材料和试剂

注意：所有试剂必须为分析纯或更高，并根据制造商的建议进行存储。所有塑料制品都必须不含DNase。

具有适当抗生素的LB-琼脂96孔板（可以从测序公司订购;如果没有，请参见食谱）
移液器吸头，10μl，200μl和1,250μl（VWR，欧洲目录号：613-1093、613-1092和613-1087）
（可选）无菌牙签
15毫升和50毫升聚丙烯锥形管（Falcon，目录号：352096和352070）
1.5 ml微量离心管（进口，目录号：T330-7G）
移液容器（Diversified Biotech，目录号：REBP-3000）
96孔PCR板，0.2毫升（VWR，欧洲目录号：211-0297）
Microseal'B'PCR板密封件（Bio-Rad，目录号：MSB1001）
深孔板96 / 2,000μl（Eppendorf，目录号：651033405）
用于培养板的透气性薄膜（VWR，欧洲目录号：391-1261）
无菌培养皿（例如，ThermoScientific Nuclon TM Delta Surface，目录号150350）
一次性无菌涂抹器（例如，VWR，目录号：612-5497）或2 mm高压灭菌的玻璃珠（例如，Supelco，目录号：1.04014）
ZR-96 DNA清洁剂集中器（Zymo Research，目录号：D4024）
具有化学活性的大肠杆菌 XL-1蓝色细胞（安捷伦，目录号：200249）或用于克隆的其他一些细胞株（Mach1，DH5α，TOP10 等。）
克隆引物
ColE1A：5'-GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCG-3'
ColE1B：5'-CGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCC-3'
注意：这对引物可用于所有含有ColE1复制起点的质粒。
用作PCR模板的质粒
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD + ，50 mM（New England Biolabs，目录号：B9007L）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物，每个dNTP均为10 mM（New England Biolabs，目录号：N0447S）
T5核酸外切酶，10 U /μl（New England Biolabs，目录号：M0363S）
Phusion HF DNA聚合酶，2 U /μl（New England Biolabs，目录号：M0530L）
Taq DNA连接酶，40 U /μl（New England Biolabs，目录号：M0208L）
DpnI，20 U /μl（New England Biolabs，目录号：R0176L）
无核酸酶的水（细胞信号技术，目录号：12931S）
具有GC缓冲液的Phusion高保真PCR预混液（New England Biolabs，目录号：M0532L）或其他一些合适的DNA聚合酶预混液（请参阅步骤B. PCR）
PEG-8000（Sigma-Aldrich，目录号：P5413）
Tris-HCl缓冲液，1 M，pH 7.5（Thermo Fischer Scientific，目录号：15567027）
MgCl 2 ，1 M（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
DL-二硫苏糖醇（DTT），1 M（Sigma-Aldrich，目录号：43816）
SOC增长培养基（新英格兰生物实验室，目录号：B9020S）
抗生素原液（取决于目标质粒携带的抗生素抗性基因）
带有琼脂的溶源性肉汤（LB）肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
25°C时电阻率为18MΩcm的超纯去离子水
5个等温反应（IT）缓冲液（请参阅食谱）
1.33x吉布森装配混合物（请参阅食谱）
具有适当抗生素的LB-琼脂平板-培养皿（请参见食谱）

设备

多种移液器，包括多通道移液器和重复移液器
可容纳96孔PCR板的热循环仪（例如，Eppendorf TM Mastercycler TM Nexus热循环仪，目录号：E6332000029）
用于深孔板的离心机（例如，带有摆斗式转子A-4-62的Eppendorf 5810 R，目录号：5811000320）
实验室培养箱设置为37°C
实验室培养箱/振荡器设置在37°C

软件

AAscan（Sun等，2013年； https://github.com/dmitryveprintsev/ AAScan / ）
MutantChecker（Sun et al。，2013； https://github.com/dmitryveprintsev/ AAScan / ）

程序

底漆设计和订购
1. 下载并打开Aascan软件（Sun et al。，2013），以设计用于定点扫描诱变的诱变引物。Aascan软件界面的屏幕截图如图2所示。
2. 用要突变的DNA序列替换Asscan中提供的默认DNA序列，包括5'和3'末端的侧翼区域（40-50个核苷酸）（ DNA序列，包括40-50 nt侧翼）地区）。
3. 定义第一个三联体密码子中第一个核苷酸的位置（1 st 三联体的 Nt位置）。这使给定的DNA序列与氨基酸编号相关。在图2给出的例子中，来自蛋白质编码序列上游载体的50个核苷酸被包括为侧翼区。因此，来自ATG密码子的核苷酸A（对应于氨基酸残基1）位于51位置。只要有可能，我们建议对目标蛋白质使用标准编号方案。这不必与表达的蛋白质构建体（可能包括信号肽，纯化标签，蛋白酶切割位点，接头或融合蛋白伴侣）中的氨基酸编号相匹配。
4. 定义最多两个编码氨基酸（ Xxx ）的密码子，在扫描诱变中您要通过其替换其他氨基酸，例如 eg ，“ GCG”和“ GCA”表示Ala（ mut密码1和2）。如果只使用一个特定的密码子，请将其同时包含在 mut密码子1和2 文本字段中。我们建议根据密码子在表达宿主中的频率和感兴趣基因的GC含量来选择密码子。选择表达宿主中最常见的密码子，如果可能，请避免如果您感兴趣的基因的GC含量非常高（> 60％）或非常低（<40％），则不要选择GC含量高或低的密码子。，分别。对于在人类细胞培养中表达的几种GC含量在50-55％之间的构建体（HEK 293S），我们对该宿主使用了最常见的密码子：Ala的GCC / GCT，Gly的GGC / GGA和GTG / GTC值另一方面，如果感兴趣的基因具有较高的GC含量，则最好使用GC含量较低的密码子，例如 ie ，Ala的GCT / GCA，Gly的GGA / GGT和GTT / GTA Val。这样的密码子选择使具有相对高的退火温度的诱变引物的设计数量最小化。
5. 如果扫描诱变区域中的特定氨基酸已经是Ala，则通过在丙氨酸扫描诱变替换中最多定义两个对应的密码子（ eg ），将其替换为另一个氨基酸 Yyy 现有的带有丙氨酸的丙氨酸（如果是Ala，则使用Gly ）。在选择密码子时，请使用上一步中给出的建议。
6. 使用步骤A3中定义的氨基酸编号方案，输入氨基酸诱变范围（文本字段 From 和 To ）。
7. 定义底漆设计参数。根据我们的经验（Sun等，2013年； Heydenreich等，2017年），我们建议使用以下参数：最小引物长度（最小长度））– 18个核苷酸（nt）；最大引物长度（最大长度）– 60 nt；最小GC钳位（ MinGCclamp ）– 2；优化的GC钳位（ OptimizedGCclamp ）; 最低引物熔化温度（ MinTm ）– 60°C；引物最高熔化温度（ MaxTm ）– 70°C；正向和反向引物的熔化温度之间的最大差异（ MaxDeltaTm ）– 5°C；从突变密码子到引物（ MinAnnealLen ）– 15 nt 3'端的最小距离；所得PCR片段末端之间的重叠序列长度（ MinOverlap和MaxOverlap ）– 15到27 nt之间；每个特定氨基酸位置（ MaxSuggestions ）– 1突变设计的引物对的数量。
8. 定义输出格式。正向和反向引物使用单独的结果列（分别的F和R ）。用户可以选择更多（ Long1 和 Long2 ）或更少（ Short 和 mFASTA ）详细输出。
9. 点击或触摸批处理按钮。这给出了设计的正向（' n _F'）和反向（' n _R'）引物的两个单独列表，包括它们的名称和序列（以及输出的其他引物特性）格式为 Long1 或 Long2 ）。引物名称中的“ n ”对应于要通过使用该引物进行突变的氨基酸编号。
10. 向提供DNA寡核苷酸合成的公司订购设计的引物。该公司通常会提供一个订单模板文件，可以轻松地将Aascan输出（在步骤A10中获得）复制到该模板文件中。订购时，请使用96孔板形式，正向和反向引物分为不同的96孔板，但以这种方式，每个正向引物的位置均与其他96孔中相关反向引物的位置完全相同孔板（ eg ，每个96孔板中A6位置的引物103_F和103_R）。订购已脱盐的DNA寡核苷酸，它们已以100μM的浓度溶解在无核酸酶的水或公司提供的某些标准缓冲液中（通常为10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 7.5）; 见注1。
11. 购买一对脱盐的反向互补引物，它们大约在质粒的相对侧上退火。建议选择与复制起点或抗生素抗性基因结合的引物。在这种情况下，只有正确组装的质粒DNA才能使转化的细菌在带有选择抗生素的平板上生长。我们使用复制起点的ColE1引物（请参阅材料和试剂）。
  
  图2. AAscan软件界面。在所示的示例中，编码序列以大写字母写出，侧翼区域以小写字母给出（ DNA seq，包括40-50 nt侧翼区域）。第一个三联体密码子（ATG）中的第一个核苷酸位于指定DNA序列的51位（1 st 三联体的 Nt位置）。为氨基酸残基2–371设计的诱变引物分为两个输出窗口：正向引物列在左侧，反向引物列于右侧。
PCR
每个突变均在两个单独的PCR（分别表示为A和B）中生成，从而导致两个PCR片段在随后的Gibson组装中组合在一起。在对所有目标突变进行PCR之前，我们建议先对少量（20-30）随机选择的突变进行PCR条件测试，并相应地修改方案，如Heydenreich 等人在原始文章中所详述。（2017）。我们建议测试不同的聚合酶和缓冲液条件以及添加DMSO。为了确定有效的PCR条件，我们从琼脂糖凝胶电泳中的测试突变集分析了每种PCR产物。尽管如此，我们并未在大规模诱变中包括此控件或任何其他控件。
1. 在进行实验之前，请检查其质粒中目标基因的方向。这对于确定如何在PCR诱变引物中与复制起点ColE1引物结合非常重要。诱变引物和适当的ColE1引物应与互补DNA链退火； eg ，如果将正向诱变引物与ColE1B结合，则应将反向诱变引物与ColE1A结合（反之亦然）。
2. 用无核酸酶的水稀释质粒DNA模板至浓度为1 ng /μl。
3. 用无核酸酶的水稀释引物ColE1A和ColE1B到浓度为6μM。
4. 用无核酸酶的水在96孔板中稀释诱变引物至6μM。
5. 需要两组PCR。对于每组 x 诱变PCR反应，准备表1中定义的PCR预混液。
  
  表1. PCR主混合物。每个混合物足以进行20 µl反应体积的 x 诱变PCR。
6. 要制备PCR混合物A，请使用多通道移液器将19μlPCR Master Mix A移至冰上96孔200μlPCR板的每个已用孔中，并向其中添加来自适当引物组的1μl诱变引物（6μM）（正向或反向，如步骤B1所述）。用PCR密封垫封闭96孔PCR板。
7. 准备表2中所示的PCR程序（请参阅注释2）。
  
  表2。使用Phusion聚合酶进行DNA扩增的PCR程序
  
  *要在PCR中扩增的最长DNA片段的大小，以千碱基对（kbp）为单位；扩展时间为每1 kbp 30 s。
8. 将热循环仪预热：将加热块加热至98°C（变性温度），将盖子加热至103°C（请参阅注3）。
9. 将带有反应混合物的密封96孔PCR板直接从冰上转移到预热的热循环仪中，盖上盖子并启动步骤B7中定义的PCR程序。
10. 将96孔PCR板和完整的PCR放在冰上，直至进一步处理。
11. 要制备PCR混合物B，请使用PCR Master Mix B和相应的诱变引物（第二个诱变引物组，如步骤B1中所述）重复步骤B6-B9。
DNA模板消化和反应净化
1. 完成PCR A和PCR B后，使用多道移液器将20μlPCR混合物A转移到96孔PCR板中的相应20μlPCR混合物B中。在此步骤中，我们将具有相同突变的两个片段PCR产物组合在一起。
2. 向每种片段混合物中加入0.5μlDpnI（20 U·μl -1 ），密封96孔板，在37°C下孵育以消化甲基化的DNA模板。DpnI消化1小时已经足够，但是如果在时间管理方面更方便的话，混合物可以孵育18小时。
3. 为了在DpnI消化后从反应混合物中纯化PCR片段，请使用ZR-96 DNA Clean＆amp; Concentrator-5 Kit TM （Zymo Research）根据制造商的规程，但在最后一步中使用10μl洗脱缓冲液。这个小体积将导致随后的Gibson组装中更高的DNA浓度。
吉布森大会
1. 在冰上的96孔PCR板中，将每份干净的PCR片段混合物与3μl1.33x Gibson装配混合物（配方2）混合1μl，使用设置为3μl的多通道移液器轻轻上下移液十次，以避免起泡（见注4）。
2. 将带有Gibson组装反应混合物的密封96孔板转移到预热的热循环仪中（在50°C下封闭，在53°C上放置盖子），在50°C下孵育10分钟，然后在37°C下孵育1 h，保持在10°C。另外，对于一对诱变引物（例如，21个或更多核苷酸；请参见步骤A8）中较长的核苷酸重叠，可以在50°C下进行Gibson组装反应1 h，然后进行保持在10°C。首先可以通过少量（20-30）随机选择的突变来检查哪种Gibson装配条件更合适，如Heydenreich et al。，2017年所详述（请参见注释5）。
细胞转化
1. 在冰上解冻具有化学感受态的大肠杆菌 XL-1蓝细胞悬液（请参见注释6）。
2. 在冰上的96孔PCR板上，每孔分配20μl细胞悬液，并使用重复移液器进行突变。
3. 将2μlGibson装配混合物添加到每个20μl细胞等分试样中，用PCR板密封垫密封板，并在冰上孵育10-20分钟。
4. 将带有细胞-DNA混合物的96孔板转移到预热的热循环仪中（在42°C时封闭，在42°C时放置盖子），在42°C孵育60 s。
5. 立即将细胞-DNA混合物放在冰上，孵育2-5分钟。如果质粒带有氨苄青霉素抗性基因，则可以立即进入步骤E8（尽管在这种情况下，步骤E6和E7也会提高克隆效率）。
6. 使用多通道移液器，将转化的细胞转移至装有300μlSOC培养基（不含任何抗生素）的96深孔板中，用透气密封垫封闭板并在37°C下孵育1 h，同时在160转/分。
7. 旋转细胞（3,000 x g ，5分钟），并使用多通道移液器小心除去220μl上清液。
8. 通过使用设置为80 µl的多通道移液器上下吸液，将细胞沉淀重悬在剩余的上清液中（ ca。 100μl），直到所有细胞沉淀都重新悬浮而在移液过程中没有可见的团块为止。将细胞悬液接种到含有适当抗生素的LB琼脂平板上。为了节省一些存储空间和材料，您可以使用一个扩展的多孔板将每个LB-琼脂平板上四个不同的突变体（每个突变体上一个突变体）接种到24孔LB-琼脂板上的24个突变体（每个孔一个突变体）上。通道移液器。
9. 让板干燥10分钟，然后在37°C下颠倒孵育过夜。第二天，您应该在LB-琼脂平板上发现细菌菌落。
质粒DNA的制备和测序
对于高通量项目，测序公司可以直接从96孔板上的细菌菌落中进行质粒制备和测序，与发送已提取的质粒样品相比，无需额外费用。我们强烈建议您使用此选项。
1. 在LB-琼脂平板上标记一个选定菌落的位置，用无菌移液器尖端或牙签将其挑选出来，然后将其与带有适当抗生素的96孔平板一起转移到LB-琼脂上。这种板通常由测序公司提供；如果没有，您可以轻松地自己准备它们（食谱3）。
2. 使用适当的测序引物（正向或反向）订购测序。为了获得可靠的结果，测序引物应退火预期突变上游至少30-40个核苷酸。根据测序服务的不同，通常可以期望可靠的序列读取长度至少为 ca。 600个核苷酸（对应于 ca。 200个氨基酸）。对于更长的序列，应使用其他测序引物覆盖整个目标区域。将每个突变体带有一个菌落的96孔LB琼脂平板发送到测序公司，等待测序结果。每测序循环发送一个突变体可降低测序成本。
3. 如“数据分析”部分所述，在MutantChecker软件中分析测序结果（Sun et al。，2013）。
4. 如果未在测序轮次中确认突变，则在下一轮测序轮次中发送一个新的菌落（请参见注释8）。
5. 您可以从测序公司的96孔板中获得质粒溶液。另外，您也可以自己从LB-琼脂板上标记的菌落制备质粒，这些菌落在测序中呈阳性。

数据分析

测序数据分析

将测序数据另存为计算机中的文件夹中的.fasta，.seq或.txt文件。
打开MutantChecker（图3），然后将参考的未突变DNA序列粘贴到指示的字段（参考序列）中。序列应以“程序”步骤A3中定义的第一个密码子开始。分别分析使用正向引物测序的突变DNA和使用反向引物测序的突变DNA。有关更多详细信息，请参见Sun et al。（2013）。
对于使用正向引物测序的DNA，请使用氨基酸编号更改相应字段中 Report mut from ＃和 To 中提供的默认值。通常，正向序列应覆盖约200至250个氨基酸。
检查程序设置后，单击“文件”→“加载文件列表”。选择一个或多个要检查的文件。我们建议最初一开始检查文件。如果一次分析多个文件，则只会显示最后选择的文件的对齐方式。
现在，最大的窗口将显示参考序列和测序结果的比对（图3）。右边的图表指示已找到多少可能的路线。理想情况下，您应该会看到一个尖峰。右下角的窗口显示序列名称，后跟在步骤3输入的限制内发现的任何突变（请参见注释7）。
对于使用反向引物测序的DNA，请使用 RC From 和 RC To 字段指示应报告突变的氨基酸范围。RC代表反向补码。检查使用反向引物测序的DNA时，勾选 ReverseComplement 框。
重复步骤4-5分析剩余的测序数据。

图3. MutantChecker软件界面。以突变R104A的测序数据分析为例。右侧的图显示了比对得分函数 vs。与测序结果和参考序列之间的偏差（Sun et al。，2013）。在这种情况下，只有一个峰，表明找到了一个可能的比对。由于重复的序列（通常表示克隆伪像），多个峰可能暗示了几种替代比对。右下方的输出窗口中列出了在指定的氨基酸范围（1-200）中识别的突变。“ E198 @”表示从氨基酸E198开始不清楚测序迹线（测序结果中的“ n”）。

笔记

Gibson组装不需要引物修饰（如磷酸化），DNA寡核苷酸的最小合成规模通常绰绰有余。将冷冻的引物在-20°C下存储最多2年。几个冻融循环对DNA寡核苷酸的稳定性没有重大影响。
除Phusion外，DNA聚合酶可能需要不同的PCR方案。
此步骤可将初始变性过程中的底涂最小化。如果使用热启动聚合酶，则可能没有必要。
可以使用商业Gibson装配预混液或类似的DNA装配产品来代替自制的Gibson装配合剂。
最近，我们成功地在45°C下孵育了1 h，事实证明它可以提高Gibson组装的效率（Gibson et al。，2010）。如果将引物设计成相对较短的重叠以提高其特异性（例如，15 bp），则这可能特别有益。
细胞应采用井上法制备（Sambrook和Russell，2006），每1μgpBR322（或类似质粒）的转化效率至少为10 7 个菌落。或者，可以使用其他一些 E。常规克隆常用的大肠杆菌菌株，例如Mach1，DH5α或TOP10。
根据对DNA进行测序的公司，痕迹的注释可能会有所不同。一些公司决定在迹线不清楚时不显示“ N”，而是选择最高峰。在这两种情况下，都将报告不匹配，但是当迹线不包含Ns时，可以将其视为真正的突变。我们建议您在类似情况下检查跟踪，即使报告的突变发生在测序结果的开头或结尾。尤其是在序列末尾，四个或多个相同类型碱基（所有G，所有C，所有As或所有T）的重复可能导致难以解释的痕迹，从而导致 n 基被读取为 n -1或 n +1，从而导致移码。通常这是一个排序问题，而不是真正的移码。这些情况或许多Ns拖尾的序列可能导致接近主峰的其他峰。
有关故障排除，请参阅原始出版物（Heydenreich 等人，2017年）。

菜谱

5个等温反应（IT）缓冲液（6毫升）
1.5克PEG 8000
3毫升Tris-HCl（1 M，pH 7.5）
300μlMgCl 2 （1 M）
300μlDTT（1 M）
600μlNAD + （50 mM）
600μldNTPs溶液混合物（每个dNTP 10 mM）
准备5倍IT缓冲液的500μl等分试样并将其储存在-80°C
1.33x吉布森装配混合物（1.8毫升）
480μl5x IT缓冲液
0.96μlT5核酸外切酶（10 U /μl）
30 µl Phusion HF DNA聚合酶（2 U /μl）
240μlTaq DNA连接酶（40 U /μl）
1,049μl无核酸酶水
制成50微升等分试样，并在-20°C（或-80°C进行长期存储）中存储
注意：Gibson装配混合物可以在-20°C下保存一年以上，并且经过10个以上的冻融循环后，酶仍然具有活性（Gibson等，2009）。
具有抗生素的LB-琼脂平板
1. 在1升超纯去离子水中添加35克LB肉汤和琼脂
2. 在121°C下高压灭菌15分钟，以溶解粉末并对LB-琼脂灭菌
3. 让其冷却至手热温度（ ca。 45°C），添加适当抗生素的储备溶液以达到目标抗生素浓度，并剧烈旋转以使其混合
4. 向每个直径10厘米的培养皿中倒入 ca。 15毫升融化的带有抗生素的LB琼脂，使其固化
5. 对于96孔LB琼脂板，请使用多通道移液器将每孔150μl含抗生素的LB琼脂转移到平底96孔板中，并使琼脂凝固
6. 板应倒置保存在4°C的密封塑料袋中，直到使用

致谢

该协议源自我们先前的出版物（Heydenreich et al。，2017）。这项工作得到了FMH，Erasmus，EMBO短期研究金ASTF 420–2016的瑞士国家科学基金会移动研究金165219的支持以及瑞士国家科学基金会博士机动性补助金31003A_159748 / 2旅行研究金以及NanoMem ITN网络对TM，NRW的资助战略项目BioSC BOOST资金“ RIPE”授予海因里希海涅大学生物化学植物生理学研究所，居里夫人（274497）和瑞银Promedica基金会为DM提供博士后研究金，瑞士国家科学基金会为DBV和COST授予141898、159748行动CM1207闪亮。

利益争夺

作者声明没有任何竞争性的金融或非金融利益。

参考文献

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吉布森（Gibson）DG，史密斯（Smith），何（HO），哈奇森（Hutchison），加利福尼亚，第3，温特（JC）和迈里曼（C. 小鼠线粒体基因组的化学合成。自然方法 7（11）：901-903。
Gibson，DG，Young，L.，Chuang，RY，Venter，JC，Hutchison，CA，3rd and Smith，HO（2009）。酶促组装高达数百千碱基的DNA分子。自然方法< 6（5）：343-345。
Heydenreich，FM，Miljuš，T.，Jaussi，R.中，Benoit，R.，米利ć ，D。和Veprintsev，DB（2017）。使用两片段PCR方法进行高通量诱变。科学代表 7（1）：6787。
Liu H.和Naismith，JH（2008）。一种有效的一步定点定点缺失，插入，单和多位点质粒诱变方案。 BMC Biotechnol 8：91。
奥尔特加角，阿布鲁乌角，奥佩佐，P。和科雷亚角（2019）。后基因组时代的高通量克隆方法概述。方法分子生物学2025：3-32。
Sambrook，J。和Russell，DW（2006）。制备和转化胜任的 E的井上方法。大肠杆菌：“超能力”细胞。 CSH协议 2006（1）。
Sun，D.，Ostermaier，MK，Heydenreich，FM，Mayer，D.，Jaussi，R.，Standfuss，J.和Veprintsev，DB（2013）。 AAscan，PCRdesign和MutantChecker：一套用于高通量扫描的引物设计和序列分析程序诱变。 PLoS One 8（10）：e78878。