材料和试剂

马terials
移液器Ť IPS
玻璃盖玻片，直径18毫米，厚度0.16毫米（VWR，目录号：VWRI631-1580）
50毫升管
1.5 ml管
12孔板

试剂种类
Dulbecco的改良Eagle's Medium（DMEM）-高葡萄糖（默克公司，目录号：D5671，在4°C下储存）
胎牛血清，FBS（Sigma-Aldrich ，目录号：F7254，储存在-20°C）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich ，目录号：G854 0，储存在-20°C ）
青霉素/链霉素100x（Euroclone ，目录号：ECB3001，储存在-20°C ）
的TransIT ® -LT1 transfec 灰试剂（Mirus公司生物LCC 。，反式IT ® ，目录号：mir2305，存储在4℃下）
乙二醇- 双（2-氨基乙基醚） - N，N，N'，N' - 四乙酸，EGTA（Sigma公司-Al系drich ，目录号：E4378 ，存储吨室温，RT ）
的CaCl 2 溶液，1 M（Sigma-Aldrich公司，目录号：21115 ，存储在RT ）
NaCl（Sigma-Aldrich ，目录号：S1679，储存RT ）
氯化钾（Sigma-Aldrich ，目录号：P9333 ，储存t RT ）
MgCl 2 溶液，1 M（Sigma-Aldrich ，目录号：63069，在RT储存）
KH 2 PO 4 （西格玛奥德里奇，目录号：P5655，在RT存放）
HEPES（Sigma-Aldrich ，目录号：H3375，在RT存放）
葡萄糖（西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：G7528 ，存放在RT ）
Trizma Base（Sigma-Aldrich ，目录号：T6066 ，存放在RT ）
组胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich ，目录号：H7250 ，粉末：储存在4°C ）
Thapsigargin （Sigma-Aldrich ，目录号：T9033 ，储存在-20°C ）
从环匹阿尼酸青霉cyclopium ，CPA（Sigma-Aldrich公司，目录号：C1530 ，储存在-20℃下）
来自Streptomyces离子霉素钙盐conglobatus （Sigma-Aldrich公司：，目录号I0634 ，储存在4°C，DMSO-溶解粉末：储存在-20℃下）
洋地黄皂苷（Sigma-Aldrich ，目录号：D5628，存放在室温; DMSO库存：存放在-20°C ）
羰基氰-4-（三氟甲氧基）苯基hydr ，FCCP（Sigma-Aldrich ，目录号：C2920 ，在4°C下存储; DMSO库存：在-20°C下存储）
咖啡因（Sigma-Aldrich ，目录号：C0750；在RT储存）
牛血清白蛋白，BSA（Sigma-Aldrich ，目录号：A7906，在4°C储存）
琥珀酸（Sigma-Aldrich ，目录号：S7501，在RT存放）
质粒：
pcDNA-D3cpv （addgene ，目录号：36323 ）
pcDNA-4mtD3cpv （addgene ，目录号：36324 ）
pcDNA-D3mCeruelan3 + 16
pcDNA3-D3mCeruelan3 + 16
细胞外培养基（见食谱）
细胞内样培养基（见食谱）
用于校准的细胞内样介质（请参见食谱）
用于线粒体校准的细胞内样培养基（请参见食谱）
基于K + 的媒体（请参见食谱）
0.5 M EGTA储备溶液，pH 7.4 （请参见配方）
组胺二盐酸盐（见食谱）
Thapsigargin （请参阅食谱）
每次转化费用（请参见食谱）
碘霉素钙盐（请参阅食谱）
洋地黄皂苷（请参阅食谱）
FCCP （请参阅食谱）

设备

移液器
玻璃瓶
对于溶液制备：
搅拌器
浴
用于FRET成像（图1）
带有电动二向色镜架的荧光显微镜（倒置显微镜中的徕卡DMI 6000 CS）

双通二向色镜T455lp（Chroma T echnology Corporation，T455lp）

分束器，组成：

排放过滤器HQ 480/40 M（用于ECFP，Chroma Technology Corporation ，ET 480/40）
发射过滤器HQ 535/30 M（对于YFP变体，Chroma Technology Corporation ，ET 535/30）
二向色镜515 DCXR，Chroma Technologies（Chroma Technology Corporation，515 DCXR）
注意：此协议中推荐的发射滤光片组可确保供体和受体发射之间的串扰（或渗漏）最小。过多的串扰会大大降低DR。通常，可以利用仅表达供体和受体FP的细胞并使用为FRET实验选择的滤光片组对它们进行成像，从而估算出串扰。值得注意的是，有30-40％的供体荧光进入受体通道，由于两个FP的发射光谱存在部分重叠，因此这种贡献是不可避免的。为了从数学上消除这种串扰，可以应用频谱解混（见Gordon等，1998）。

目标：40倍油性目标，HCX Plan Apo，NA 1.25 （Leica Microsystems）
LED 430纳米（Thorlabs公司，Ç atalog 号：M430L4）
注意：LED是低细胞毒性的首选光源。

建议使用CFP 激发，使用425/20滤光片（Chroma Technology Corporation，425/20 nm），以避免供体和受体交叉激发
相机：高灵敏度CCD或sCMOS 相机（IM 1.4C 酷相机Jenoptik Optical Systems连接到12位图像采集卡）
PE rfusion和温度的系统
注意：Ca 2+ 成像实验应在37°C的生理温度下进行。为了减少腔室与环境之间的温度差（可能导致焦点漂移），建议将灌注系统与温度控制器，腔室热台，物镜加热器和块状加热器组合使用以解决问题。必须使用浸入实验溶液中的热电偶探头来验证是否达到正确的温度。

蠕动泵（MINIPULS演进® 蠕动泵从吉尔森公司。，F110701）
腔体热台，（双通道温度控制器，Warner仪器，目录号：TC-344C；舞台适配器，Warner仪器，目录号：SA-20PLIXR-AL；平台接口电缆，热敏电阻和备用零件； Warner仪器，目录号：CC-28）
整体加热器（Major Science； Genius Dry Bath 培养箱，MD系列，MD-01N / MD-02N）
我正线溶液加热器（我n线溶液加热器，华纳仪器，目录号：SF-28 ）
物镜加热器（定制）
塑料管
注意：请注意，一些疏水性药物（例如离子霉素）会粘在塑料管上。要除去它们，请在含有4％BSA的水溶液中充分使用。但是，手动添加始终是这些药物的最佳选择。手动添加时必须注意一些注意事项，以实现对细胞的均匀且快速的刺激：

应该小心执行，以免改变焦点。
应迅速执行添加等于腔室总体积10％的体积的操作。
热电偶探针（Hanna Instruments，温度计K型记忆保持，目录号：HI93531）
注意：典型的灌注系统由两路蠕动泵组成。该蠕动泵允许使用两个管。流入管连接至在线溶液加热器（由双通道温度控制器控制），该加热器紧接在蝶形针之前，以允许溶液灌注到腔室中。相反，流出管是专用于从腔室中去除溶液的管。蝶形针允许使用“橡皮泥”或类似的东西将管子连接到腔体加热台上。的速度和施加在管中的电阻应调整，以保证2-3米升流/分钟，以防止细胞干燥。为了保持温度并避免焦距漂移，使用了一个与双通道温度控制器相连的热台来调节敞开式腔室。最后，如有必要，可以使用物镜加热器来避免焦点偏移。应该使用热电偶探针来设置箱体热台和在线溶液加热器的温度，以便在箱体溶液内达到37°C。

用于细胞培养
孵化器
烤箱
开放式腔室（Warner Instruments-（QR-41LP）用于18 mm盖玻片的快速释放腔室，薄型，货号：64-1944）

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图1. FRET实验的显微镜设置。基本组件突出显示。

软件

一个软件程序包到接口与一个显微镜是支持在线配给的实际时间，例如，
MetaFluor （通用成像）

TillVision （光电子学）

lidebook （SciTe ch）]

我们使用Roboscope ，一个定制软件开发由克特林Ciubotaru 在VIMM，帕多瓦，意大利。

离线分析：例如，
ImageJ的（国家机构的健康（NIH）免费; 见http://rsb.info.nih.gov/ij/）

Excel （Microsoft）或同等的数据分析程序

Origin （OriginLab Corporation）

程序

细胞培养和转染
板单元上的12孔平板与一个18毫米的玻璃盖玻片上的底部。优化板密度来达到大约40 - 60％的汇合内24 小时。
转染的细胞与所述选择的卡默莱昂当它们是在40 - 60％的汇合。对于海拉细胞，我们使用的TransIT ® -LT 1（3μ 升试剂的用于cDNA的每微克使用）作为转染试剂和1μg的cDNA（所需的体积取决于cDNA的浓度）。
24后进行实验- 48小时。

优化灌注室
如果正确设置灌注，药物灌注可确保最佳混合，并使细胞保持在新鲜和温热的溶液中。要优化灌注系统，请遵循以下提示：

大号ocate泵在相同的高度，并靠近显微镜;
ķ EEP管尽可能地短;
小号等人2-3毫升/分钟的流速;
Ť o检查灌注系统的流动，有可能一个1-2米添加升含有酚红溶液（0.3毫摩尔，在水中）到腔室，连接在所述流和出流管和灌流水。如果腔室溶液完全交换，在不到1分钟的时间内从红色变为透明，则灌注设置正确。

Ca 2+ 成像实验：SOCE激活
从培养箱中取出细胞，除去培养基，并用含1 mM CaCl 2的细胞外培养基冲洗细胞两次。
添加1米升细胞外介质的含有1mM的CaCl 2 的顶部开口的腔室中。
要聚焦并检查细胞的健康状况，请使用明场照明。使用荧光照明选择至少包含2-4个转染细胞的视野。为了使细胞在盐水中达到平衡，请在开始记录会话之前将它们与您将要使用的第一种溶液灌注2 分钟。
注意：要成像的单元格应满足的要求是：

供体和受体的荧光必须至少是背景荧光的两倍。
供体和受体的荧光不应是最亮的，因为高荧光水平（通常是背景值的7倍或更多）与表达过量探针的细胞相关，这些探针会干扰细胞的健康状态。
在我们的显微镜中，我们以200-300 毫秒的曝光时间工作，将4分档为LED强度的20-50％。但是，这些参数在很大程度上取决于实验设置，必须进行调整以满足点a和b表示的条件。

每隔20 s收集图像至少两分钟，以记录静止的[Ca 2+ ]。对于在这个协议中描述的实验中，采集速率是0.5-1 赫兹（即，邻NE图像每1或2秒）; 但是，为避免不必要的光漂白，可以将此步骤的记录速率每20-30 s减慢至一张图像。
为了触发PM 流入Ca 2+ （即SOCE激活），必须清除细胞内的存储。为了诱导存储耗尽，而不激活IP 3 Rs，通常使用SERCA泵阻滞剂。主要有两类受体阻滞剂被使用：可逆一个，即，环匹阿尼酸（CPA）或不可逆的一个即，毒胡萝卜素（TG）。CPA的最终浓度为20-50 µM ，TG的浓度为100 nM 。因此，在不含Ca 2+的，含EGTA（600μM ）的细胞外培养基中，用SERCA泵抑制剂处理细胞至少7分钟。此步骤将耗尽存储，从而允许形成STIM1点并将其易位到ORAI1所在的PM。商店耗尽既可以离线执行，即在37℃下在烘箱中，维持细胞，或在显微镜记录。在后一种情况下，用SERCA抑制剂处理细胞会导致[Ca 2+ ] ER 缓慢降低，这在胞浆和线粒体区室中[Ca 2+ ] 很小而缓慢增加。
为了允许Ca 2+ 通过ORAI1进入，然后在有或没有SERCA抑制剂的情况下，用相同的培养基灌注细胞（如果已使用可逆SERCA阻滞剂，则也应在此盐水中添加），并用A挑战。含有1.5 mM CaCl 2的溶液（图2B- 2 E）。Ca 2+的重新添加将导致胞质和线粒体区室中R的增加。
注意：如果通过离线添加SERCA泵抑制剂来实现存储枯竭，则应在37°C且无CO 2 的情况下与抑制剂进行预孵育。

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图2. Cameleon的Ca 2+ 成像。A. Cameleon 结构和功能的示意图。Ca 2+ 与CaM的结合会触发其构象变化，进而诱导CaM 与M13 的结合，迫使CFP（供体）和YFP（受体）更接近（从而增加两个FP之间的能量转移）。是。在表达胞质Cameleon D3cpv的SH-SY5Y细胞中进行代表性的SOCE激活实验。将细胞预温育与毒胡萝卜素（TG，100 纳米，所述不可逆的SERCA阻断剂）7分钟在CA 2+ 包含EGTA 600 -free外培养基μM 。实验开始灌流细胞用Ca 2+ 含有EGTA 600 -free外培养基μM 为1分钟，然后，在那里由相同的介质中而不EGTA和1.5毫米氯化钙表示2 代替。乙。用40倍油镜拍摄的荧光显微镜供体和受体荧光图像。比例尺= 10μm 。Ç 。由ROI指示的细胞减去背景的动力学供体（CFP）和受体（cpV ）荧光发射值（任意单位）的图。d 。ROI指示的细胞R值动力学图。Ë 。ΔR/ R 0 的图表示由ROI指示的细胞动力学。

Ca 2+ 成像实验：与PM无关的SOCE
从培养箱中取出细胞，除去培养基，并用含1 mM CaCl 2的细胞外培养基冲洗细胞两次。
将1 ml含有1 mM CaCl 2 的细胞外培养基添加到开孔室中。
要聚焦并检查细胞的健康状况，请使用明场照明。使用荧光照明来选择包含至少2-4个转染细胞的视野。以使细胞的平衡在盐水，灌流它们与你将启动录制会话（使用前2分钟第一溶液小号EE注意上面，步骤C3）。
每隔1-20 s收集图像至少两分钟，以记录静止的[Ca 2+ ]。对于此协议中描述的实验，采集速率为0.5-1 Hz；但是，为了避免不必要的光漂白，可以将此步骤的记录速率每20 到30 s 降低到一张图像。
由于进入Ca 2+ 的驱动力受到PM电位差异的强烈影响，从而改变了SOCE的速率和程度（Penner 等人，1993），因此评估PM电位无关的SOCE需要在细胞外进行替代。用K介质+ 基介质（其中NaCl的是异通过-osmotically取代的KCl ;参见ř ecipes细节）。在这些条件下，PM电位崩溃，从而消除了细胞之间PM电位的差异。显然，后一种协议可用于没有电压门控Ca 2+ 通道的细胞，因为如果表达它们，它们会引起大量的，独立于SOCE的Ca 2+ 流入。
如前所述，为了不依赖于PM电位而触发PM 流入Ca 2+ （即SOCE激活），必须使用CPA或TG 清空细胞内的存储。因此，在不含Ca 2+的，含EGTA（600μM ）的K + 基中等盐水中，用SERCA泵抑制剂处理细胞至少7分钟。如上所述，商店耗尽既可以离线执行，即，在烘箱中，或在显微镜记录37℃下维持细胞。

为了允许Ca 2+ 通过ORAI1进入，然后在有或没有SERCA抑制剂的情况下，用相同的培养基灌注细胞（当使用可逆SERCA阻断剂时，也应在第二种缓冲液中添加），并用含有CaCl 2 3 mM 的溶液。实际上，由于当使用基于K + 的培养基时，Ca 2+ 的驱动力也降低了，因此用于可视化SOCE 的细胞外[Ca 2+ ]必须相对于经典的SOCE激活方案增加一倍（从1.5到3 mM ）.Ca 2+的重新添加将导致胞质和线粒体区室中R的增加。

Ca 2+ 成像实验：通过IP 3 R激活释放ER Ca 2+
从培养箱中取出细胞，除去培养基，并用含1 mM CaCl 2的细胞外培养基冲洗细胞两次。
将1 ml含有1 mM CaCl 2 的细胞外培养基添加到开孔室中。
要聚焦并检查细胞的健康状况，请使用明场照明。使用荧光照明选择至少包含2-4个转染细胞的视野。以使细胞的平衡在盐水，灌流它们与你将开始记录会话之前使用2分钟的第一溶液（小号EE 注意上面，步骤C3）。
每隔1-20 s收集图像至少两分钟，以记录静止的[Ca 2+ ]。对于此协议中描述的实验，采集速率为0.5-1 Hz；但是，为避免不必要的光漂白，可以将此步骤的记录速率每20-30 s减慢至一张图像。
要仅触发ER Ca 2+ 释放（无SOCE贡献），应首先用不含Ca 2+的含EGTA（600μM ）的培养基灌注细胞1分钟。
然后，通过灌注含有产生IP 3的激动剂的培养基来刺激细胞。这些药物激活G蛋白偶联受体（GPCR），从而导致磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯（PIP 2 ）水解为IP 3 和二酰基甘油（DAG）。生成的IP 3 介导了IP 3 Rs 中Ca 2+ 的释放，从而降低了ER中的[Ca 2+ ]，从而引起了细胞质和线粒体区室中[Ca 2+ ]的瞬时增加。根据细胞类型，可以使用不同的药物引发IP 3 Rs激活。对于HeLa细胞，我们使用组胺在10-100μM的终浓度（F IG URES 3A- 3 F），其在包含EGTA，相同的介质，而不会激动剂灌注1分钟后的胞外介质灌注。100μM的组胺的使用确保的最大刺激IP 3 - [R 。该药物应在含有EGTA 600 µM或CaCl 2 1 mM 的细胞外培养基中以20 mM的终浓度新鲜制备（图3G- 3 J）。
去除刺激，在没有激动剂的情况下灌注盐水。

Ca 2 +- 成像实验：ER 通过RyR 激活释放Ca 2+
从培养箱中取出细胞，除去培养基，并用含1 mM CaCl 2的细胞外培养基冲洗细胞两次。
将1 ml含有1 mM CaCl 2 的细胞外培养基添加到开孔室中。
要聚焦并检查细胞的健康状况，请使用明场照明。使用荧光照明选择至少包含2-4个转染细胞的视野。为了让细胞在平衡的盐，撒布他们采用t ，他第一个解决方案将使用2分钟开始录音会话（前小号EE注意上面，步骤C3）。
每隔1-20 s收集图像至少两分钟，以记录静止的[Ca 2+ ]。对于此协议中描述的实验，采集率e为0.5-1 Hz；但是，为避免不必要的光漂白，可以将此步骤的记录速率每20-30 s减慢至一张图像。
在可兴奋的细胞中，有可能激活RyR 并用咖啡因代替生成IP 3的激动剂。该药物应在含EGTA 600 µM或CaCl 2 1 mM 的细胞外介质中以20 mM的终浓度新鲜制备（图3G- 3 J）。到触发仅ER的Ca 2+ 释放（无SOCE投稿），细胞应首先灌注˚F 或1分钟用Ca 2+ - 游离，EGTA（600 μM ）的含介质。在含CaCl 2 1 mM 的细胞外培养基中使用20 mM 咖啡因可确保最大程度地刺激RyR 。
一旦观察到Ca 2+ 反应，便去除刺激物，在无激动剂的情况下灌注盐水。通常，1-2分钟的咖啡因灌注就足够了。

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图3. 使用含有mCerulean3的Cameleon 代替CFP的线粒体Ca 2+ 成像。自动对焦表达线粒体Cameleon 4mtD3mCeruelan3 + 16的HeLa细胞中的代表性线粒体Ca 2+ 吸收实验。细胞首先灌注在含有1mM的CaCl介质1分钟2 后跟一个的Ca 2+ 含有600 -free介质μM EGTA为同一时间。在IP 3 -依赖性ER的Ca 2+ 释放通过触发灌注100 μM 组胺（组织胺），用箭头表示。在实验结束时，进行探针校准以测量R min 和R max 。为了达到R min ，在含有EGTA（600μM ）的细胞内样培养基中用洋地黄皂苷（Dig，100μM ）渗透HeLa细胞。为了达到R max ，灌注含有5mM CaCl 2 的细胞内样培养基。一。用40倍油镜拍摄的荧光显微镜cpV 和mCerulean3荧光图像。比例尺= 10μm 。乙。由ROI表示的细胞的供体（mCerulean3）和受体（cpV ）荧光发射值（任意单位）动力学的图，减去背景。Ç 。ROI指示的细胞R值动力学图。d 。由ROI表示的细胞的ΔR/ R 0 值的动力学。Ë 。ROI指示的单元格中的R％值图。˚F 。由ROI表示的单元格中[Ca 2+ ]值的动力学。GJ。表达线粒体Cameleon 4mtD3mCeruelan3 + 16的新生大鼠心肌细胞中代表性线粒体Ca 2+ 吸收实验。将细胞在含有1 mM CaCl 2 的细胞外培养基中灌注1分钟，然后与含有20 mM咖啡因的相同生理盐水灌注以激活RyR 。摹。用40倍油镜拍摄的荧光显微镜cpV 和mCerulean3荧光图像。比例尺= 10μm 。^ h 。由背景减去ROI表示的细胞中供体（mCerulean3）和受体（cpV ）荧光发射值（任意单位）的动力学。我。ROI指示的单元格中R值的动力学。Ĵ 。ROI指示的单元格中ΔR/ R 0 值的动力学。

探头校准
协议的最后一步是指标校准，包括在无Ca 2+的条件下测量最小R （R min ）和在饱和Ca 2+的条件下测量最大R （R max ）。。这些R min 和R max 值代表探针可达到的最小FRET和最大FRET。如果已知探针的Ca 2+ 的K d ，则此步骤允许将R值转换为[Ca 2+ ]。当执行具有不同生物物理特性（即，不同的K d 和DR）的GECI之间的比较时，该协议也很有用。对于协议的这一部分，可以使用两种不同的方法。

基于Digitonin的协议：

最好的一种是在无Ca 2+的细胞内样培养基中用洋地黄皂苷进行细胞透化（图3A - 3 F）。洋地黄皂苷是甾族类清洁剂，可渗透膜，优先渗透高胆固醇含量的膜（例如PM）。最终浓度和暴露时间取决于所研究的细胞器。
透化后，用不含洋地黄皂苷的相同培养基灌注细胞，并补充EGTA（600 µM），以获得R min 。
最后，在细胞内样培养基中用饱和CaCl 2 浓度（3-5 mM）灌注细胞，以获得R max 。值得注意的是，对于线粒体探针校准，应在校准步骤的每种溶液中添加FCCP。该药物是线粒体解偶联剂，其破坏了线粒体膜电位，允许线粒体外[Ca 2+ ]与基质中的线粒体[Ca 2+ ] 平衡。最终浓度为5-10 µM。这种协调可确保线粒体完全去极化。

基于伊诺霉素的方案

第二种方法包括用5 µM离子霉素和3 mM EGTA 进行细胞处理以达到R min ，然后用10 mM CaCl 2样细胞内培养基进行处理，以获得R max 。碘霉素是一种Ca 2+ 离子载体，可将两个质子交换为一个Ca 2+ 。
通常，对R min 和R max 的准确估算需要4-10分钟的成像时间，这是R值稳定的平均时间，这意味着细胞器[Ca 2+ ]和灌注的[Ca 2+ ] 之间达到平衡。已经达到生理盐水。
笔记：

Digitonin是一种去污剂，用于使PM透化，使细胞质或细胞器内腔与灌注介质保持平衡。由于通透效率取决于细胞器的膜组成和盖玻片上的细胞密度，因此必须对每个实验评估洋地黄皂苷的浓度和暴露时间，以避免探针从成像的细胞腔中泄漏。因此，负载细胞与细胞溶质化学探针，例如，的Fluo-4（小号EE图4），并且转染的细胞与所需卡默莱昂。由于Ca 2+ 离子比化学染料小，因此洋地黄皂苷的正确浓度和暴露时间将是仅导致化学染料离开而不会影响所表达的Cameleon的位置和数量的一种。对于HeLa细胞，胞质Cameleon 使用10 µM洋地黄皂苷30 s ，线粒体Cameleon使用50-100 µM洋地黄皂素1 min ；
要校准线粒体靶向探针，必须模拟线粒体基质的独特特征。因此，由于这些细胞器内部的pH值约为8，因此建议使用细胞内样培养基，其具有20 mM Tris（代替HEPES），并且在37°C下的pH值为8。
离子霉素的使用需要注意以下几点：
在手动添加的情况下，使用的Ca 2+ 包含EGTA -free外介质，至少在[Ca的相同浓度2+ ] 存在于所述室中，以实现ř 分钟;
当EGTA在pH 7.4的介质中结合Ca 2+时，它会释放出两个质子（Marte ll 和Sillen ，1964），导致pH下降，有时会影响供体和受体发出的荧光。此外，由于离子霉素利用质子梯度来携带Ca 2+ ，因此pH的变化使离子载体转运Ca 2+ 的能力饱和。为了避免这种情况，可以通过添加碱化剂（即添加Tris-HCl）来抵消pH的变化，从而使Ca 2+ 进一步进入。
用离子霉素和EGTA处理细胞会导致ER中的Ca 2+ 释放，因此R的增加可以用胞质/核Cameleon 记录；
作为Ca 2+ 离子载体，离子霉素是饱和的（Fasolato 和Pozzan ，1989）。因此，建议将真实的R min 值与通过将细胞在含有5 µM BAPTA-AM的细胞外培养基中孵育30分钟而获得的R min 进行比较，以验证实际R min 值的实现。与EGTA相比，BAPTA-AM是一种Ca 2+ 特异性螯合剂，具有更快的动力学。
加入离子霉素和高[Ca 2+ ]来评估R max 可能导致细胞器肿胀，细胞起泡，最终导致细胞死亡。

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图4.降钙素浓度评估。AB。在装有FLUO-4 / AM的HeLa细胞中的代表性实验。首先在含有1 mM CaCl 2的培养基中灌注细胞1分钟，然后在含有EGTA（600μM ）的细胞内样培养基中用洋地黄皂苷（Dig，20μM ）透化20 s。一。用40倍油镜（激发光460 nm，LED：LZ1-10DB05; LED Engin ，Filer：ET470 / 24）拍摄的FLUO-4荧光图像，并用515 nm长通滤光镜和二向色镜记录发射（ 510 DCXR）。比例尺= 10μm 。乙。由ROI表示的细胞中FLUO-4荧光发射值（任意单位）的动力学减去背景。光盘。表达细胞质Cameleon D3cpv的HeLa细胞中的代表性实验。细胞首先灌注在含有1mM的CaCl介质1分钟2 后跟一个的Ca 2+ 含有600 -free介质μM EGTA为同一时间。在IP 3 -依赖性ER的Ca 2+ 释放通过触发灌注100 μM 组胺（组织胺），用箭头表示。在实验结束时，进行探针校准以测量R min 和R max 。为了达到R min ，在含有EGTA（600μM ）的细胞内样培养基中，用洋地黄素（Dig，20μM ）渗透HeLa细胞。为了达到R max ，灌注含有5mM CaCl 2 的细胞内样培养基。C.用40倍油镜拍摄的荧光显微镜供体和受体荧光图像。比例尺= 10μm 。D. 由ROI表示的细胞中R值的动力学。

数据分析

可以使用允许选择感兴趣区域（ROI）和测量每个ROI平均强度的任何软件来分析收集的图像。一个免费的示例是ImageJ。因此，使用ImageJ打开图像（.tiff格式），然后在背景和转染的细胞上选择ROI。每个实验应在每个时间点生成一个FRET和一个供体图像（见图1B，2A和2G）。这些数据应导出到数据处理程序，例如Microsoft Excel。
绘制所选ROI的时程荧光值。有时，应该重新分析实验，根据观察到的细胞反应选择ROI，并考虑空间异质性或细胞间差异性的区域。
将时程荧光值导入Microsoft Excel或Origin后，需要进行以下计算：
背景（bg ）校正：从每个平均荧光值中减去背景平均强度值。因此，CFP荧光将被计算为“ CFP强度减去bg ”，而YFP荧光将被计算为“ YFP强度减去bg ”（见图1C，2B和2H）。
根据这些值，可以如下计算R（见图1D，2C和2I）：
R =（YFP强度- BG ）/（CFP强度- BG ）

要放大静止状态和Ca 2+ 峰之间的差异，请根据以下公式计算ΔR/ R 0 （见图1E，2D和2J）：
ΔR/ R 0 =（R-R 0 ）/ R 0 ，

其中R 0 计算为前5次采集中测得的R值的平均值，R是每个时间点的R。

如果已经执行了校准步骤，则可以根据以下等式使用R min 和R max 将R数据转换为R％值（图2E）：
R％=（R- R min ）/ （R max - R min ）x 100。

转换的R值成的[Ca 2+ ]（图2F）使用ķ d 和Ñ 计算值原位（见表1中Greotti 等人。，2019和Ť 能够4帕尔默等人。，2006）。如果使用的Cameleon 未就地校准，则不建议进行定量分析。
如果雇用的Cameleon 具有单个K d ，则使用以下方程式：
[Ca 2+ ] = [ K d n （（R- R min ）/（R max -R））] 1 / n ，

其中n 是希尔的系数；

对于4mtD3mCerulean3 + 16（图2F），使用的参数是Greotti 等人发表的参数。，2019，即，在ķ d 是6.18 μ中号中，n为0.68时，[R 分钟是1.3和- [R 最大为2.7。

如果所雇用的Cameleon 具有双K d ，请使用Excel中的SOLVER工具（Palmer和Tsien ，2006年）。
对于长时间的实验，请评估漂白效果。
注意：持续15到30分钟的长时间实验需要评估FPs的光漂白。可以通过在实验期间将使用的相同照度和采集条件下记录R来完成此分析。如果发生光致漂白，则观察到R随时间降低。为了校正光漂白，将通道强度乘以校正因子，然后将计算开始时的FP强度除以给定时间点的FP强度计算得出（Zal 等人，2004年）。

使用Origin Software，可以进行计算（图5）：
通过利用该插件“整合”（对于积分测量）考虑到限定的上升曲线的只有部分的曲线（AUC）下的面积的[Ca的2+ ]，估计的Ca 2+ 含量（FIGUR Ë 小号图5A- 5 B）;
通过应用插件“ differentiate”进行导数计算的吸收率（图5C）；
通过应用插件“ fit exponential”（图5D）可以得出外排率。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902864--1263 Elisa Greotti 810730 \ Figs jpg \ 5.jpg

图5. Origin软件数据分析。A.由图2C的ROI指示的细胞的R-值动力学图。红色矩形表示由Origin软件分析的曲线的一部分。乙。曲线下面积（AUC）分析的示例。在青色区域，曲线的区域突出显示为d，其中已计算了积分，并由软件详细说明了AUC的值。Ç 。流入率分析示例。黄色箭头指示用于导数计算的起点和终点。导数绘制在右侧。黄色圆圈表示最大导数，即最大流入率。D.外排分析的例子。拟合曲线为红色，红色矩形表示衰减值，将其视为流出率。

执行统计分析（可以使用Origin 软件程序）：
如果将两组进行比较，则首先使用正态性检验Shapiro-Wilk检查数据分布。
1）可以使用成对样本t - t est 分析具有正态分布的数据。

2）可以使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验（https://ccb-compute2.cs.uni-saarland.de/wtest/）分析非正态分布的数据。

三个或更多组之间的数据比较需要Bonferroni post-hoc 进行ANOVA测试。

菜谱

ñ OTES：

用于制备溶液的超纯水（25°C时的电阻率为18MΩ·cm ）。
在没有葡萄糖的情况下，以下溶液可以在+4°C下保存数周，或在-20°C下保存数月。

细胞外培养基
135毫米氯化钠

5 毫米氯化钾

1毫米氯化镁2

0.4毫米KH 2 PO 4

1毫米氯化镁2

20毫米HEPES

10 mM葡萄糖

pH 7.4，37°C

细胞内样培养基
130 毫米氯化钾

10毫米氯化钠

1毫米氯化镁2

2毫米琥珀酸

20毫米HEPES

PH 7.0，37°C

用于校准的细胞内样培养基
130 毫米氯化钾

10毫米氯化钠

1毫米氯化镁2

20毫米HEPES

PH 7.0，37°C

用于线粒体校正的细胞内样培养基
130 毫米氯化钾

10毫米氯化钠

1毫米氯化镁2

20 mM Tris

PH 8.0，37°C

基于K + 的介质
5 毫米氯化钠

130 毫米氯化钾

2 毫米氯化镁2

3 毫米CaCl 2

10 毫米HEPES

10 mM 葡萄糖

pH 7.4，37°C

0.5 M EGTA储备溶液，pH 7.4
P repare的0.5M的工作溶液在水和Tris-HCl以达到pH为7.4

工作溶液可以在+4 °C下保存，并且可以稳定保存数月

组胺二盐酸盐
P repare 100mM的在水中的储备溶液，在-20℃下等份它和存储

该储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期。

毒胡萝卜素
P 在repare在100％DMSO中的1mM储备溶液，分装并存储- 20℃

DMSO储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期

每次转化费用
P 在repare在100％DMSO中的20〜50 mM储备溶液，分装并存储- 20℃

DMSO储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期

碘霉素钙盐
P 在repare在100％DMSO中的1mM储备溶液，分装并存储- 20℃

DMSO储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期

洋地黄皂苷
P 在repare在100％DMSO中的100mM储备溶液，分装并存储- 20℃

DMSO储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期

FCCP
PR epare中的10mM储备溶液在100％DMSO（或乙醇），等分试样并贮存于- 20℃下

DMSO储备溶液最多可使用一个月，最多可进行两个或三个解冻/冻结周期

致谢

这项工作得到了以下机构的支持：意大利威尼托大区Fondazione Cassa di Risparmio di Padova e Rovigo（CARIPARO基金会）（基础设施建设和生物技术创新[RISIB项目]），意大利国务卿Consiglio Nazionale delle Ricerche（CNR）特别项目大学和研究中心（FIRB项目和欧洲生物影像项目），意大利Telethon Grant GGP16029A和Progetti di Rilevante Interesse Nazionale（PRIN）共同组成。

该协议改编自我们最近的文章（Greotti 等，2019）。

竞争利益

该作者声明没有竞争的金融利益。

伦理

按照所有废弃物处置监管时处置的废旧材料。

在就业的动物必须要执行的协议与国家指导方针和法律。

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