材料和试剂

用于神经像素套管组装

2-56A螺钉（Amazon，目录号：B00F34U238）
30AWG银线（WPI，目录号：AGW1010）
Medica L级透明硅胶（Mastersil ，目录号：912MED ）
乐泰瞬干胶495（ULINE ，目录号：S-17190）
Kapton 胶带（ULINE ，目录号：S-7595 ）
漂白

用于Neuropixels组装保护套

M6有头螺钉（Thorlabs ，目录号：SH6MS20）
M6螺母（Thorlabs，套件中的零件，目录号：HW-KIT2 / M）

手术设备

Kimwipes （Kimtech ，目录号：34120）
硅胶套（Dow Corning，目录号：3-4860）
异氟烷（Isothesia ; Allivet ，目录号：50562）
MediGel CPF（清除，目录号：H20 74-05-5022）
C＆B Metabond 不透射线L型粉（Parkell ，目录号：S396）
C＆B Metabond'B '快速基础（Parkell ，目录号：S398）
C＆B Metabond'C '通用TBB催化剂（Parkell ，目录号：S371）
OptiBond Solo Plus（Kerr，目录号：31514）
威邦（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-361931）
眼膏（橄榄球，目录号：370435）
带有异氟烷盒子的小鼠麻醉系统（Parkland Scientific，目录号：V3000PK）
二甲基亚砜
Metacam
美洛昔康（1.5 mg / ml）（请参阅食谱）
DiI 染色（请参阅食谱）

设备

用于神经像素套管组装

神经像素探针
可以在http://www.neuropixels.org/order上订购探针。对于此协议，我们建议使用“硅垫片”版本- 金属帽可能会使将探头固定到内部安装座上变得困难。

3D打印的内部安装和外部外壳（图1; https://github.com/churchlandlab/ChronicNeuropixels）
注意：我们使用具有16 µm分辨率的Stratasys Eden 260VS PolyJet 3D打印机在VeroWhite 材料中进行了打印和测试。

立体声适配器（由铝或不锈钢加工而成，设计可在此处找到：https : //github.com/churchlandlab/ChronicNeuropixels）

用于Neuropixels组装保护套

带翼形螺钉的4英寸接杆支架（Thorlabs ，目录号：PH4）
细长直角支架（Thorlabs ，目录号：AB90B）
铝面包板（Thorlabs ，目录号：MB624）
定制亚克力盒，尺寸：L24” x W6” x H8”

手术用

Charisma A1注射器（Net32，目录号：66000085）
利多卡因（注射或霜剂; 例如，阿特维斯，目录号码：NDC 0591-2070-30）
氧气瓶（Airgas的，目录号：OX USP300）
牙钻（Osada ，型号：EXL-M40）
用于微钻的0.9毫米毛刺（Fine Science Tools，目录号：19007-09）
带保温垫的T / Pump热水循环器（Kent Scientific，目录号：TP-700）（Kent Scientific，目录号：TPZ）
棉花喷头（Fisher Scientific，目录号：19-062-616）
牙科水泥
DiI （ThermoFisher Scientific，目录号：D282）
手术矛（Braintree Scientific Inc. ，目录号：SP 40815）
装有麻醉面罩的小型啮齿类动物立体定向剂（Narishige ，目录号：SG-4N）

图1. Neuropixels AMIE的示意图。A.探头座安装在3D打印的内部安装座（IM）上，并连接到机加工的金属立体声适配器（SA）上。插图：后视图，带有将IM固定到SA的螺钉。B.整个组装在3D打印的外壳（EC）中。插图：后视图。C. 前端台位于外壳的背面，弯曲部分包裹成“ S”形。D.整个组装与鼠标大脑和头骨的大小有关。EC通过水泥固定在颅骨上。硅凝胶是用来作为人工硬脑膜保护开放开颅手术。

程序

注意：我们建议您使用虚拟探针执行整个准备和植入探针的过程。

制作AgCl丝
使用镊子或剃须刀刮去银线上的绝缘层。
将银丝在100％的漂白剂中放置30分钟或直至变黑。

组装Neuropixels 支架和储物盒（未显示）
在安装探头之前，请确保您有安全的位置进行存放。我们为安装的Neuropixels存储设计了一个展示柜：

将Thorlabs细长的直角支架连接到铝制面包板上。
用翼形螺钉将4英寸接杆支架安装到直角支架上。
用定制的丙烯酸盒盖面包板。

安装探头
用＃2-56螺纹手动敲打内部安装（IM）螺孔。（SA）上的螺孔应在加工过程中攻丝，因为这是金属零件。
将SA安装在面包板上的支架中。
将IM滑到SA上。对准孔并拧入到位（图2A）。

图2.将Neuropixels探针安装到外壳中。答：内部安装架（IM）用两颗螺钉固定在立体声适配器上，探头用环氧树脂固定在内部安装架上。B.将外壳（EC）连接到面包板上，并将IM + probe 组件小心地引导到EC的内部隔室中（顶视图）。C.将医用级硅添加到柄的底部以增加额外的支撑。D.与（B）相同，但侧视图。E.将IM固定在EC上之后，就可以植入整个组件了

通过将一小撮氰基丙烯酸酯涂在IM的表面上，将Neuropixels安装到IM。用一只手轻轻地将探针放置到位（图2A）。
关键步骤：IM的表面上有两个倾斜的辐条，可以正确对齐（图1A）。PCB探针上的银色部分是应与柄的轴线对齐的部分。因此，该银色部分是探针应粘贴到IM的地方。弯曲应紧密贴合在成角度的辐条之间，并且可以将其粘贴到SA上，以使其免受干扰。让粘合剂干燥。

在神经像素上焊接参考和地面站点（有关其他信息，请参见https://github.com/cortex-lab/neuropixels/wiki/Referencing）。
将一根10厘米的准备好的AgCl导线焊接到焊接的参考/接地部位。
注意：如果要重新使用以前植入的探头，并且需要连接新的接地线，则可以选择将其焊接到PCB板或旧的接地线的末端。

用针或线将一滴MasterSil 912 Med 滴在柄和PCB板的接口上。这将加强小腿，并且在我们手中，似乎可以增加成功移植的机会（图2B）。
将IM / SA /探针组件放置在微操纵器或stereotax中。固定EC（使用胶带或蜡），使其与IC / SA /探针组件对齐。慢慢地定位IM / SA组件以使IM的翅膀滑入内皮轨道系统（图小号2C - 2E）。必须确保Neuropixels柄未与EC壁接触。该IC翼应equidistan 从每个EC轨（图吨小号2C 和2D）。
在每个机翼/导轨系统的界面上滴一滴环氧树脂或水泥，然后使其干燥。
注意：直接将任何东西施加到小腿上都是危险的；谨慎工作。

使用立体定向仪或微操纵器，将Neuropixels小腿放在盐水溶液中，然后测试采集。

植入程序
注意：小鼠应在手术前至少一天服用NSAID。我们建议口服卡洛芬（Medigel ），以避免在手术后处理小鼠。Metacam（5 mg / kg）等注射剂也可以正常工作。

用异氟烷麻醉小鼠（2％的氧气用于诱导，在手术过程中1.5％）。
准备进行手术的鼠标：在眼睛上涂抹眼部润滑剂，然后将鼠标固定在加热垫上的立体镜中。从头皮上除去头发，然后涂利多卡因。
注意：为确保正确定位探针，请确保鼠标的头骨居中并在立体定位中水平。

将Vetbond 应用于切口的边缘，以将皮肤固定至颅骨。
在头骨上画一个所需植入位置的标记。将“虚拟”移液器放入立体镜中以识别目标坐标很有用。
在接地螺钉的位置绘制第二个标记–我们已经成功地将螺钉固定在对侧皮质（图3A）以及小脑之上。
注意：在标记植入物和颅骨地面之后，可以贴上床头板。

（可选）使用Metabond胶粘剂，将床头贴固定在头骨上。
在头骨上涂上一层薄薄的OptiBond 。
关键步骤：避免开颅部位和动物皮肤。进行三个UV固化阶段，每个阶段持续30秒，并间隔30秒。

在OptiBond的顶部涂抹一圈Charisma粘合剂，避免蒙皮和接地螺钉。
关键步骤：魅力将在您的开颅手术和电极部位周围提供保护性屏障。

让魅力干燥约10分钟（图3A）。

图3.植入程序。A.植入部位，已经安装了顶杆。目标坐标被标记并被一枚魅力环包围。接地螺钉植入到目标部位的后方（也可以植入小脑上方）。B. 以约16度角将Neuropixel 降入大脑。C. 使用Metabond （后视图）将整个外壳连接到车头和骷髅头。在需要的地方添加胶带以增加外壳和头骨之间的保护。接地线向下延伸到植入物的侧面，并连接到接地螺钉。该支撑结构干燥后，将立体镜适配器卸下。D.与（C）相同，移除立体定位适配器后，侧视图。将植入物粘合到位后，将整个组件用卡普顿胶带包裹。E.用植入物使动物完全恢复。

对接地螺钉进行小开颅手术，然后将螺钉缓慢旋转到位。skul 螺钉应降低0.2- 0.35 mm，使其与大脑表面接触。
关键步骤：请确保接地螺钉不会干扰Neuropixels外壳的放置。

仔细在植入部位钻出1-2毫米的圆形开颅手术。轻轻涂抹生理盐水清洁开颅区域。
将SA / IM / EC组件附加到立体定位和大脑上方的位置（图3B）。
小心地将DiI 解决方案应用于Neuropixels柄。
关键的一步：在的DiI 解决方案将吸引Neuropixels柄，有可能拉远。我们建议执行此步骤，方法是从注射器针头中滴出一滴DiI 溶液，然后沿柄的长度缓慢移动滴剂。

使用手术矛和Kimwipes清除开颅部位多余的盐水和血液。
将立体定位上的“ Z”轴归零（如果相关），然后将小腿缓慢降低到大脑中（图3B）。
关键步骤：在植入过程中监测小腿是否弯曲。观察出血情况，必要时用手术矛吸收。在中途停止下降，以便仍可以看到开颅手术部位。
疑难解答：如果探针在没有明显弯曲的情况下不会进入大脑，请尝试稍微不同的进入位置。您也可以在插入之前稍微尝试干燥硬脑膜。
混合白色和蓝色硅凝胶（1：1），并仔细施加薄层开颅站点。这种硅凝胶有助于植入后，以保护暴露的大脑。
慢慢降低刀柄的后半部分并监测弯曲情况。观察出血情况，并用手术长矛吸收。外部组件的底部应距头骨表面几毫米。
将探头完全插入所需的深度后，将接地线缠绕在接地螺钉上。
适用Metabond 到EC和颅骨建立一个支撑结构，其将所述组件安装到颅骨（图小号3C和3D）。您可能还需要使用胶带保护EC和颅骨之间的任何剩余开口。
关键步骤：至关重要的是，没有粘合剂进入EC的内部腔体，否则这可能会与Neuropixels柄或IM结合，从而干扰记录和植入。让Metabond 干燥约15分钟。

卸下SA / IM组件上的螺钉，然后从IM / EC组件中缓慢抬起SA。
关键步骤：监视组件的每个组件，以确保SA是唯一从组件中拉出的组件。如果EC发生任何运动，请暂停并确定摩擦源。

移栽程序
用异氟烷麻醉小鼠（2％的氧气用于诱导，在手术过程中1.5％）。
从异氟烷包装盒中取出鼠标，在其眼睛上涂抹眼润滑剂，然后将鼠标以立体定位固定在加热板上。
注意：可能很难将鼠标的头部与SA完美对齐。将鼠标松动放置在耳棒中可能会很有用，以使其更容易。但是，在抬起SA / IM组件时（在下面的步骤E 7中）请确保鼠标的头部固定。

从螺钉上松开接地线（如果可能），或切断接地线（如果需要）。
将SA与IM对齐，然后慢慢降低直到螺丝孔对齐。
关键步骤：下降到IM时，请仔细观察SA，因为对准不当会在下降过程中引起拉力。这将对颅骨施加压力，可能导致出血。如果以一定角度植入组件，请确保以相同角度放下SA。

将SA拧入到位。
钻掉与IM和EC的导轨系统连接的牙科用水泥。
关键步骤：请注意不要在IM上钻掉任何塑料或对Neuropixels PCB板造成损坏。

一旦确定没有水泥将EC固定在IM上，请从EC缓慢抬起SA / IM组件。
注意：移除刀柄后，可能会出现碎屑。将小腿留在Tergazyme中，轻轻搅动以将其除去。

笔记

Neuropixels有广泛的应用。根据研究人员希望研究的大脑区域，每种方法都需要一组特定的植入物坐标和探针角度。为此，我们在补充文档中包含了原始的，可修改的设计文件。如果可能的话，我们建议您进行实践手术，以确认植入物的设计能够满足您的实验要求，并根据您的需要进行修改。

植入角度。可以针对不同角度的植入物修改以上详述的手术程序。我们已经成功完成了约16度的植入物。研究人员应为所需的记录部位确定合适的植入角度。
外壳底部。EC的设计允许研究人员在植入探针时监视小腿的位置。然而，这意味着在EC的侧面这些间隙将需要关闭植入后，无论是与水泥或胶带（图小号2C 和2D）。该间隙将根据探针的植入深度和植入角度而变化。我们建议修改外壳的底部以最适合您的需求。
增加了一个车头。头枕通常用于约束小鼠，研究人员可能还希望在此类实验中贴上头枕。此处，外壳的前部设计为在眼睛后面的前部容纳一个用于顶部的空间。尽管当前协议没有详细介绍床头植入物，但我们指出了这样做的意义。
植入过程中的记录。如果可能的话，在植入期间从探针记录是有用的。当然，研究人员应注意将手术装置（尤其是耳塞）接地，以确保接地。

菜谱

美洛昔康（1.5 mg / ml）
将0.1毫升的Metacam （1.5毫克/毫升）加入10毫升的盐水中

的DiI 染色
在DMSO中稀释0.5％的DiI

注意：尽管DMSO未获得IMEC的正式批准，可与Neuropixels探头一起使用，但它不会引起信号或探头质量的明显下降。

Acknowledg 发言：

这项工作最初发表在eLife上（Juavinett 等，2019）。

我们要感谢蒂姆·哈里斯（Tim Harris）在Neuropixels探头的开发方面的领导以及对这一项目的不断鼓励。

由Nick Steinmetz，Matteo Carandini，Andrew Peters，Adam Kampff 教授的UCL Neuropixels课程对于使该项目起步至关重要（http://www.ucl.ac.uk/neuropixels/courses）。特别要感谢Nick Steinmetz的重要反馈，代码和对Neuropixels Wiki页面（https://github.com/cortex-lab/neuropixels/wiki）的维护。

我们还要感谢Claudia Boehm和Albert Lee（Janelia 研究园区）允许我们观察他们的大鼠Neuropixels植入物。他们的方案是我们在小鼠中开发的方案的重要起点。

我们还从许多人的故障排除帮助中受益，包括Wa de Sun，James Jun，Marius Bauza 和Bill Karsh（SpikeGLX ）。

我们也感谢CSHL的本科生研究计划，该计划每年为多样化的学生群体提供资金和资源，以完成CSHL的宝贵研究经验。这个计划资助了GB在他实验室的最初夏天。

我们欢迎社区提供有关使用这些探针植入和记录方法的多样性的反馈。

利益争夺

没有一个作者有相互竞争的利益。

伦理

所有手术和行为程序均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）制定的指导原则，并已由冷泉港实验室的机构动物护理和使用委员会批准，批准号19-16-13-10-7，有效期至6月7日， 2020年。

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