材料和试剂

用料
1. 12厘米x 12厘米方形培养皿
2. 9厘米x 9厘米玻璃培养皿（NORMAX，货号：5058546）
3. 显微镜载玻片
4. 封口膜（Merck，目录号：P7668）
5. 玻璃底盘（体外科学公司，目录号：D35-20-1-N）
植物材料：拟南芥 Columbia-0（Col-0）
在22°C的16 h光照/ 8 h黑暗光照条件下，在培养室中种植植物（上午7:00开启灯光，下午11:00关闭灯光）。选择处于最佳花卉生产阶段的植物（即），选择主花序茎上有超过5个长角果的植物，不要选择花芽少的老植物（图1A）。 >

图1.在固态花粉萌发培养基上的花粉萌发过程拟南芥花粉。 A. 6-8周大拟南芥，上面放着花，可以用来收集花粉。比例尺= 2厘米。B.制备花粉发芽培养基和湿盘用于花粉发芽。C.轻轻浸入花以将花粉散布在固体花粉萌发培养基的表面。D.在28°C下培养2 h后，花粉管的图像。比例尺= 200μm。插图是一个花粉管，长度达到〜180μm。比例尺= 50μm。花粉管已准备好用于以后的固定和用鬼笔环肽染色。
化学试剂
1. 氯化钙（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
2. 硝酸钙（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：C1396）
3. 硫酸镁（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
4. 硼酸（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
5. 蔗糖（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：V900116）
6. 琼脂糖（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：V900510）
7. 氢氧化钾（Merck / Sigma-Aldrich，目录号484016）
8. LatrunculinB（LatB）（Merck / Calbiochem，目录号：428020）
9. 二甲基亚砜（DMSO）（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：D2438）
10. 3-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：M2786）
11. Trizma（Merck / Calbiochem，货号：V900483）
12. 氯化钠（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：V900058）
13. Nonidet P-40（NP-40）（IGEPAL CA-630）（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：I-8896）
14. Alexa Fluor 488鬼笔环肽（Thermo / Invitrogen，目录号：A12379）
15. 甲醇（Merck / Sigma-Aldrich，目录号：494437）
16. Milli-Q水（默克）
17. 花粉发芽培养基（见食谱）
18. Tris缓冲盐水（TBS）（请参阅食谱）
19. 储备液（请参阅食谱）
20. 带有Milli-Q水的单个库存（请参阅食谱）

设备

奥林巴斯FV1000S或等效的共聚焦显微镜
奥林巴斯CX23或同等显微镜
宜恒GHP-9050或同等温度的恒温培养箱
4°C和-20°C冰箱

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ 版本1.52n）
R程序（ http://www.r-project.org ）

程序

拟南芥花粉萌发培养基的制备（图1B）
1. 用Milli-Q水准备单独的原料（配方1）。
2. 准备100毫升拟南芥液体花粉发芽培养基（PGM）（配方2）。将30 ml液体PGM转移到另一个锥形瓶中以制备固体PGM。用微波将琼脂糖融化，然后将培养基均匀地分散到两个或三个9 cm x 9 cm的玻璃培养皿中。
  注意：
  1. pH在6.85-7.0时起作用。避免添加过量的KOH。
  2. PGM可以在4°C下3天内使用。旧的PGM将大大降低发芽率。
  3. 请记住在融化琼脂糖之前和之后记录PGM的重量。蒸发水量可以通过两个记录之间的差异来量化。再加Milli-Q水代替蒸发的水。
  4. 确保放置培养皿的冷却表面是水平的。
3. 将固体PGM切成1厘米x 1厘米的小块。将中片放在封口膜上，然后将中片和封口膜一起移到显微镜载玻片上。
4. 将显微镜幻灯片放入潮湿的12 cm x 12 cm方形培养皿中。在下面放置两个显微镜载玻片，以避免水污染。
花粉收集和花粉萌发
1. 在上午9:30到凌晨12:00期间收获新鲜的开张的拟南芥花，并将其置于室温下。存放时间不超过1小时。
2. 轻轻地将拟南芥花浸在培养基上以传播花粉（图1C）。为了观察花粉粒，从20多个拟南芥花中采集花粉粒以获得更高的密度。为了观察花粉管，从10朵新鲜的拟南芥花中采集花粉粒就足够了。
3. 要使花粉发芽，请将培养基在28°C下孵育2小时。花粉管适合进一步观察或固定在约200μm处（图1D）。
用鬼笔环肽与荧光染料偶联进行肌动蛋白染色（视频1）

视频1.花粉粒和花粉管固定和肌动蛋白染色的典型程序
1. 根据产品规格，将几种化学品溶解在溶剂中，并作为储备液存储（配方3）。
2. 要使用LatB处理花粉细胞，请将LatB稀释到液体PGM中至某些浓度，例如 eg ，150 nM或100 nM。考虑到花粉管中的肌动蛋白结构对LatB的应用比对花粉颗粒更敏感，通常将100 nM LatB应用于花粉管，将150 nM LatB应用于花粉颗粒。与LatB孵育30分钟后，花粉细胞用MBS固定。使用PGM中的DMSO作为对照。
3. 在28°C下用300μMMBS固定花粉细胞1 h。为每个切片添加100μlMBS-PGM。
4. 去除MBS-PGM，并通过PGM中的0.05％NP-40、150μMMBS渗透花粉细胞10分钟。
5. 用TBS + 0.05％NP40（配方4）洗涤样品3次。每次在样品上保持100μlTBS + 0.05％NP40 10分钟。
6. 将TBS中的200 nM Alexa Fluor 488鬼笔环肽在潮湿的方形培养皿中于4°C过夜过夜染色。30μl鬼笔环肽缓冲液足以用于每个切片。
7. 用TBS观察前先清洗样品。
  注意：
  1. PGM中DMSO的浓度应低于1％。
  2. 始终注意样品的形态。花粉粒爆裂，花粉管尖端膨大和花粉管爆裂，可能表明缓冲液不足。
  3. 在步骤C6更换新的封口膜可以避免缓冲液从固态PGM滑落。
  4. 始终避免将染料暴露在强光下。加入染料后，在锡箔纸上盖上方形培养皿。
激光扫描共聚焦显微镜观察肌动蛋白丝
1. 将固体PGM碎片安装到玻璃底盘上，以配备100x物镜（1.4的数值孔径）的Olympus FV1000MPE多光子激光扫描共聚焦显微镜成像。
2. 用488 nm氩激光激发样品，并收集505-605 nm波长的发射光。将花粉粒和花粉管放大2倍，以0.5μm的步长成像光学切片。
  注意：要进行图像量化，所有图像中的采集参数必须相同。避免过度曝光。

数据分析

为了量化花粉管和花粉粒中肌动蛋白丝的数量和组织，代表性结果见图2。

将原始图像（ ie ，奥林巴斯显微镜的oib文件）导入ImageJ软件（ http：/ /imagej.nih.gov/ij/ ；版本1.52n）。可以在单个光学切片中区分丝状结构（图2Aa，图2Ba）。
定量荧光强度以确定花粉粒和花粉管中丝状肌动蛋白的相对含量。通过ImageJ“ Z项目”功能执行Z堆栈图像的最大强度投影（图2Ab，图2Bb，图2Cb）。通过“选择”菜单下的“指定”功能，在花粉管尖端选择一个5μmx10μm的区域（图2Ab）。使用“多边形选择”功能选择花粉粒的整个区域（图2Bb，图2Cb）。与未经处理的花粉粒中的肌动蛋白丝相比，肌动蛋白丝在LatB处理下变得破碎和解聚（图2Ca-2Cb）。从20多个花粉管或30多个花粉粒中测量所选区域的平均灰度值，以获得平均荧光强度。肌动蛋白丝的数量可以通过测量荧光强度来量化，并且在LatB处理的花粉粒中显着减少（图2D）。统计分析由带有R程序的学生 t -检验（ http：// www .r-project.org ）。
通过“线”工具量化肌动蛋白电缆与花粉管生长轴之间形成的细丝长度和角度，以分析肌动蛋白的结构。对相邻的3或4个切片进行“最大强度投影”，以方便区分各个细丝。在半投影图像的切片中测量角度和长度。绘制数据并使用R程序进行内核密度估算（ http://www.r-project.org ）（图2Ac-2Ad）。

图2.花粉管和花粉粒中肌动蛋白结构的观察和定量。 A. a），花粉管的Z切片光学图像，z步长为0.5μm。各个肌动蛋白丝可以分为多个切片，分别以绿色，蓝色和红色点标记。A.b），最大强度的花粉管投射在（a）中。可以从这类图像中测量荧光强度，以指示丝状肌动蛋白的相对量。黄色框表示花粉管顶点和子顶点的肌动蛋白丝。花粉管的生长轴用红线表示。比例尺= 5μm。A. c），黄色方框区域内肌动蛋白丝长度的直方图。A. d），肌动蛋白丝与黄色方框区域中的生长轴之间形成的角度直方图。B. a），花粉晶粒的光学Z切片图像，z步长为1μm。B.b），（a）中最大强度的预计花粉粒。将测量黄色圆圈区域的荧光强度。比例尺= 5μm。C.a），经过150 nM LatB处理后的花粉颗粒的光学Z切片图像。以1微米的z步长显示图像。C.b），（a）中所示的最大强度的预计花粉粒。测量了黄圈区域中鬼笔环肽染色的荧光强度。比例尺= 5μm。D.经LatB处理和未处理的花粉粒的荧光强度定量。 n = 30，** P ＆lt; 通过学生的 t -检验为0.01。

菜谱

带有Milli-Q水的单个股票
100 mM CaCl 2
100 mM Ca（NO 3 ） 2
100 mM MgSO 4
1％H 3 BO 3 （wt / vol）
保持库存在4°C并在6个月内使用
花粉发芽培养基
1 mM CaCl 2
1毫米Ca（NO 3 ） 2
1 mM MgSO 4
0.01％H 3 BO 3 （wt / vol）
18％（wt / vol）蔗糖
用KOH调节pH值至6.85-7.0
对于固体PGM，添加0.8％琼脂糖
储备液
100 mM MBS（在DMSO中）
5 mM LatB（在DMSO中）
6.6μMAlexa Fluor 488鬼笔环肽（在甲醇中）
等分试样并将其储存在-20°C的冰箱中，以避免重复的冻融循环
4. Tris缓冲盐水（TBS）
50 mM Tris（从1 M的原液中稀释，pH 7.4）
200 mM氯化钠
400 mM蔗糖

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（31671390和31970180）的资助以及华中农业大学的启动资金的支持。该协议改编自以前发表的著作（Wu等，2010； Zhang等，2010）。

利益争夺

作者宣称，他们与这项工作没有利益冲突。

参考文献

曹丽娟，赵敏敏，刘超，董慧敏，李WCC和任慧敏（2013）。 LlSR28通过影响丝状肌动蛋白动力学参与花粉萌发。摩尔植物 6（4）：1163-1175。
Chang，M.和Huang，S.（2015年）。拟南芥 ACT11调节肌动蛋白周转率以促进花粉萌发并维持正常速率 Plant J 83（3）：515-527。
Chen，N.，Qu，X.，Wu，Y. and Huang，S.（2009）。花粉管中肌动蛋白动力学的调控：肌动蛋白聚合物水平的控制。植物生物学杂志51（8）：740-750。
Cheung，AY和Wu，HM（2008）。花粉管中极性细胞生长机制的结构和信号网络。植物生物学年鉴（Annu Rev Plant Biol） 59：547-572。
刁明（Diao M.），李新（X.Li.）和黄伟（Huang S.）（2019）。拟南芥 AIP1-1通过促进根尖肌动蛋白丝的组织来调节其组织花粉管的周转率。中国科学生命科学。
傅燕（2015）。花粉管中的细胞骨架。 Curr Opin Plant Biol
Gebert，M.，Dresselhaus，T。和Sprunck，S。（2008）。拟南芥中的F-肌动蛋白组织和花粉管尖端生长取决于配子体特异性犰狳重复蛋白ARO1。植物细胞 20（10）：2798-2814。
不列颠哥伦比亚省长臂猿（Gibbon），DR科瓦尔（Kovar）和CJ Staiger（1999）。 Latrunculin B对花粉萌发和试管生长有不同的影响。植物细胞 11（12）：2349-2363。
贾辉（H.，Li，J.），朱剑（J.），范婷（T.，T.），钱大龙（D.） 2013）。拟南芥 CROLIN1是一种新型植物肌动蛋白结合蛋白，在交叉中起作用链接并稳定肌动蛋白丝。 J Biol Chem 288（45）：32277-32288。
Jiang，Y.，Chang，M.，Lan，Y. and Huang，S.（2019年）。花粉管中CAP1介导的顶端肌动蛋白聚合的机理。 Proc Natl Acad Sci US A 116（24）：12084-12093。
江Y，王建，谢Y，陈北，黄小（2017）。 ADF10通过促进花粉管的周转率和有序性来塑造顶基肌动蛋白丝的整体组织。 J Cell Sci 130（23）：3988-4001。
Lan，Y.，Liu，X.，Fu，Y. and Huang，S.（2018年）。拟南芥 I类福尔马汀在花粉管尖端控制膜起源的肌动蛋白聚合 PLoS Genet 14（11）：e1007789。
Liu X，Qu，X.，Jiang，Y.，Chang，M.，Zhang，R.，Wu，Y.，Fu，Y. and Huang，S.（2015）。 Profilin调节顶端肌动蛋白聚合，以控制极化的花粉管生长。摩尔植物 8（12）：1694-1709。
McCormick，S.（2013年）。花粉。 Curr Biol 23（22）：R988 -R990。
Qu X，Jiang Y，Chang M.，Liu X.，Zhang R. and Huang，S.（2015）。花粉管中肌动蛋白细胞骨架的组织和调控。前部植物科学5：786。
Qu X.，Zhang H.，Xie Y.，Wang J.，Chen N. and Huang，S.（2013）。拟南芥 villins促进花粉管尖端的肌动蛋白更新并促进构建肌动蛋白项圈。植物细胞 25（5）：1803-1817。
屈旭。，张荣。，张明。，刁明。，薛燕。，黄胜（2017）。顶端肌动蛋白丝的组织创新推动了花粉管的快速生长和转动。摩尔植物 10（7）：930-947。
任华和项颖（2007）。肌动蛋白结合蛋白在花粉管生长中的功能。原生质体< 230（3-4）：171- 182。
Staiger，CJ，Poulter，NS，Henty，JL，Franklin-Tong，VE和Blanchoin，L.（2010年）。花粉中肌动蛋白结合蛋白对肌动蛋白动力学的调控。 J Exp Bot 61（7）：1969-1986。
Vidali，L.，McKenna，ST和Hepler，PK（2001）。肌动蛋白聚合对于花粉管的生长至关重要。分子生物学细胞 12（8）：2534-2545。＆nbsp;
Wu，Y.，Yan，J.，Zhang，R.，Qu，X.，Ren，S.，Chen，N. and Huang，S.（2010）。拟南芥 FIMBRIN5是肌动蛋白集束因子，对于花粉萌发和花粉管生长。植物细胞 22（11）：3745-3763。
Zhang，H.，Qu，X.，Bao，C.，Khurana，P.，Wang，Q.，Xie，Y.，Zheng，Y.，Chen，N.，Blanchoin，L.，Staiger，CJ and Huang ，S。（2010）。拟南芥 VILLIN5是肌动蛋白丝捆绑和切断蛋白，对于花粉管正常生长。植物细胞 22（8）：2749-2767。
Zhang，M.，Zhang，R.，Qu，X. and Huang，S.（2016年）。拟南芥 FIM5修饰顶端肌动蛋白丝并调节其在花粉管中的组织 J Exp Bot 67（11）：3407-3417。
Zheng Y，Xie Y，Jiang Y，Qu，X. and Huang，S.（2013）。拟南芥肌动蛋白解聚因子7切断肌动蛋白丝并调节肌动蛋白电缆的周转量促进花粉管正常生长。植物细胞 25（9）：3405-3423。＆nbsp;
朱健，南庆，秦涛，钱大千，毛涛，袁升，吴新武，牛玉成，白庆安，安国良和向Y（2017）。由拟南芥 ACTIN脱聚因子5重塑的高级肌动蛋白结构很重要花粉萌发和花粉管生长。摩尔植物 10（8）：1065-1081。