材料和试剂

用于细胞传代的聚苯乙烯培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：LBSPD1002X，或等效的）
24孔组织培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：142475，或等效产品）
12毫米1号圆形盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：MENCSC121GP或同等产品）
显微镜载玻片26 x 76毫米（VWR，目录号：VWRI631-1558或等效产品）
RAW264.7巨噬细胞样细胞系（ATCC，目录号：TIB071）
透明指甲油（Ultra3，目录号：14111130或同等产品）
RPMI 1640介质（澳大利亚龙萨，目录号：BE12-702F）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：16000044）
L-谷氨酰胺100 x （Thermo Fisher Scientific，目录号：25030-081）
4％多聚甲醛（ProSciTech ，目录号：EMS15735-100或同等产品）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：X100-500ML）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023或同等产品）
的AlexaFluor 488鬼笔环肽（Invitrogen，目录号：A12379，见Ñ OTES）
DAPI核染色（Roche公司，目录号：10236276001，或等同物，见Ñ OTES）
ProLong Diamond防褪色试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P10144，或等效产品）
Poly-D-赖氨酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A3890401或同等产品）
细胞培养基（见食谱）

一般

细胞传代耗材
15 ml锥形管
移液器吸头（10、50、100、1,000 微升）
金威普
镜头湿巾
封口膜
纸巾
浸油
卫生署2 Ø
70％乙醇（EtOH）

设备

自动化血清移液器（Thermo Fisher Scientific，S1移液器填充器，目录号：14-387-163或同等产品）
移液管（P2，P20，P100，P1000）（John Moris ，Gilson＃115209或同等学历）
精密镊子（Dumont，样式7，货号：T07-912，或等效产品）
温度和CO 2 控制的培养箱（VWR，目录号：390-2012，或等效产品）
组织培养反相显微镜
血细胞计数器
遮光染色室
注意：甲Ñ铝箔涂布的浅腔室是足够的。

蔡司AxioImager 立式荧光光谱仪显微镜（请参阅“注释”或等效说明）

软件

Zeiss Zen Blue 2.3（德国卡尔蔡司，或同等的采集软件）
FIJI图像分析程序（Schindelin 等，2012）
Ruffle量化宏（https://github.com/NickCondon/RuffleQuantification）
Microsoft Excel（或等效版本）
GraphPad Prism 8（或等效版本）

程序

细胞培养
创建您的细胞系选择的悬浮液。
使用血细胞计数器测定细胞浓度，并在组织培养基中稀释至0.1 x 10 6 细胞/ ml 的浓度（配方1）。
将一张盖玻片放入24孔组织板的每个孔中。
加入500μl稀释的细胞悬浮液（0.5×10 5 Ç 厄尔）至每个孔中。
注：d esired汇合第二天= 60％。

用镊子将盖玻片压入井底，以清除盖玻片下方形成的任何气泡。
实验前，让细胞粘附并散布过夜（至少16小时）。
注意：对于更长的治疗或瞬时转染，可能需要降低初始细胞接种密度（固定日的60％融合度是理想的）。

根据需要进行刺激/药理抑制实验。
注意：我们通常使用10-100 ng / μl的脂多糖30分钟以诱导皱纹形成。

吸出培养基并用冰冷的PBS洗涤。
用4％多聚甲醛固定细胞至少30分钟。
用室温PBS三次洗涤细胞。

染色盖玻片
将湿纸巾放入染色室的底部。
将胶片放在湿纸巾上。
从24孔板上取下盖玻片，将细胞侧朝上放在封口膜上。
在每个盖玻片上加一滴PBS。
注意：C 滑倒处应始终保持“湿”状态，以确保细胞完整性并防止脱水。

通过在每个盖玻片上滴入0.1 ％Triton X-100 滴不超过5分钟来透化细胞。
抽吸用PBS清洗盖玻片3次。
通过将储备溶液分别以1：500和1：1,000稀释到冰冷的PBS中来制备AlexaFluor 488-鬼笔环肽和DAPI（2 mg / ml）标记混合物。
将50μl的标签混合液滴在每个盖玻片附近的石蜡膜上。
从盖玻片上吸出PBS，并将盖玻片倒入标记混合物的液滴上（细胞朝下）。
在避光条件下，于室温（RT，25°C）下孵育至少30分钟。
倒盖玻片并用PBS洗涤3次。
用dH 2 O 清洗盖玻片一次以防止PBS晶体形成。
将一小滴安装介质（我们使用ProLong Diamond）放在显微镜载玻片上。
注意：为获得最佳结果，在使用之前，应先用70％的乙醇擦拭显微镜载玻片，以除去灰尘和绒毛。

用镊子从旁膜提起盖玻片，轻轻地将盖玻片的边缘靠在干净的Kimwipe纸巾上，除去多余的水。
将盖玻片槽朝下放置在滴落的安装介质上。
轻轻将镊子按在盖玻片的顶部，并吸出多余的安装介质。
用透明的指甲油将盖玻片密封到显微镜载玻片上。

影像与数据分析
使用奈奎斯特采样与能够串行光学切片的荧光显微镜，捕获3D Z-堆栈即，Apotome，共焦或宽场系统（图小号1A- 1 C）以捕获细胞和褶边的完整的3维图像。
针对每种情况获取多个视野（每个处理至少收集100个细胞）。
注意：此处的图像是使用Zeiss Axioscan 荧光立式显微镜，使用40 x 1.3 NA Plan Neofluar 物镜和Axiocam 506 CCD相机捕获的。样品用HXP 120W 白光源照明，并用Zeiss DAPI 49 / FITC 44滤光片过滤。Z-叠层物在0.2μm的间隔捕获超出两个可见的顶部和细胞的底部用5 apotome相移用于光学断层识别细胞核和褶边背侧上的中点表面（图小号1D - 1 F）。

注意：核中点偏移确定。该脚本以其原始形式通过找到横截面积最大的切片来确定原子核的中点（图1G）。在巨噬细胞中，这适当地允许对背褶的选择和分段，这些背褶仅存在于该中点之上，但是对于替代用例或不同的细胞系，可能需要使用不同的选择截止点。图1H显示了最初未通过使用核中点选择外围褶皱的情况，而是通过应用偏移（几个切片）来选择了其他外围褶皱（图1H插图，灰色箭头）。原子核中点偏移值可提供更大的灵活性，并扩大了脚本用于进一步分析应用程序的用途。

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图1. Ruffle量化宏的处理步骤。使用40 x 1.3 NA物镜在此处捕获的宏需要3维2通道图像。图像AC表示Z投影（仅用于图形显示目的）示例图像。A.鬼笔环肽染色的RAW 264.7巨噬细胞（通道1）。B.用DAPI标记的核（通道2）。C.合并两个通道的图像，实心箭头表示重新切割的位置。DF。C的残影（箭头），显示3D图像的X - Z轴（沿面板C中的箭头垂直切开）。D.虚线表示由宏EF选择的原子核的中点。富含F-肌动蛋白的褶皱，带有合并的DAPI，由白色箭头（F）突出显示。比例尺= 20μm。G. 来自原子核的三个不同Z平面的示例横截面图像（X - Y轴）显示了测量面积的差异，最大横截面积被确定为原子核“中点”。H.单元格的剩余部分示例（XZ轴）显示一条实线，确定的核中点在其中，以及如果使用了偏移线（例如，-3偏移），小空心箭头（灰色）突出显示如果使用偏移量将选择的其他褶皱，较大的黑色箭头显示由现有中点切片选择的褶皱，切片之间的差异为偏移量。

使用FIJI，安装宏文件：“ Ruffle Analysis Macro”，然后选择“运行”。
注意：要将宏加载到FIJI中，请打开。ijm 文件，或从Github 网站复制文本（请参见上面的软件部分），然后将其粘贴到新的脚本窗口（文件>新建>脚本）中。若要继续使用，请使用文件Ruffle_Analysis_Macro_。ijm 可以复制到FIJI应用程序的“ scripts”文件夹中，下次打开FIJI时，它将出现在插件菜单下。

阅读“确认”屏幕以获取测定说明和说明（图2A）。
导航到要处理的文件的目录位置（图2B）。
在对话框中确认正在使用的文件扩展名（例如，“。czi ”），并根据需要输入Nuclei中点偏移量，然后选择“确定”（图2 C）。
注意：该脚本将在整个目录中运行，仅打开包含所选文件扩展名的图像。

脚本完成后，将出现一个对话框。

使用批处理完成对话框确认宏是否成功运行（图2D）。
导航到输出目录位置（在所选工作目录位置内），并确认阈值选择正在使用输出阈值图像准确选择您感兴趣的区域。
注意：由于宏的简化性质，使用新的或修改的参数重新运行宏所需的时间最少，因此鼓励检查输出数据并在必要时重新运行。

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图2 。用户交互宏窗口。运行“ Ruffle量化宏”期间需要用户输入的对话框。A.确认和初始屏幕描述宏，创建者的联系方式，输入要求和输出文件。B.与操作系统有关的文件导航器窗口，用于选择包含用于处理和分析的图像的目录。C.文件扩展名过滤器对话框窗口允许用户输入文件扩展名和中点偏移值。D.宏完成窗口通知用户宏的成功完成。

Ruffle量化宏的关键步骤概述
使用Otsu算法提取核图像（通道2）并进行阈值处理。通过逐步测量每个切片内的核面积来确定中点。存储具有最大核面积的切片。核数也被计数并存储以供输出（图3A）。
注意：此处使用Otsu阈值化方法来检测原子核，Otsu方法可找到前景和背景之间的类间方差的最大点，适用于预期强度的双峰分布。

F-肌动蛋白（鬼笔环肽）信道（信道1）从图像堆栈中取出成两个单独的图像堆栈，（1）细胞的下半部分取（切片1到细胞核中点切片（ 偏移）;图3B）（2）取得顶部的褶皱区域（中点切片切片（最偏距 偏移）；图3E）。
单元格面积是通过将图像切片（从切片0到确定的核中点切片）进行最大的Z投影确定的（±偏移）和使用Triangle算法进行阈值处理（以选择总的细胞外围）。并测量其输出（图3C）。然后使用距离图来缩小阈值的平坦底部图像，以分离关闭和/或触摸的单元格。然后，使用IJ_IsoData 阈值算法对距离图进行阈值处理，并估计“对象”（单元）的数量并存储以进行输出（图3D ）。
注意：此处使用“三角形”算法检测单元格，该算法最适合查找可能仅略高于背景的对象（例如，单元格的最边缘），因此可用于创建准确的选择来测量单元格面积。对于单元格计数，距离映射的阈值单元格会受到Moments IJ_IsoData 阈值的影响，因为它选择了高值最大值（例如，一个或多个非常中心的单元），因此只要精确的单元格数计数就不会受到触摸单元格的影响。

通过对Z投影顶部F-肌动蛋白通道（中点± 偏移至切片总数/顶部的总和）并测量所得的32位图像的强度（乘以检测到的面积）来求和。然后使用矩算法对平坦的顶部/褶皱图像进行阈值化，并测量阈值褶皱的面积（图3F），并用于确定感兴趣区域，以直接测量褶皱强度的总和。
注意：此处使用矩算法对褶皱进行阈值处理，该算法按一系列平均步骤工作，并选择背景以上但强度不同的区域。这有助于从32位总投影图像中准确选择所有褶皱，而不仅仅是最亮的对象。

计算执行normalisations 皱褶区域/小区区域，所述褶边/单元区域的强度。这些值针对检测到的核数进一步标准化。
宏中关键点的图像被保存到输出文件夹（核检测，单元格区域（底部）和褶皱区域（顶部），并且褶皱选择的合并的（绿色/红色）RGB图像覆盖在单元格区域图像上）用于验证的目的（图小号3G- 3 ħ ）。
将所有输出值写入日志窗口（图3I ），并将输出.csv文件写入名为Analysis_Results _ < date＆time > 的子目录中（图3J）。
来自分析的量化数据存储为.csv文件，其比率和归一化至已计算的细胞数（图3K）。（下面将详细解释值和计算）。

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图3 。褶皱量化宏的处理步骤。一。宏计数的阈值核掩码。公元前。扁平的F-肌动蛋白碱基（底部）和用于测量细胞面积的相应阈值。d 。阈值距离图显示单个细胞分割，用于计数细胞数/视野。EF 。Z投影顶表面（褶皱）的总和，包括用于测量褶皱面积的阈值图像。G. 示例输出图像显示合并的底部（红色）和顶部/皱褶（绿色）。^ h 。示例输出图像显示了合并的阈值底部I （红色）和顶部/褶皱（绿色）I 。“日志”窗口的屏幕快照，其中报告状态，宏运行日期，文件名和结果。J.结果目录的屏幕快照，其中包含输出图像，日志文件和Results.csv文件。K.csv输出结果文件的屏幕快照，其中以下是对源信息的解释，请参见上图（如果适用）。比例尺= 20μm。

概述数据处理步骤
输出d ATA （.csv文件）从宏使用开的Microsoft Excel（或等同物）。
原子核中点不正确的数据（例如，切片33/33）表明阈值错误，并且将这些样本的检测排除在分析之外，这可以从相应的阈值输出图像中进一步确认。
将数据复制并分类到相关的组中（基于图像视场和/或处理条件）到GraphPad Prism 8中以进行统计分析。
取决于数据集。统计分析可能包括T检验，单向或双向方差分析。使用内置的绘图工具比较数据。

宏的输出和结果
以下详细说明了在输出.csv文件中生成的值的来源：

A列（图像ID）=此数据行的源图像文件名

B列（单元格的估计数）=在图3D中检测到的对象数

C列（核数）=图3A中检测到的物体数

D列（中间切片编号）=原子核中点的图像切片编号

E列（切片总数）=源Z堆栈中的切片数

F列（总细胞面积）=根据图3C 计算得出的面积

G列（总强度）=图3E中的总强度

H列（顶部皱纹）=从图3F 计算得出的面积

第I列（比率顶部：底部）=图3F中的比率面积/图3C中的面积

J列（比率总和强度：像元面积）=比率总和强度图3E /面积图3C

K列（归一化比率）= I列的结果（图3F / 3C ）除以C列（图3A 的原子核数）

L列（归一化总和）= J列（图3E / 3C ）的结果除以C列（图3A 的原子核数）

笔记

对于这些实验的蔡司AxioScan 使用显微镜用Apotome 2.以生成荧光图像，但是任何荧光显微镜的光学切片的能力（É 。克，共焦）可以被取代。重要的是，图像必须是3维的，并具有要成像的整个单元格的范围（从底部到最顶部的皱纹）。
在这里，F-肌动蛋白用Alexafluor 488-鬼笔环肽标记，但是任何颜色的鬼笔环肽都可以替代。此外，此宏可与遗传编码的F-肌动蛋白标签（例如GFP-LifeAct）一起使用。核用DAPI染色，但是作为脚本的一部分，其他核/ DNA标记也可能适用于确定核的中点。
对于这些实验，使用了RAW264.7巨噬细胞，但是该方法也已在原代骨髓来源的巨噬细胞（BMM），MB231癌细胞和BV2小胶质细胞上进行了测试。因此，“褶皱定量宏”非常适合用于多种不同的细胞类型，从而可以修改特定的细胞培养技术。

菜谱

细胞培养基
RPMI 1640培养基

10％Feotal 牛血清

1％聚-D-赖氨酸

致谢

显微镜在IMB显微镜处进行，澳大利亚癌症研究基金会（ACRF）在IMB处资助了癌症生物学成像设施。NDC获得了澳大利亚研究生奖和Yulgilbar基金会的支持，研究支持来自澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（1098710）和澳大利亚研究委员会（DP180101910）

该测定法是从最初发表于《细胞生物学杂志》（Conden）等人，2018年的方法衍生和修饰的。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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