材料和试剂

用料
移液器技巧
6孔板（经过TC测试）（Sarstedt ，目录号：83.3920）
玻璃巴斯德吸管（VWR，目录号：14672-200）
1.5 ml微型管（Sarstedt ，目录号：72.690.300）
0.2 ml微型管（Sarstedt ，目录号：72.737）
磁力架（Thermo Fisher，DynaMag-2磁铁，货号：12321D）
0.22微米过滤器（UltiDent，目录号：229747）
大口径玻璃移液器
小口径玻璃移液器

动物
C57BL / 6小鼠（已成功对1个月至24个月大的小鼠进行了手术）

试剂种类
用于消化指长肌

PBS（Wisent，目录号：311-425-CL）
来自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶（Sigma，目录号：C0130-1G）
DMEM（Invitrogen，目录号：11995073）
马血清（Wisent，货号：065-250）
胰蛋白酶（Gibco，目录号：15090-046）
异氟烷（Fresenius Kabi ，目录号：CP0406V2）
CO 2 （普莱克斯（Praxair），目录号：GP-700500）
消化缓冲液（请参见食谱）
涂料介质（请参见配方）

用于从单个肌纤维中提取RNA

RN 一个SE游离水
RN 一个SE INHIB itors（从SMART-SEQ HT试剂盒，Takara Bio公司USA，目录号：634456）
SMART-Seq反应缓冲液（请参见配方）

用于cDNA文库制备

SMART-Seq HT试剂盒（美国Takara BIO，货号：634456）

用于文库纯化

Ampure XP磁珠（贝克曼库尔特生命科学，目录号：A63882）
乙醇（商业酒精，目录号：P016EAAN）
无RNase的水

用于准备测序准备库

Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1024）
Nextera XT Index Kit（Illumina，目录号：FC-131-1001）
Quant-IT Picogreen dsDNA分析试剂盒（Invitrogen，目录号：P7589）

用于纯化和尺寸选择

Ampure XP磁珠（贝克曼库尔特生命科学，目录号：A63882）
乙醇（商业酒精，目录号：P016EAAN）
无RNase的水
Quant-IT Picogreen dsDNA分析试剂盒（Invitrogen，目录号：P7589）

用于质量控制

琼脂糖（Bioshop ，目录号：AGA001.500）
三（羟甲基）氨基甲烷（多电池，目录号：600-125-LG）
冰醋酸（Fisherbrand ，目录号：351272-212）
Na 2 EDTA· 2H 2 O（Bioshop ，目录号：EDT 001）
GelGreen 核酸凝胶染料（Biotium ，目录号：41005）
SYBR Green（应用生物系统，目录号：A25742）
引物（集成DNA技术，标准脱盐，25毫摩尔）（表1）
100 bp DNA阶梯（GenedireX ，目录号：DM001-R500）
TAE缓冲区（请参阅食谱）

表1.用于文库质量控制的引物序列

名称

顺序

Myf6-L

GCTAAGGAAGGAGGAGCAAA

Myf6-R

GAAGAAAGGCGCTGAAGACT

Pax7-L

GACTCCATCAAGCCAGGAGA

Pax7-R

CACGTTTTTGGCCAGGTAAT

RPS2-L

TCAAGGCTTTCGTCGCTATT

RPS2-R

CCAATCTTGTTCCCCCAGTA

设备

解剖工具
细点高精度镊子（Fisher Scientific，目录号：22-327379）
尖头解剖剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-935）
移液器（P20，P200）
金刚石笔（VWR，目录号：201-0392）
显微镜（Fisher Scientific倒置显微镜，配备透射光和4 倍物镜）
离心机（Thermo Scientific，Sorval Legend Micro 21R微型离心机，目录号：75002447）
热循环仪（Bio-Rad，C1000触摸式热循环仪，目录号：1851148）
微型离心机（Mandel，Benchmark MyFuge 微型离心机，目录号：BEN-C1008-R）
凝胶成像仪（LI-COR，Odyssey FC成像系统）
qPCR机（Applied Biosystems，QuantStudio7 Flex）
生物分析仪（Agilent，BioAnalyzer 2100）
细胞培养箱（Thermo Scientific，Forma II系列带水套式CO 2 培养箱，目录号：3110）
涡旋混合器（曼德尔）
电源（Bio-Rad，PowerPac ，目录号：1645050）
中号icroplate读数器（BioTek的，能力综合）

程序

程序概述：

小家鼠伸肌伸肌（EDL）的解剖和消化（1.5-2 h）
肌纤维RNA提取（30分钟）
cDNA文库制备（3小时）
cDNA纯化（30分钟）
准备排序就绪的库（2.5小时）
纯化和大小选择（30分钟）
质量控制（2-3小时）

小家鼠伸指伸肌（EDL）的解剖和消化
在未补充的DMEM中准备1,000 U / ml胶原酶的消化缓冲液，并用0.22 m的icron过滤器过滤缓冲液。每个EDL肌肉需要800 µl的消化缓冲液。
将消化缓冲液中的800 µl分装到1.5 ml试管中，并盖上盖子，在37 °C 和5％CO 2 下封闭盖子30分钟，然后进行解剖以加热缓冲液并向其中注入CO 2 。
注意小号：

肌纤维对氧气非常敏感，应首先将其上使用的所有缓冲液和培养基放在培养箱中至少30分钟。在培养箱外面工作时，如果可能的话，一次不要超过5分钟。如果需要更多的时间来处理光纤，请在重新使用之前让它们在培养箱中恢复10分钟。
通过在诱导室内用5％异氟烷麻醉将小鼠牺牲，然后用CO 2 化学诱导死亡，然后进行颈脱位。
用剪刀剪掉脚踝周围的皮肤，并沿着小腿的腹侧切开，以除去鼠标后肢的皮肤。
使用一把锋利的镊子，去除覆盖胫骨前（TA）肌肉的上皮。
切掉脚踝处的TA腱，注意只切掉上腱，因为下腱属于伸指长肌（EDL）（图1A）。
使用镊子，轻轻将小腿上的TA剥开，直到打到膝盖，露出EDL。尽可能地将TA切开到膝盖附近（图1B）。
股二头肌覆盖covering骨近端EDL肌腱，必须将其去除以暴露肌腱（图1A）。
将一对锋利的镊子滑到EDL下方，并沿其长度轻轻地走动，以确保两个肌腱都暴露在外且可触及（图1B）。
在脚踝处切开远端EDL肌腱。用一把镊子将EDL垂直提起肌腱，并且不要用力拉动，将近端肌腱切得尽可能靠近膝盖。
注意小号：

切断肌腱的EDL非常重要，切入肌肉会导致大部分纤维丢失。
剖析EDL大约需要5分钟。
Pasut 等人提供了演示EDL隔离过程的视频。（2013年）。
将解剖后的EDL放入消化缓冲液中，并在培养箱中孵育一个小时，盖上盖子，同时定期颠倒试管以混合溶液。如果需要去除与纤维相关的卫星细胞，可以在此时将胰蛋白酶以0.25％的最终浓度添加到消化缓冲液中。
在消化过程中，涂层6 - 以足够的涂覆介质（10％马血清（HS）在孔板未补充的DMEM）覆盖的孔中（大约3-4毫升）的底部，至少30分钟。
注意：肌纤维非常粘，会粘在任何未涂有马血清的表面上。

用2 ml不补充的DMEM 替换涂层介质，然后将板放在培养箱中至少30分钟。
在大口径玻璃移液器上涂上HS，然后用涂料介质冲洗。使用大口径移液器将EDL从消化缓冲液转移至6孔板，并小心转移尽可能少的消化缓冲液。
注意小号：

此时，EDL肌肉仍保持完整，将位于管的底部。它有助于将试管倒置以从底部移出EDL，然后使用大口径的移液管吸取EDL。的EDL将沉到吸管尖，然后可以被转移到涂覆的6 - 在消化缓冲液一滴孔板中。
大口径的玻璃移液器可以通过用金刚石笔切割巴斯德移液器来制造，该区域开始变宽，然后用本生灯进行火焰抛光（图1C）。
用大口径移液管轻轻向上和向下吸取EDL，以解除纤维的结合。将EDL转移到随后的孔中，因为纤维被隔离以避免损坏它们（图1D-1E）。
注意：通常，从单个EDL中将隔离300多个完整光纤。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1903001--1290 VahabSoleimani 846737 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.光纤隔离的代表性结果。一后肢的A.照片5 - 周老老鼠，HIG hlighting胫前肌的位置和肱二头肌肌腱了大腿，TA和EDL肌肉。一后肢的B.照片5 - 周老鼠标，与TA去除露出EDL肌肉。C.P。用于EDL肌纤维的解离玻璃吸管的HOTO。1.未切割的玻璃移液器，黑带表示用钻石笔切割的位置。2.大口径玻璃移液器。3.小口径玻璃移液器。D.肌纤维隔离失败的显微镜图像。E.成功隔离肌纤维的显微镜图像。F.微管中活纤维的显微镜图像。G. RNA提取后，微管中单个肌纤维的显微镜图像。比例尺s = 1 mm（在D和E中）。比例尺s = 200 µm（F和G）

从单个肌纤维提取RNA
在6孔板上涂上涂层介质，然后用2 ml PBS代替。将平板放在培养箱中至少30分钟。
在小孔玻璃移液器上涂上硫化氢，并用涂料介质冲洗。使用小口径移液器将纤维转移到充满PBS的6孔板中（图1C）。
注意：可以使用本生灯将巴斯德移液器的细小部分弯曲成曲线，制成小口径玻璃移液器。火焰抛光开口的边缘（图1C）。

使用显微镜下的小口径移液器，将单根纤维转移到200 µl PCR管中，然后用P200 移液器除去PBS （图1F）。通过在显微镜下观察PCR试管，目视确认PCR试管中只有一根光纤。
准备一个10x SMART反应缓冲液（配方3）。
用10 µl 1x反应缓冲液溶解纤维。用P20移液管上下吸移光纤3分钟。将试管放在冰上5分钟，然后根据需要涡旋（图1G）。
注意：纤维永远不会完全分解，但是这样做足以提取足够量的RNA。

要除去残留的纤维片，请旋转样品，并在显微镜下可视化纤维片，然后将上清液转移至新的200 µl PCR管中。

制备cDNA文库
用不含RNase的水将样品量增加至11.5 µl。
使用DNA SMART-Seq HT试剂盒执行以下步骤：
加入1μl3 ' SMART-SEQ CDS引物II A至样品。
通过移液或轻轻涡旋混合并旋转下来。
在72 °C下孵育3分钟，然后立即置于冰上。
准备模板切换预混料。对于一个反应中使用以下试剂：0.7微升不含核酸酶的水，8微升一步法缓冲液，1μl的SMART- 小号当量HT寡核苷酸，0.5μl的RNase抑制剂，0.3微升SeqAmp DNA聚合酶，2微升SMARTscribe 逆转录酶，总体积为12.5每个反应微升。
注意：将酶最后添加到预混合物中并立即使用。

每个反应添加12.5 µl。混合并旋转。
使用以下设置将样品放入热循环仪中：
42 °C 90分钟

95 °C 1分钟

98 °C 10秒钟

65 °C 30 s

68 °C 3分钟

72 °C 10分钟

永远4 °C

注意：这是一个停止点。cDNA可以在4 °C下过夜或在-20 °C下纯化。

cDNA纯化
以1：1（v / v）的比例将AMPure XP珠子直接添加到PCR管中。充分混合，使DNA在室温下与珠子结合8分钟（图2A）。
注意：在移液之前，让AMPure XP磁珠加热至室温。使用之前，请先大力旋涡AMPure XP珠。

将试管放在磁条上，等待溶液澄清，大约5分钟（图2B）。
使用P200移液器，丢弃上清液，同时注意不要除去磁珠。用200 µl 80％乙醇洗涤小珠两次，持续20 s。
注意：在最后一次清洗时，请确保除去所有乙醇，如有必要，请使用吸气器除去管子侧面的任何残留液滴。

使用SMART-Seq HT试剂盒随附的17 µl洗脱缓冲液洗脱DNA。将缓冲液添加到试管中，充分混合直至珠子溶解，然后在室温下孵育5分钟。
注意：注意不要让珠子过度干燥。干燥后，DNA难以洗脱，导致收率低。如果珠子是干燥的，请将其置于45 °C的洗脱缓冲液中，并定期涡旋，直至看不到团块，并且珠子不会沉淀在试管底部。

将试管放在磁条上，直到溶液澄清并保留上清液（图2B）。
注意：这是一个停止点。cDNA可以保存在4 °C 或-20 °C。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1903001--1290 VahabSoleimani 846737 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.准备排序测序库的代表性结果。A. 在溶液中带有AMPure 珠的0.2 ml微管的照片。B. 用磁力架从溶液中分离出带有AMPure 珠的0.2 ml微管的照片。C.适当大小的测序ready文库的琼脂糖凝胶。泳道1中显示了一个100 bp的DNA阶梯。D.由单纤维制成的RNA-Seq文库的典型生物分析仪谱。

准备排序就绪的库
使用Quant-IT PicoGreen dsDNA分析试剂盒对样品进行定量。
注意：通常可获得20 至100 ng 的总cDNA产量。

在微管中的1.25 µl水中制备250 pg 单纤维cDNA。
注意：准确定量cDNA浓度很重要。起始材料的量可以改变文库片段的大小。DNA过多会产生较大的片段，而DNA太少则会导致在选择大小时丢失的小片段。

使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒，将2.5 µl TD缓冲液和1.25 µl ATM加入混合物中，混合并旋转。
在55 °C下孵育5分钟。
从火上移开，加入1.25 µl NT，混合并旋转。
注意：在标记反应之后（步骤E 4 ）直接添加NT缓冲液以使Tn5转座酶失活，因为此时酶仍处于活性状态。

将样品在室温下孵育5分钟。
要扩增您的文库，请添加1.25 µl n i7适配器一个ND 1.25微升在i5适配器和3.75微升的NPM。涡旋并旋转。
注意：合并排序适配器时，必须注意确保选择i5和i7 对于所使用的音序器类型（两个或四个通道），adapt or r s是颜色平衡的。简而言之，目标是在衔接子池的每个核苷酸位置的两个颜色通道（红色和绿色）中都有信号。例如，在一个双通道系统NextSeq 500上，T显示为红色，C显示为绿色，A在两个颜色通道中均出现，而G为无色。在这种情况下，在单个核苷酸位置，G必须与至少一个A或T和C的混合物合并在一起。在四通道系统的情况下，适用相同的规则，但A和C都出现如红色，T和G均显示为绿色。有关两通道和四通道系统上的测序池的更多信息，请访问：

https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences-1000000002694-11.pdf

https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf

运行中使用以下步骤PCR程序：
72 °C 3分钟

95 °C 30秒钟

95 °C 持续10 s

55 °C 30 s 12循环

72 °C 30秒钟

72 °C 5分钟

永远10 °C

注：牛逼他是一个停止点。

纯化和尺寸选择
将AMPure XP珠粒以样品体积的0. 85x（v / v）比直接添加到PCR管中。充分混合并在室温下孵育8分钟。
注意：此比率将删除小于200 bp的片段。

将试管放在磁条上，等待溶液澄清，大约5分钟。
丢弃上清液。用200 µl 80％乙醇洗涤小珠两次，持续20 s。
注意：在最后一次清洗时，请确保除去所有乙醇，如有必要，请使用吸气器除去管子侧面的液滴。

通过添加Nextera XT试剂盒附带的20 µl重悬缓冲液洗脱DNA片段，并充分混合直至珠子溶解。在室温下孵育5分钟。
将试管放在磁条上，直到溶液澄清并保留上清液。
使用Quant-IT PicoGreen dsDNA分析试剂盒对样品进行定量。
注意：通常我们的终浓度为4-7 ng / µl。

储存在-20 °C 直至准备测序。

质量控制
在制备cDNA文库后运行标记基因的qPCR，以评估RNA的质量。
注意：这里我们使用Myf6作为阳性对照，使用Pax7作为阴性对照。但是，肌纤维中表达的任何基因都可以用作阳性对照，而任何未表达的基因都可以用作阴性对照。

要验证标签和文库大小，请在含dsGreen 的1.25％琼脂糖凝胶上运行20 ng样品（图2C）。
注意：使用前，仅运行2 µl已按1：2稀释的DNA阶梯，以防止从文库中洗出信号。

在生物分析仪上运行测序准备好的文库，以评估文库的大小和浓度（图2D）。

数据分析

遵循标准的RNA-Seq分析流程。

菜谱

消化缓冲液
以1,000 U / ml的浓度将胶原酶溶解在DMEM中
用注射器和0.22 µm过滤器过滤溶液
加入胰蛋白酶至终浓度为0.25％
新鲜使用，不要存放
涂料介质
将马血清（HS）加入DMEM，终浓度为10％
涂层介质可以存储在4 °C 并多次重复使用
SMART-Seq反应缓冲液
通过向SMART-Seq试剂盒提供的19 µl 10x裂解缓冲液中加入1 µl RNase抑制剂，制备10x反应缓冲液。
制备通过加入1微升10X反应缓冲液1X缓冲液至9微升RN的一个SE游离水
TAE缓冲区
通过将242 g tris碱，57.1 ml冰醋酸和41.2 g Na 2 EDTA · 2H 2 O溶于1 L dH 2 O中来制备50x储备液
将50倍原液稀释为1倍工作液

致谢

该项目的资金由加拿大卫生研究院（CIHR）[PJT-15087]和自然科学与工程委员会（NSERC）对VDS的发现拨款提供。

该协议受益Pasut ，等人。2013年，用于隔离单个肌纤维和Picelli 等人。（2014 ）适用于SMART-Seq技术。

利益争夺

作者没有利益冲突要声明。

伦理

动物实验：对动物使用的所有程序均已获得麦吉尔大学动物护理委员会（UACC）的批准（协议编号2014-7512，有效期为2017年7月1日至2020年7月1日）。

参考文献

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