材料和试剂

15 ml旋盖玻璃小瓶（Kesell ，目录号：BLP025，8包）
200 µl凝胶移液器吸头（Fisher Scientific，Basix TM ，目录号：13-611-116）
厚黑色建筑纸
香豆素540A染料（Exciton，目录号：05450）
LDS 798染料（Exciton，目录号：07980）
罗丹明590染料（激子，目录号：05901）
荧光素钠盐，一种分析标准品（Sigma-Aldrich，目录号：30181-100MG）
氯仿，CHCl 3 （Fisher Scientific，HPLC级，目录号：C607-1）
氘代氯仿CDCl 3 （Sigma-Aldrich，目录号：151858-10x0.75ML）
二甲基亚砜，C 2 H 6 OS（Fisher Chemical，ACS认证等级，目录号：151874-10x0.75）
甲醇，CH 3 OH（Fisher Chemical，HPLC级，目录号：A452-4）
LDS 798染料在CHCl 3 ：CDCl 3 （1：2）混合物中的溶液（请参阅配方）
DMSO中的香豆素540A染料溶液（请参阅配方）
罗丹明590染料在甲醇中的溶液（请参见配方）

设备

光学平台：带可调阻尼的密封孔台式（Newport，型号：RS 2000 TM ），安装在高性能层流隔离器上（4件）（Newport，型号：S 2000）
飞秒脉冲激光（InSight DeepSee Dual，Newport Spectra-Physics ）
光子计数荧光光谱仪（ISS，型号：PC1 TM ）
镀银镜（纽波特，型号：New Focus 5103 （5片））
不锈钢光学接杆（Thorlabs，目录号：TR3（4个）和TR4（7个））
标准½ 英寸直径，3英寸长支柱（Thorlabs，目录号：PH3（11个））
标准½ 英寸直径1英寸长的接杆（Thorlabs，目录号：PH1（1个））
接杆支架底座（Thorlabs，目录号：BA1（11个）和BA1S（1个））
螺栓和螺母。¼” –20硬件套件（Thorlabs ，目录号：HW-KIT2 ）
新焦点镜支架（新p ORT，目录号：9773 （5个。））
Flipper Optic Mount （新港，型号：New Focus 9891 ）
安装的消色差半波片（690 - 1 ，200纳米）（Thorlabs公司，目录号：AHWP10M-980 ）
Ø1英寸光学元件的旋转安装座（Thorlabs，目录号：RSP1（2个））
未安装的格兰激光偏振器，Ø10mm CA，未镀膜（Thorlabs，目录号：GL10P ）
SM1透镜套管安装座，用于8毫米和10毫米已安装的偏振棱镜（Thorlabs，目录号：SM1PM10 ）
安装无级变速ND过滤器，Ø50毫米，外径：0.04 - 4.0，ARC：650 - 1 ，050纳米（Thorlabs公司，目录号：MDC-50C-4M-B ）
宽带能量/功率计（Melles -Griot ，型号13PEM001 ）
直径25毫米 X45毫米FL，NIR II涂层，消色差透镜（埃德蒙光学，米Odel等：ACH-NIR 25x45 NIR-II，股票：45-802）
22毫米到25毫米内直径镜筒广告aptors，ISS配件，2块
ND New Focus反射滤镜（纽波特，目录号：5240（OD 1），5235（OD 0.5）和5233（OD 0.3））
带有步进马达的4槽滤光片轮，ISS附件
短通滤波器，633 / SP（Semrock ，目录号：BSP01-633R-25），680 / SP（Semrock ，目录号：FF01-680 / SP-25），694 / SP（Semrock ，目录号：FF02-694 / SP-25），745 / SP（Semrock ，目录号FF01-745 / SP-25 ），770 / SP（Semrock ，目录号FF01-770 / SP-25 ）
长通滤波器645 / LP （Thorlabs，货号：FGL 645 ）
RS 232串行电缆（15英尺）
微型，方形，塞子顶部专用光学玻璃比色杯，3 x 3毫米（Starna Cells ，目录号：23-3.45-SOG-3，数量6）
3毫米SOG比色皿适配器固定架（Starna Cells，目录号：FCA3，数量4）
1厘米标准GLAS 小号荧光计矩形单元（Starna 细胞，目录号：23-G-10 ，数量4）
微型旋转式磁力搅拌棒，5 x 1 毫米（Tho m as Scientific，目录号：1207Q08，数量6）
紫外/可见分光光度计（PerkinElmer，LAMBDA 950 ）
发光光谱仪（PerkinElmer，LS55 ）
200 μ 升移液管（吉尔森，米Odel等：移液器经典P200，目录号：F123601 ）

软件

OriginPro 2017 （OriginLab ，https : //www.originlab.com ）
Vinci 3 （ISS，http ://www.iss.com/ ）
LabView2018（National Instruments，https: //www.ni.com ）
可以通过向mikhail.drobijev@montana.edu发送电子邮件请求来获得用于扫描激光波长的定制Labview 程序。

程序

建立用于双光子吸收测量的光学装置
在光学平台上设置并固定飞秒激光和分光荧光计，相距约2 m 。
拆下激发灯光源（图2），从激发单色仪（图3）上取下带有两个反射镜的镜架，两个透镜（在管中）（图4和5），可选的分束器（图6）和可选的滤光片（图7）是PC1 荧光分光光度计的激发路径。还必须卸下装有第一个透镜并位于单色仪和可选分束器之间的灯管（图4）。进入样品室的第二根管（空）应保持在原位（图5）。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ 2.jpg

图2. 除去激发灯源后，PC1 ISS 荧光分光光度计的入口孔。翻转镜用于将激光束引导到功率计头中。红色虚线箭头示出了这里的激光束传播的方向和图URES 3 - 7。

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图3.从激发单色仪隔室中取出带有两个镜子的镜子支架

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图4.卸下带有准直透镜的灯管支架（放置在激发单色仪之后），并设置一个带有四个槽的ISS滤镜轮

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图5.样品室的变化。从套筒透镜支架上取下一个指向样品的聚焦透镜。将3毫米比色皿适配器插入样品和参考比色皿支架中。在左侧的排放通道中，将一个带有短通滤光镜（770 / SP）的附加适配器镜筒支架（25 mm）滑到22毫米镜筒透镜支架上。

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图6.卸下可选的分束器

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure7-MS.jpg

图7. 卸下可选的激励滤波器

断开“左发射波长”步进电机电缆与PC1内步进电机插孔的连接（图8）。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ 8.jpg

图8.将左发射波长滤光片轮与步进电机电气断开，并将激励路径中的另一个滤光片与左E 任务波长滤光片的步进电机连接

在具有4个插槽的备用电动滤镜轮（ISS配件）中，将OD = 1，OD = 0.5和OD = 0.3的New Focus ND反射滤镜分别插入插槽＃1、2和3中。将插槽4留空。
在激发单色仪之后的PC1的激发光路中，将装有这些ND滤光片的电动滤光片安装到PC1的底座上（图4和8）。
将这个滤光片轮的步进电机连接到“左发射波长”轮的步进电机插孔（图8）。
将激发偏振片放入PC1的光路内。
打开PC1和控制它的计算机。
在Vinci中创建一个文件模板，以测量左或右发射通道中荧光的激发功率依赖性（功率依赖性文件），图9。为此，转到Vinci软件中的Experiment，然后单击Single Point，然后在药物中菜单中选择强度。右键单击名为“固定参数”的块，单击“删除”选项卡，然后选择“左发射波长”框，然后单击“确定”。右键单击名为“可变参数”的块，单击“添加”选项卡，然后选择“左发射波长”功能，然后单击“确定”。在“可变参数，左发射波长”框中，单击“ 编辑列表”，然后将过滤器＃1-0.1T，＃2-0.3T，＃3-0.5T和＃4- 清空。在“时基”窗口中，选择10 s，在“迭代次数”中，选择1。将此文件另存为“ Power Dependence”。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure9.jpg

图9.屏幕截图的左上部分显示了Vinci 3模板文件，用于在左右发射通道的“样本”位置中进行功率相关性测量

在Vinci中创建一个文件模板，以在使用左发射通道的一次激光扫描中，测量PC1的参考位置中两个样品的两个光子激发光谱（一个在样品中，另一个在r 中设置），如图2所示。10.为此，请在Vinci软件中进行实验，然后单击“慢动力学”，然后在药物菜单中选择“强度”。右键单击名为Variable Parameters的块，然后添加Sample函数。在“时基”窗口中，选择1.0 s，然后在“时间”窗口中的“变量参数”中，选择0 s（开始），6,500 s（停止）和6.00（步进）。选择“每__分钟测深200分钟” 。在“ 左侧发射波长” 下的“ 固定参数”块中，在“值” 框中选择空。将文件另存为“光谱扫描”。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure10.jpg

图1 0.屏幕快照的左上部分显示了Vinci 3模板文件，用于一次扫描两个样品的光谱（在Sample和Reference位置设置）

在720 nm 下以对准模式（200 mW ）打开激光器。使用护目镜。
在激光输出（主光束）之后，立即将组装在支架中的第一块反射镜M1 置于水平位置，平行于工作台将光束转向90 ° ，见图1。
在激光束中的M1之后，首先将一个半波片和第二个Glan激光偏振器安装在旋转安装座中。确保光束以其原始高度自由通过（当光束从激光器中出来时）。
将半波片快轴旋转大约45 度（将激光偏振从水平方向变为垂直方向）。
将格兰偏振镜的偏振轴转向接近垂直位置。
在其固定器组件中使用3个反射镜（M2 - M4），将激光束引导至分光荧光计的入射孔（见图1）。使用反射镜M2和M3使光束高度接近PC1的入射孔高度，并平行于工作台。使用M3和M4将光束引导到水平面中PC1入射孔的中心。
将无级变速中性密度滤镜放在M3镜后面的光束中。
将后视镜FM放在M4之后并将其向上翻转。
将功率计放在后视镜后面的激光路径中。
将无级变速的中性密度（ND）滤轮转到最大变速箱位置。
检查激光功率MEA 用功率计sured是〜200 毫瓦。
打开连续可变ND FIL 之三衰减的力量来〜20 毫瓦。
在VINCI实验软件（ISS）中，转到“仪器控制”选项卡并打开激发快门。
在同一选项卡中，将“左侧发射波长”设置为位置4（与激发ND滤光轮的空槽相对应）。
使用反射镜M3和M4，将光束沿连接PC1入射孔中心和样品架中窗口中心的轴对准。
插入45毫米的消色差透镜成22毫米- 至- 25mm直径的适配器管（ISS附件）和滑移吨与该透镜在22毫米ISS管帽适配器，具有朝向所述样本位置面向所述透镜（图11 ）。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure11-MS.jpg

图11. 将一个45 mm消色差透镜放入样品室内的激发光路中。左：一个f =45毫米交流hromatic透镜我š 插入并固定在一个22到25毫米直径的适配器管中。右：适配器管中的消色差透镜滑过样品室内的22毫米空适配器管。

确保激光束仍指向样品架开口的中心（现在已装有45毫米透镜）。如有必要，用反射镜M3和M4稍微重新对准光束。
关闭激光。
在右侧的排放通道中，将Semrock 745 / SP过滤器插入过滤器插槽。
使用InSight GUI软件从计算机上断开Laser的连接，并通过RS 232串行端口将其连接到具有自定义LabView程序的PC计算机，以调节激光波长。
使用LabView程序打开激光器（图1 2，补充文件1 Laser Scan）。
D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure12-MS.jpg

图12 。定制LabView程序的前视图，以特定的步长和停留时间从初始波长扫描到最终波长

将激光调至850 nm。
翻转翻转镜。
使用LabView程序打开激光快门。
将激光功率调整为200 mW 。首先请确保将无级变速ND滤镜转到完全透射位置。然后，缓慢旋转半波片（紧接在激光之后坐下），直到激光功率读数为200 mW 为止。除非实验中需要更高的功率，否则请始终使用半波片的此位置。
将功率计的探头移至样品室中并进行固定（使用1英寸的立柱支架和短立柱支架底座BA1S ），以使其传感器位于激励路径的圆形开口内居中并面向激光束。使用PC1软件的仪器控制将激发偏振片设置在水平（90 °）位置。将外部格兰偏振镜的旋转偏振器旋转到最小，以调整其角度。用螺丝将其锁定在其旋转底座上。
将激发偏振器滑出激发光路。
在整个调谐范围内，在几个激光波长下校准ND滤镜。将第一激光波长设置为680 nm。通过使用Vinci中的“仪器控制”功能，将“左发射波长”滤镜的位置从1更改为4，并记录所有4个位置的功率。计算针对位置1-3测得的功率与针对位置4测得的功率之比。
重复步骤甲38，用于一组波长（的680，690，710，7 3 0，780，800，8 10 ，840，900，9 4 0，960，1 ，000，1 ，050，1060，1 ，100 ，1 ，200，1 ，在激光调谐范围为300nm）。
在“原始工作簿”中汇总数据，请参见图13 。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure13-MS.jpg

图13 。原始工作簿包含一个查找校准表，用于校准在多个激光波长下在激发路径中的滤光片轮中的ND滤光片的透射特性

关闭激光器。
从样品室取下功率计头，然后将其放回翻转镜后放回其支架。
将770 / SP过滤器插入直径为22 mm至25 mm的适配器管（ISS附件）中，并将带有过滤器的适配器滑过22mm ISS管（其中装有PC1收集透镜），以用于排放物收集。左发射通道。
在该大号EFT ë 任务˚F ILTER W¯¯ 与4个时隙（从其电动千斤顶断开）插入脚跟Semrock 633 / SP，694 / SP，和在插槽1，2 680 / SP过滤器，和3。将插槽4留空。
卸下两个用于3 x 3毫米比色杯的适配器支架（松开4个固定支架一侧的微型螺钉），并在包含4个螺钉的一侧插入矩形的黑纸带（0.9 x 4厘米），这样只有一个狭窄的狭缝〜每个支架中都保留有0.7毫米的开口，请参见图1 B 右下方。当查看固定器时，该狭缝应位于小平面的左侧。
将支架装回，用4颗螺丝将其固定在其中。

使用左发射通道测量双光子激发光谱形状
准备用于双光子光谱测量的样品。
制备样品（多达两个新样本）和参考（LDS798和香豆素540A）的储备溶液，参见ř ecipes制备的参比溶液，并添加150μ升它们的进3×3mm的光学比色皿。
使用Lambda 950分光光度计，测量所有样品的吸收光谱。在置于3毫米适配器支架中的3 x 3毫米比色皿中进行测量时，所有溶液在最大光谱范围内的光密度应在0.2-1.5范围内。
将微型搅拌棒放入参考溶液中。
初始仪器设置preparatio ñ 。样品架中的香豆素540A解决方案。在左发射通道中过滤770 / SP和633 / SP。
在全功率模式下打开激光器。
从PC计算机启动激光控制LabView程序（补充文件3 LaserTestVI3.vi）。
打开PC1 荧光分光光度计。
将用于3 x 3比色杯的适配器支架插入PC1的样品和参考支架中，以便在将适配器适配器设置为测量值时，任一适配器支架的被掩盖的一面都指向左侧发射通道（可以将参考支架设置为通过选择在达芬奇的仪器控制转塔的参考位置）。在所有测量期间，将适配器固定器固定在适当的位置。
将“样品位置”设置为测量。
在仪器控制中，开始搅拌样品和参比样品。
将带有香豆素540A溶液的3 x 3毫米比色皿插入PC1的样品架中。
手动将左发射波长滤光轮转到位置1（对应于633 / SP滤光器）。
在发射路径中滑动左发射偏振器，并将其设置在“魔角”位置（具有仪器控制功能）。
将激光波长设置为800 nm。
使用连续ND滤光片将激光功率调节至〜20 mW 。
向下翻转反光镜，将激光束发送到PC1。
确保PC1中的激发偏振器移出激发光路。
确保使用Vinci的仪器控制将激励通道中的ND滤光轮（左发射波长）设置为空位置（插槽4）。
用仪器控制打开激励百叶窗。
在取下样品室盖的暗室中，通过将装有透镜的转接器滑过22毫米管（固定），并最大化左侧的荧光强度，来调节从45毫米透镜到样品的距离发射通道PMT。
用小螺钉固定适配器的位置（相对于22毫米管）。
调整样本＃1和＃2的功率范围。首先，在样品架中样品＃1，然后样品＃2 。在左发射通道中过滤770 / SP和633 / SP（或680 / SP，694 / SP或为空）。选择第二个短通滤光片，使其截止波长大于样品＃1和＃2的荧光峰值波长。
将装有样品＃1溶液的比色杯放置在“样品”位置，而不是香豆素540A溶液。
用盖子盖上样品室。
在整个光谱2PA几个波长，测量最大信号例如，700，800，900，1 000，1100，1200纳米（使用左PMT）。
对2号样品重复相同的操作。
使用连续ND滤波器调整激光功率，以使两个样品在2PA频谱上的最大信号量约为1 x 10 6个计数。通常，此功率将在10 -100 mW 的范围内，具体取决于样品浓度和双光子亮度。
检查样品＃1和＃2在不同波长下荧光的功率依赖性。首先，在样品架中样品＃1，然后样品＃2。在左发射通道中过滤770 / SP和633 / SP（或680 / SP，694 / SP或为空）。
使用功率依赖性文件，检查样品＃1荧光的功率依赖性在光谱的短波长区域内的波长处是否为二次光（功率指数在1.95和2.05之间），在该波长下单光子激发可以起作用。通过使用20 nm（即680、700、720 nm 等）的离散步长找到信号的二次波长，以找到最短的波长。
对样品2 重复步骤B 4a。
扫描样品1和2的2PA光谱。样品＃1– i n样品位置，样品＃2– 在参考位置。在左发射通道中过滤770 / SP和633 / SP（或680 / SP，694 / SP或为空）。
将比色皿放在样品仓转盘的“样品”位置的“样品1”和“样品”的“参考”位置。
在LabVIEW文件CONTRO的扫描部分灌装激光，扫描相等的开始波长设定为最大数目在步骤B4A和B发现4 湾
计算停止波长（λ停止）采取观察为单光子吸收光谱乘以2的长波长边缘的最长可能波长并取最接近的编号，以它在数字的序列开始于680。将此数字设置为停止波长。
设置步骤等于4纳米，每STE的时间p等于42秒。
打开“光谱扫描”文件，记下有关实验的注释（样品名称和位置，使用的过滤器等），然后开始扫描。
开始激光扫描。
扫描完成后，从适配器固定器中取出装有样品的比色杯。
扫描香豆素540A溶液的2PA光谱。一个装有香豆素540A溶液的比色皿– 处于“样品”位置，另一个带有香豆素540A溶液的比色皿– 处于“参考”位置。在左发射通道中过滤770 / SP和633 / SP。
将带有比色香豆素540A在DMSO中相同溶液的两个比色皿放入转盘的“样品”和“参考”位置。
重复步骤B5 b -B5 克与波长等于在步骤980处停止B5 c和所有其他设置保存在步骤相同的B5 b -B5 f和作出关于在步骤基准音符B5 即
扫描LDS 798溶液的2PA光谱。一个装有LDS 798溶液的比色皿– 在样品位置，另一个装有LDS 798溶液的比色皿– 在参考位置。在左发射通道中过滤770 / SP。
P UT斯达康2个比色皿与LDS 798的氯仿/氘代氯仿相同的溶液，1：2，到样品中，转台的基准位置。
手动将左发射波长滤光轮转到位置4（空）。
重复步骤B5B-B5 f控制波长等于940nm的步骤开始B5 B和所有其他设置保持相同的步骤B5B-B5 f和作出关于在步骤基准音符B5 即
用OriginLab 编写的程序计算样品＃1和＃2的校正后的双光子激发光谱。
对于包含双光子原始光谱数据（.ifx ）的文件，其中在“样品”和“参考”支架中同时测量了两个样品：
在OriginLab中，创建并保存一个导入向导（“文件”>“导入”>“导入向导”），该向导会将文件打开到工作簿中，使其看起来类似于图14中显示的示例工作簿。Vinci程序保存的数据列为“时间”，“样本”，“强度”，“ IntensityStdError ”和“实时”。
将此导入向导过滤器命名为“ 2PA_sample_and_reference”。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure14.jpg

图14 。创建“ 2PA_sample_and_reference”导入向导过滤器后，Origin工作簿的外观示例

将自动分析脚本添加到该导入向导过滤器。为此，首先导入用于上述步骤的文件，选择您刚刚创建的过滤器，然后单击“下一步”直到最后一个窗口。选中“保存过滤器”以及“指定高级过滤器选项”。将其另存为新的过滤器“ 2PA_sample_and_reference_autocalculation”。单击“下一步”，这将带您进入一个窗口，以在“每个文件导入后的脚本：” 窗口中复制和粘贴脚本1（请参阅补充文件2 Origin Script）。
在弹出的窗口中填写适当的值（第一个波长，最后一个波长，波长步长，每步秒数）后，生成的工作簿应类似于以下内容（图15 ）。另外，将弹出一个图形（图16 ），显示脚本在激光稳定后自动删除点后原始数据的样子。它看起来像数据点聚集成两个不同的光谱。如果某些点的强度比其他点的强度低得多，则通常意味着脚本由于某种原因无法正常工作，因此应该手动对数据进行排序。此图（图16 ）是脚本按预期工作的重要视觉检查。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure15-MS.jpg

图15 。使用“ 2PA_sample_and_reference_autocalculation”导入向导过滤器打开文件后，最终工作簿的外观示例

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure16.jpg

图16 。该图的示例显示了脚本稳定删除激光点后脚本自动删除点后原始数据的外观。使用“ 2PA_sample_and_reference_autocalculation”“导入向导”过滤器打开文件后，将弹出该图。这是对脚本是否按预期工作的直观检查。

如果所测量的样品是用于测量设备校正功能的参考染料，则将“正确的”参考染料光谱复制并粘贴到其相应的列中（“ S 足够支架” 列为D，“ R ”参考支架为列E。）。确保复制的波长范围与测量的波长范围匹配。列F和G现在为“校正函数š 充足保持器”和' - [R 分别eference持有人。设置它们是为了将原始光谱除以正确的光谱。
合并分别与基准测得的短程校正函数中的染料香豆素540A在DMSO（λ ST 艺术- 980 nm），而LDS798在2:1 CDCL 3 ：氯仿3 （940纳米- λ 停止）到全范围校正函数（λ ST 艺术- λ 停止）。（“样品架”和“参考架”的校正功能数据应分别处理。）
首先，通过将短距离校正函数中的每一个除以940-980 nm范围内的列值的平均值，对它们进行归一化。
现在，找到两个短程校正函数在940-980 nm范围内的行值的平均值，并将其作为该范围校正函数的一部分。
创建合并的校正函数。对于λ ST 技术-936纳米范围内，与粘贴香豆素540A在DMSO中测得的归一化的校正功能。对于940 nm - 980 nm 范围，粘贴上一步的平均值校正函数。对于980 nm - λ 终止范围，将用LDS798测量的归一化校正函数粘贴在2：1 CDCl 3 ：CHCl 3中。
如果测得的样品具有未知2PA光谱，然后复制并粘贴您为样品保持器和所述基准保持器（列d为“先前测量的校正函数š 充足保持器”，E列的“ - [R eference保持器”）。确保复制的波长范围与测量的波长范围匹配。列F和G是现在经校正的2PA光谱形状在“测量样品š 充足保持器”和“ - [R eference保持器”，分别。设置它们是将原始光谱除以校正函数。

相对于若丹明590在甲醇中的红色荧光蛋白（例如，Zhao 等人，2011年描述的RGECO1 ）在1,060 nm处的双光子吸收截面的测量使用了右发射通道，并在600 nm处记录了荧光。
准备若丹明6G在甲醇中的储备溶液。将3 x 3毫米比色杯中528 nm处的光密度调整为0.2到0.3之间的一个数字。记录OD 的确切数字。
调整在3个样品的光密度X 3毫米比色皿到0.2 - 0。3 。记录OD 的确切数字。
在1将激光波长，060纳米。
在右侧的发射通道中，将偏振器滑入并使用“仪器控制”功能将其设置为魔角。
将正确的发射单色仪设置为600 nm，然后将两个2 mm的狭缝手动插入单色仪中。
将装有参考罗丹明590溶液的比色杯放入转盘的样品架中。
调整使用ND滤光器连续激光功率使得右发光强度将是50000的数量级上- 100000当激励滤光轮被设置为空的位置（＃4）。
记录此功率。
对样品溶液重复步骤C 7和C 8 。
在Rhodamine 590的右侧发射通道中运行并注册功率依赖文件。
对样品重复步骤C 10，而不改变条件。
使用OriginLab ，绘制荧光信号的功率依赖关系作为动力功能的平方和得到的比F 2，小号（λ EX ，λ REG ）/ ˚F 2，- [R （λ EX ，λ REG ）值的斜率的比率样品和参考标准品的线性拟合。
使用已知的消光系数，计算浓度比：

为了测量φ号码，稀释样品和参比溶液以具有光密度，在选定的波长（530纳米）和在0.05的范围内下降彼此相似- 在1-厘米比色皿的光0.07。记录它们各自在530 nm处的OD 值：OD S （530）和OD R （530）。
使用LS55 荧光分光光度计，在530 nm激发波长等于5 nm发射狭缝– 16 nm的激发下记录样品和参考的荧光光谱。
记录600 nm F 1，S （600）和F 1 ，R （600）的单光子信号并计算比率：

使用e q。（2），在所获得的所有值的比率的步骤C12-C16 ，和若丹明590的横截面σ 2 （1060）= 10 GM，计算样品的2PA横截面。

数据分析

的光谱曲线，所述变化也就是，当光谱在另一波长（归在一个波长的相对值的偏差例如，峰值）包含随机和系统的贡献。随机贡献来自同一样品连续扫描中激光参数的可重复性。我们已经观察到，在2-3次连续扫描中，光谱的偏差不大于4％。由于使用两次扫描（样品和参考标准品）来计算校正后的2PA光谱，因此导致6％的随机误差。系统的光谱偏差来自参考标准品2PA光谱的测量准确性。对于香豆素540A（de Reguardati 等人，2016 ）估计约为5 ％，对于LDS 798约为10％（Makarov 等人，2011）。这导致总的频谱形状误差8 ％，在短波长范围内（680 - 980纳米）和12％的长波长范围（980-13 ，00纳米）。
2PA横截面测量的误差是各个参数的等效误差的组合。（2）。铒的F RORS 2 号码从荧光强度对功率的平方曲线的线性拟合估计（通常为1％为两个F 2，S 和F 2，R ）。由一种蛋白质的12次独立测量确定了样品和参比物的差分量子产率φ 的误差，发现误差为7％。浓度的误差主要来自在样品的消光系数的测量结果的误差，等于5％（莫利纳等人。，2019）。罗丹明590的系统误差来自参考标准品2PA横截面的不确定性，为10％（请参阅“注释”部分）。因此，在正交计算出的总误差σ 2 在一个波长（1测量的样品，060 nm）的总计为15％。这转化为绝对误差σ 2 的值，在不同的测定波长小号的〜1 8 ％（莫利纳等人。，2019）。

笔记

我们使用氯仿/混合物氘代氯仿（1：2）作为溶剂用于LDS 798摆脱氯仿吸收在1 ，150纳米。我们观察到几乎纯去时没有改变染料的光谱1PA 氯仿的米ixture。
在DMSO中香豆素540A的单光子和双光子吸收光谱的形状紧密地匹配彼此的745-1的区域，000纳米，如果1PA作图单光子波长加倍（德Reguarda TI 等人，2016 ; 图17 ）。在较短的波长范围，680 - 7 45 纳米，相对2PA值中提出的（de Reguardati 等人。，2016）系统地超过1PA值。我们已经独立地测量香豆素540A在DMSO 2PA光谱，在DMSO中使用普罗丹作为参考标准（DE Reguardati 等人在680的区域中，2016。）- 800 nm，并且2PA和1PA光谱之间获得更好的相关性香豆素540A的形状，请参阅。红色和黑色的线图URE 1 7 。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure17.jpg

图1 7 。DMSO中香豆素540A 1PA 和2PA光谱的光谱形状。所述1PA光谱测量在这项工作中，黑线，和2PA SPECTR 微米（德Reguardati 等人。，2016），蓝线，被在它们的峰值归一化。所述2PA光谱的短波长部分（680 - 800纳米），红色线，在这项工作中测量，使用P 在DMSO罗丹（德Reguardati 等为标准，2016。）。

要仔细检查香豆素540A（的频谱形状甲2PA，R （λ 在大范围从680至1）函数），000纳米，我们测量了2PA SPECTR 微米罗丹明590（=若丹明6G）在甲醇与香豆素540A在DMSO中，并将其与已知的文献数据（图URE 1 8 ）。来自（Hermann and Ducuing ，1972; Makarov et al 。，2008; de Reguardati et al 。，2016）的数据以绝对横截面值的形式进行了测量（关于赫尔曼，请参见下表5的脚注a和b）和Ducuing 数据）。来自（Albota 等，1998 ; Rodriguez 等，2009 ; Rodriguez和Chiesa，2011 ; Rodriguez和Chiesa，2012）的数据被缩放为820 nm处的74 GM值，与（Makarov 等（2008 ；de Reguardati 等，2016）。的光谱由（Wakebe 和Van Keuren ，1999），最初呈现为在乙醇中的若丹明6G的相对光谱，被移位17纳米至红色（在2PA波长），并调整为在844 34 GM的值，匹配的测量（Makarov 等人，2008 ；de Reguardati 等人，2016）。在（690-960 nm）的香豆素540A吸收的几乎整个区域中，在（Albota 等，1998）和（de Reguardati 等，2016）中测量的光谱形状之间都有很好的相关性，因此我们得出结论：这些光谱代表了若丹明6G的2PA光谱的最佳近似值。这个结论是通过其他数据的到这些光谱在不同光谱区或在分离波长良好匹配的支持：赫尔曼和Ducuing 在694和1的数据，060纳米; Wakebe 和Van Keuren 数据- 在806 - 1 ，106纳米区域; 中号akarov 等。（2008 ）d ata- 在720 - 900和1 ，060 - 1 ，100个纳米区域; Rodriguez 等。（2007）数据- 在720 - 860nm的区域。

表1.正确2PA香豆素540A在DMSO中的频谱形状，具有680 - 760nm的数据通过在普罗丹校正DMSO（德Reguardati 等人。，2016）

波长

相对值

波长

相对值

波长

相对值

波长

相对值

680

0.135

760

0.376

840

0.990

920

0.523

684

0.117

764

0.408

844

0.996

924

0.478

688

0.113

768

0.445

848

0.999

928

0.434

692

0.112

772

0.483

852

1.00

932

0.390

696

0.112

776

0.522

856

0.998

936

0.348

700

0.115

780

0.561

860

0.994

940

0.307

704

0.118

784

0.600

864

0.985

944

0.268

708

0.124

788

0.639

868

0.973

948

0.232

712

0.135

792

0.678

872

0.955

952

0.199

716

0.146

796

0.715

876

0.934

956

0.169

720

0.160

800

0.751

880

0.908

960

0.143

724

0.176

804

0.786

884

0.881

964

0.120

728

0.194

808

0.819

888

0.850

968

0.100

732

0.215

812

0.851

892

0.816

972

0.0832

736

0.234

816

0.881

896

0.780

976

0.0683

740

0.256

820

0.908

900

0.741

980

0.0556

744

0.279

824

0.931

904

0.700

984

0.0448

748

0.303

828

0.952

908

0.657

988

0.0355

752

0.325

832

0.968

912

0.613

992

0.0274

756

0.350

836

0.980

916

0.568

996

0.0203

当以DMSO中的香豆素540A的2PA光谱形状作为参考时，若丹明6G在甲醇中的2PA光谱在680-750区域内显示出强烈高估的吸收率（参见图18中的空心菱形和浅蓝色线）。这可能是由于香豆素540A的2PA的高估值，如图17所示。然而，当香豆素540A的2PA光谱在680校正- 740 nm范围内与普罗丹（见表1中的值）被取为甲2PA，R （λ ）的功能，若丹明6G光谱（与图18中的三角形深绿线）相当不错的文献光谱（匹配Albota 等人。，1998）和（德Reguardati 等人。，2016）在的区域680 - 980纳米。因此，我们得出的结论是，当将DMSO中的香豆素540A的校正光谱用作680- 980 nm 范围内的参考时，在DMSO中的香豆素540A的校正后2PA光谱与A 2 PA，R （λ ）函数很好地近似。。

表LDS 798的氯仿2.纠正2PA频谱形状从936 - 1 ，300纳米; 值来自将高斯拟合到Makarov 等人的LDS 798 z扫描数据中。，2011年。

波长

相对值

波长

相对值

波长

相对值

波长

相对值

936

0.116

1028

0.410

1120

0.847

1212

0.978

940

0.124

1032

0.428

1124

0.864

1216

0.970

944

0.132

1036

0.446

1128

0.879

1220

0.961

948

0.141

1040

0.465

1132

0.894

1224

0.950

952

0.150

1044

0.484

1136

0.907

1228

0.937

956

0.159

1048

0.503

1140

0.920

1232

0.923

960

0.169

1052

0.522

1144

0.933

1236

0.908

964

0.180

1056

0.542

1148

0.944

1240

0.892

968

0.191

1060

0.561

1152

0.954

1244

0.874

972

0.203

1064

0.581

1156

0.963

1248

0.855

976

0.215

1068

0.601

1160

0.972

1252

0.835

980

0.227

1072

0.621

1164

0.979

1256

0.813

984

0.240

1076

0.641

1168

0.985

1260

0.791

988

0.253

1080

0.661

1172

0.991

1264

0.767

992

0.267

1084

0.681

1176

0.994

1268

0.742

996

0.282

1088

0.701

1180

0.997

1272

0.717

1000

0.296

1092

0.720

1184

0.999

1276

0.692

1004

0.311

1096

0.740

1188

1.00

1280

0.665

1008

0.327

1100

0.759

1192

0.999

1284

0.638

1012

0.343

1104

0.777

1196

0.998

1288

0.611

1016

0.359

1108

0.795

1200

0.995

1292

0.584

1020

0.376

1112

0.813

1204

0.991

1296

0.556

1024

0.393

1116

0.831

1208

0.985

1300

0.529

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ 18.jpg

图1 8 。罗丹明6G在甲醇或乙醇中的双光子吸收光谱（对数标度）。马卡罗夫（Makarov）等人的黑尔曼和杜翠（Hermann and Ducuing ，1972 ）的数据。（2008 ）– 蓝色圆圈，de Reguardati 等。（2016） - 淡蓝色线，以绝对值给出σ 2倍的值（见脚注a和b 表小号3-5 表5之后）。Albota 等人的数据。（1998年）– 红色圆圈，Rodriguez 等。（2009 ）– ping直角三角形罗德里格斯和基耶萨（2011 ） - 粉色左三角形，罗德里格斯和基耶萨（2012） - 粉红色的三角形向上缩放（见正文），并Wakebe 和Van Keuren （1999） - 橙色圆圈进行缩放和移动（见正文）。空心钻石显示了此处使用香豆素540A在DMSO 2PA 光谱（de Reguardati 等，2016）中得到的（标度）光谱。测得的光谱在这项工作中（缩放）相对于香豆素540A在DMSO中在740 - 1 ，000纳米区域和相对至P 罗丹在DMSO中在680 - 740nm的区域被示出暗绿色来与连续线连接的三角形。获得的光谱在这项工作中相对于LDS 798在氯仿/氘代氯仿中，通过紫色显示用实线连接的钻石。

在Makarov 等人。（2011年），使用荧光（相对于Styryl 9M [ Makarov 等，2008 ] ）和z扫描（绝对测量）技术获得了LDS 798染料在氯仿中的2PA光谱。单光子和双光子吸收光谱的形状很广，无结构，并且紧密地匹配彼此在900的区域- 1 ，300纳米，如果1PA作图单光子波长加倍（马卡罗夫等人，2011 ; 图19 ）。

D：\陈丹工作\ 1902694--1251 MikhailDrobizhev 793128 \ Figs jpg \ Figure19.jpg

图1 9 。LDS 798在氯仿中的1PA（紫色线）（此处测量）和2PA的光谱形状，绿色正方形（使用相对于苯乙烯9M的荧光技术，黑色正方形），使用z扫描和绝对方法（Makarov 等， 2011）。所有光谱均在其峰值处归一化。黑虚线表示高斯拟合到在该区域的z扫描数据从900至1 ，300纳米，其用作一个ñ 阿2 PA，R （λ 这里）函数。这个数字是改编自（Makarov et al 。，2011）。

由于z扫描数据是通过绝对方法获得的（LDS 798是主要标准），因此我们将相应的2PA形状（图1 9中的黑色正方形）用于A 2 PA，R （λ ）函数。要将A 2 PA，R （λ ）函数插值到中间波长，我们对900至1300 nm之间的实验数据使用了高斯拟合，如图1 9中的黑色虚线所示。该频谱被呈现于表2中要检查此功能的性能，若丹明590的在甲醇中的2PA光谱相对测量到LDS 798在CHCl 3 / CDCL 3 中940：（1:2）- 1140 MN 区域，请参见图1 8 。数据（紫色）与Albota 等人的光谱非常吻合。（1998年）; Wakebe 和Van Keuren （1999），以及de Reguardati 等人。（2016），并且与使用香豆素540A（深绿线）在940-980 nm范围内测得的光谱重叠良好。这证实了我们选择LDS 798作为940-1,300 nm区域光谱形状的参考标准的事实。

在双光子截面的测量，我们使用的光密度OD <0.05 在荧光波长登记和OD <0.3的吸收峰（在3毫米比色皿）。这需要以排除可能的再吸收和再排放的影响。
我们建议使用甲醇中的若丹明590作为参考标准（有关文献数据，请参见表3和4），以测量选定波长下的2PA横截面。最一致的文献数据进行收集Ñ 耳1 ，060纳米（表3）。对于这个波长我们建议使用σ 2 = 10±1 GM。

表3.罗丹明6G在甲醇或乙醇中在1,054-1,064 nm区域的双光子截面的文献数据。大多数值（第7列）在10 GM附近。平均所有11个测量值的提供σ 2 = 12±2 GM（平均值±平均值的SE）。带下划线的值是通过锁模激光器或使用消除了激光强度g （2）的二次时间相关函数的不确定性的方法获得的。在这六次测量中，最低的（4.2 GM）（Kaatz and Shelton，1999）是通过使用Hyper Rayleigh散射技术校准包括g （2）的激光特性而获得的。作者发现，这种方法给了低估的值σ 2 ，相比于具有标准校准针对单光子荧光获得的那些。因此，所建议的值σ 2 通过排除该测量和平均在7列中斜体选择的数字计算。

波长

（纳米）

溶剂

浓缩

（男）

脉冲

原版的

σ 2 （GM）

校正离子1

σ 2 （GM）

校正离子2

σ 2 （GM）

（最后）

参考

1060

C 2 H 5 羟基

不适用

ns

12.9±6

25.8±12 一

10.1±4.7 磅

1972年，赫尔曼和杜庆

1060

C 2 H 5 羟基

10 -3

60纳秒

5.5

11 个

5.5 摄氏度

布拉德利（Bradley）等人，1972年

1060

C 2 H 5 羟基

10 -4

30纳秒

26

52 个

26 ℃

Vsevolodov 等。，197 3

1060

C 2 H 5 羟基

10 -3

ps

3.6

7.2 一

7.2

布拉德利（Bradley）等人，1972年

1060

C 2 H 5 羟基

10 -6

110毫微秒

11±5

22±10 a

11±5 摄氏度

李和社，1982

1064

C 2 H 5 羟基

10 -2

连续波

12±2

48±8 天

24±4 摄氏度

卡塔拉诺和辛戈拉尼（1982）

1054

CH 3 羟基

0.2

5 ps

10±1

--

10±1

彭兹科弗和勒皮查尔（1987）

1064

CH 3 外径

2.2 10 -6

125纳秒

4.2±0.8

--

4.2±0.8

Kaatz 和Shelton，1999年

1064

C 2 H 5 羟基

10 -4

10纳秒

15±1

30±2 a

15±1 摄氏度

Rodriguez 等。，2007

1060

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

10±1

--

10±2

Makarov 等，2008

1060

CH 3 羟基

不适用

100 fs

11±1

--

11±1

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

1060

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

10±1

表4.其它σ 2倍在选定的波长的值若丹明6G的。所述σ 2点的值表示两个或更多个测量之间满意的匹配列是斜体7的推荐值σ 2 作为平均这些数字对于每个波长的计算。

波长

（纳米）

溶剂

浓缩

（男）

脉冲

原版的

σ 2

（通用）

校正离子1

σ 2

（通用）

校正离子2

（最后）

σ 2

（通用）

参考

694

C 2 H 5 羟基

不适用

ns

355±170

710±355 a

277±138 羽

1972年，赫尔曼和杜庆

694

CH 3 羟基

0.04

30 ps

180±20

--

180±20

斯珀伯（Sperber）和彭斯科夫（Penzkofer），1986

690

700

CH 3 羟基

1.1 10 -4

100 fs

136

176

--

156 e

Albota 等，1999

694

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

112±22

--

112±22

Makarov 等，2008

692

CH 3 羟基

不适用

100 fs

202±16

--

202±16

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

694

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

180±23

730

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

50±10

--

50±10

Makarov 等，2008

730

CH 3 羟基

不适用

100 fs

50±4

--

50±4

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

730

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

50

812

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

71±14

--

71±14

Makarov 等，2008

812

CH 3 羟基

不适用

100 fs

79±6

--

79±6

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

812

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

75

940

CH 3 羟基

1.1 10 -4

100 fs

7.7

--

7.7

Albota 等，1999

940

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

8.3±1.7

--

8.3±1.7

Makarov 等，2008

940

CH 3 羟基

不适用

100 fs

11.1±0.9

--

11.1±0.9

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

940

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

9.0±1.0

960

CH 3 羟基

1.1 10 -4

100 fs

12.7

--

12.7

Albota 等，1999

960

CH 3 羟基

8 10 -6

100 fs

10.9±2.2

--

10.9±2.2

Makarov 等，2008

960

CH 3 羟基

不适用

100 fs

17±1.4

--

17.0±1.4

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

960

CH 3 羟基

10 -5

100 fs

13±2

我们建议在水中使用荧光素在pH 为分子在光谱的绿色部分的荧光参考标准11（500 - 550纳米）。然后应调整方案的C部分，以测量绿色区域的荧光。表5总结了文献中的数据进行荧光素与建议的波长和σ 2倍的值。

表5.有人建议σ 2个荧光素的值在不同的波长的碱性水溶液。所述σ 2点的值表示两个或更多个测量之间满意的匹配列是斜体7的推荐值σ 2 作为平均这些数字对于每个波长的计算。

波长

（纳米）

溶剂

浓缩

（男）

脉冲

原版的

σ 2

（通用）

正确离子1 σ 2 （GM）

校正离子2

（最后）

σ 2 （GM）

参考

710

H 2 O pH11

8 10 -5

100 fs

17.3±4.4

17.3±4.4

徐和韦伯（1996）

710

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

16.5±3.3

--

16.5±3.3

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

710

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

16.9

730

H 2 O pH11

8 10 -5

100 fs

25.0±6.3

25.0±6.3

徐和韦伯（1996）

730

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

24.2±4.8

--

24.2±4.8

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

730

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

24.6

782

H 2 O pH11

不适用

100 fs

46±10

46±10

徐等，1995

782

H 2 O pH11

8 10 -5

连续（单模式）

38±10

38.0±10

徐和韦伯（1996）

782

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

46±9

--

46±9

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

782

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

43±3

802

H 2 O pH11

8 10 -5

连续（单模式）

36±10

36±10

徐和韦伯（1996）

802

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

38±8

--

38±8

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

802

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

37

842

H 2 O pH11

8 10 -5

100 fs

12±3

12±3

徐和韦伯（1996）

842

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

13±3

--

13±3

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

842

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

12.5

900

H 2 O pH11

8 10 -5

100 fs

16±4

16±4

徐和韦伯（1996）

900

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

15±3

--

15±3

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

900

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

15.5

1000

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

3.1±0.6

--

3.1±0.6

Makarov 等，2008

1000

H 2 O pH11

不适用

100 fs

3.3±0.3

--

3.3±0.3

de Reguardati 等，2016

建议条件和横截面值

1000

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

3.2

1060

C 2 H 5 羟基

10 -5

60纳秒

0.18

0.36 一

0.18 ç

布拉德利（Bradley）等人，1972年

1060

C 2 H 5 羟基

ps

0.075

0.15 a

0.15

布拉德利（Bradley）等人，1972年

1050

H 2 O pH11

8 10 -5

100 fs

0.23±0.07

0.23±0.07

徐和韦伯（1996）

1050

H 2 O pH11

3 10 -6

100 fs

0.17±0.03

--

0.17±0.03

Makarov 等，2008

建议条件和横截面值

1050

H 2 O pH11

10 -5

100 fs

0.2

表3-5的脚注：

一个倍增通过因子2以更近的σ定义为符合2 （双光子小号是neede d激发一个分子），参见徐和韦伯（1996 ）; Kaatz 和Shelton （1999 ）; Makarov 等。（2008年）。

b 乘以系数0.39以符合石英的当前参考值d 11 = 0.3 0 pm / V（相对于0.48 pm / V），请参阅Kaatz 和Shelton （1999）。

c 使用激光相干函数值g （2）= 2进行重新评估，参见Weber （1971 ）；布拉德利等。（1972年）; Kaatz 和Shelton （1999）。该因素未包含在原始分析中。

d 倍增通过因子4更近的σ的定义符合2 （2 光子s为neede d激发一个分子），参见 Xu and Webb （1996 ）; Kaatz 和Shelton （1999 ）; Makarov 等。（2008年）。

e 在690和700 nm测量之间进行内插。

菜谱

LDS 798染料在CHCl 3 ：CDCl 3 （1：2）混合物中的溶液
溶解0.1毫克的L的DS 798在0.75毫升三氯甲烷的3 在15毫升螺钉CA p 玻璃小瓶
加入1.5毫升的CDCl 3 。在磁力搅拌器上搅拌过夜。在3 mm比色皿中，最终溶液在594 nm（最大光谱）处的光密度应为OD〜1.2 。这对应于〜10 -4 M 的浓度
它可以存储在密封的小瓶中在黑暗中室温TEM perature为至少2个月
DMSO中的香豆素540A染料溶液
将0.15 mg香豆素540A溶于15 ml 旋盖玻璃瓶中的3 .3 ml DMSO中
在3 mm比色皿中，最终溶液在427 nm（最大光谱）处的光密度应为OD〜0.6 。这对应于〜10 -4 M 的浓度
可以在室温下在黑暗中密闭的小瓶中保存至少2个月
罗丹明590甲醇溶液
在15 ml 旋盖玻璃小瓶中的10 ml CH 3 OH中溶解0.05 mg罗丹明6G
在528处的最终溶液的光密度（SP ectral最大）1 N A3毫米试管应OD〜0.3。这对应于〜10 -5 M 的浓度
可以在室温下于黑暗中保存在密闭的小瓶中至少4个月

致谢

感谢Alexey Drobizhev 提供的自定义LabView程序。这项工作得到了NINDS授予MD，TEH和RSM的U01 NS0942 46和U24 NS109107的支持，以及Ruth L. Kirschtein 国家研究服务奖（RSM的编号为F31NS108593）的支持。

该方案源自Molina，RS，Qian，Y.，Wu，J.，Shen，Y.，Campbell，RE，Drobizhev ，M.和Hughes，TE（2019）了解红色遗传编码的钙离子指示剂的荧光变化。生物物理。Ĵ 。116：1873-1886。

利益争夺

作者宣称没有任何金融和非金融竞争利益。

参考文献

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