫升10％NP-40替代品[0.5％]

ddH 2 O至500 ml

向100 ml的ddH 2 O中添加所有其他溶液。使体积至500ml，并过滤THR ough一个瓶顶部0.2 微米过滤器

在0.2 M CoIP 缓冲液（50 ml）中的0.5％BSA
向50 ml的0.2 M CoIP 缓冲液中加入250 mg的BSA。颠倒管子进行混合，直到BSA溶解，然后通过5 0 ml离心管顶部过滤器过滤

20x MOPS运行缓冲区（1 L ）
209.39克MOPS

121.1克Tris-Base

20克SDS（戴防护眼罩和口罩）

7.44克EDTA

使体积达到1升的DDH 2 O和过滤器通过瓶顶部0.2 μ 米过滤器
在室温下避光保存长达12个月
要运行SDS-PAGE，请用ddH 2 O 稀释至1x，然后添加偏亚硫酸氢钠（每500 ml运行缓冲液0.47 5 g）
每次准备新鲜的1x运行缓冲液；不要重复使用
TR ansfer缓冲液（2 大号）
3.63克Tris-Base

28.83克甘氨酸

400毫升甲醇

将Tris-Base和甘氨酸溶解在1升ddH 2 O中
将体积调至1.6升并添加甲醇
在4°C下保存最多12个月。我们通常会在丢弃同一个传输缓冲区之前重复使用两次
TBS-T（2 升）
200毫升5 M氯化钠

10毫升2 M Tris pH 7.5

2毫升的吐温20

向1.5升ddH 2 O中添加NaCl和Tris
将容量升至2升，转移到干净的瓶子中，添加磁力搅拌器和Tween-20（我们通常使用P1000，将充满Tween-20 的整个吸头滴入瓶中）
搅拌，直到所有的Tween-20的被均匀地通过瓶顶部0.2分布和过滤器μ 米过滤器
4x样品缓冲液（10毫升）[最终浓度]
1.6毫升2-巯基乙醇[16％]

2 ml Tris pH 6.8 [200 mM]

0.8克SDS（戴防护眼罩和面罩）[8％]

4毫升甘油[40％]

0.62克DTT [400毫米]

0.04克溴酚蓝[0.4％]

称量所有成分在50毫升锥形管中的重量
通过0.2滤波器μ 米滤波器50毫升过滤管
对于2x样品缓冲液，用ddH 2 O 1：1稀释4x溶液

对于1x样品缓冲液，将2x溶液用ddH 2 O 1：1稀释。准备1 ml等分试样，并在-20°C下保存长达12个月

封闭溶液，含10％牛奶（w / v）的TBS-T（100 ml）
将10克速溶牛奶溶于100毫升TBS-T。在4 °C下保存最多2周

印迹溶液，5％牛奶（w / v）的TBS-T（100 ml）
将5克速溶牛奶溶于100毫升TBS-T。在4 °C下保存最多2周

致谢

ASH感谢Siebel干细胞研究所的博士后研究金和NIH NIGMS K99独立之路K99GM130896的支持。该泽南-Darzacq 实验室是由美国国立卫生研究院共同基金4D支持Nucleome 计划U01-EB021236和U54-DK107980（XD），再生医学批LA1-08013加州理工学院（XD），以及由霍华德·休斯医学研究所（003061，RT ）。我们首先开发了此处详述的协议，以评估CTCF （Hansen 等人，2019）和黏附素亚基Rad21（Cattoglio 等人，2019）的自我相互作用。感谢李杰（Jack Li）对这份手稿提供意见。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的金融/非金融利益。

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