材料和试剂

雄性和雌性少年（4-5周龄）Sprague-Dawley大鼠
注意：
1. 我们在马里兰大学医学院繁殖并维持自己的殖民地。这有助于使用预计会影响男性化的药理剂进行早期治疗，并避免了由于动物运输或搬迁而产生的压力。将动物置于12:12 h的逆光：黑暗周期中。
2. 测试鼠是按性别，治疗和年龄相匹配的同胞对进行测试。这些“游戏对”在测试的多天中将保持不变，以使每只动物每天都与同一个游戏伙伴一起玩。为了实现这一目标，我们计划进行实验，以包括至少两个单独的猫砂中的大鼠。根据实验条件的数量，我们将测试至少两个游戏对（2组成对的垫料，或总共4个垫料）（有关实验设计和时间表，请参见图1A）。
3. 出生时，每只水坝的产仔数被淘汰至12-14头，以避免营养和孕产妇护理过度/不足的混杂。垫料应保持性别和治疗方面的平衡，垫料的初始性别比应大于或等于0。我们的实验未使用2：1的男性：女性（或相反），因为产前睾丸激素可能会在子宫内产生作用。
感兴趣的药理剂
注意：根据研究假设和治疗的实验时间，可能需要在生命中更早地对动物进行治疗（产前暴露，产后男性化等；请参见VanRyzin 等）。，例如2019）。

图1.代表性的实验时间表和行为说明。 A.出生当天，对两窝幼崽进行性别，剔除和处理（如有必要），并分配给与性别和治疗匹配的配对与相反的垃圾。允许幼犬不受干扰地生长直至幼年。从P26开始，可以在整个少年时期每天评估比赛行为。B.插图描绘了老鼠参与三种主要的粗糙和摔打行为-突击，钉扎和拳击。

设备

定制有机玻璃测试场49 x 37厘米，高24厘米（见图2A）
行为测试室配备红灯
一到两个带红色灯泡的灯架，用于照亮测试场所
录像设备和三脚架支架
注意：我们通常使用带三脚架适配器的智能手机来记录行为测试。
TEK-新鲜床上用品（Envigo，货号：7099）
毛笔或永久性记号笔（Stoelting，目录号：50440-1）
秒表或计时器
清洁液
注意：测试后，可以使用几种不同的清洁溶液对竞技场进行消毒。我们通常使用MB-10（Quip实验室）。

程序

在第一个测试日之前，请建立行为测试室。
1. 确保红光照明为视频录制提供适当的对比度。
2. 如果一次要测试一对以上的动物，请安排所有测试场所，以便可以使用可用的记录设备充分记录它们。使用智能手机摄像头，我们可以同时以足够的细节和分辨率记录4个舞台。参见图2B。
  
  图2.测试场所和设置。 A.单个行为测试场所的图像。B.放置在三脚架前的四个测试场地的图像进行录像。
3. 在每个测试区域中填充足够的TEK新鲜寝具，以覆盖区域底部（大约2-3厘米深）。
4. 计划游戏对和行为测试的顺序。每天都需要更改测试顺序，以平衡所有测试日中每个组的测试时间。
在试验当天，将动物（放在笼中）从殖民地房间移入行为试验室，以使其适应实验环境（试验前约20分钟，开始试验后至少1小时）。黑暗周期）。在黑暗阶段（大鼠的活跃阶段）进行测试对于正确的行为分析至关重要。
用毛皮标记笔（在头上或后面）或用永久性标记划去尾巴，标记每对游戏中的一只动物。这有助于进行行为分析，因为更容易将特定行为归因于标记或未标记的动物。
一旦动物适应了环境，就将一对动物放入测试场地，让它们适应场地2分钟。
适应后，记录行为10分钟。
测试结束后，停止记录。从测试场所中取出动物，然后将它们放回他们的家笼中。
根据需要重复步骤4-6多次，直到所有动物都经过测试。
在随后的几天，重复步骤2-7。我们通常会连续4天（P27-30）进行测试，以捕获游戏行为中的性别差异峰值；但是，可以在整个青少年时期（大约P26-35）每天重复进行该测试。

注意：

在测试过程中，实验人员应保持在窗帘后面或视线范围之外。此外，请保持房间安静，因为外部噪音可能会干扰行为。
不必在测试之间清洁测试场地或更换被褥。在每个测试日结束时，应清洁赛场（使用实验人员选择的清洁剂），并更换被褥，为第二天的比赛做准备。
确保将红光强度保持在最低水平，以避免造成人为的压力测试环境。用于我们的行为测试的照明通常＆lt; 50勒克斯此外，Sprague Dawley大鼠由于患有白化病，因此应使用红光，并且由于无法看到红光而使测试环境尽可能接近自然暗相，以进行最佳行为测试。
尽管大鼠在游戏过程中会发出超声波发声，但这不会影响游戏的表达（Kisko 等人，2015），并且不会混淆测试一次有1对动物。

数据分析

行为是由不了解动物性别和治疗方法的实验者离线评估的。
注意：评分可以手动完成，也可以使用键盘记录器软件完成。
进行给定行为的动物会获得该行为的分数。因此，一个游戏对产生两个数据点。这将有助于提高数据的可解释性，因为高低玩耍的动物不会根据其玩伴的行为进行平均。此外，对每只动物的评分行为可以对每只动物进行一段时间的分析，从而获得所有测试日的平均游戏价值。
为了评估粗暴的比赛行为，我们对以下行为进行了评分（请参见视频1-3和图1B）：
1. 突袭-当一只动物朝另一只动物的颈背或后退时得分。这通常是一种剧烈的动作，会被执行突袭动作的动物所打分。
  注意：动物可能会强行撞向对方或进行“低强度”突袭。由于开始比赛的意图更加含糊不清，因此通常不予评分。
2. 固定-当有突袭动物将另一只动物完全向后翻转时（所有四肢都离开地面）时得分。会为刺中的动物划上一个别针，通常在突刺后会直接被刻上。
  注意：钉扎通常是由于动物在防守端继续向后滚动而被猛扑而导致的。但是，动物可能会翻身，使其脚保持重量。在这种情况下，不会得分。
3. 拳击-当两只动物的后腿都站起来并互相掌着时，得分。两只动物的拳击得分都很高。
  注意：与追逐或钉扎相比，拳击的频率要低得多，当追逐的动物转弯并面对追逐者时，经常会在追逐追击时观察到。
  
  视频1.具有突击和固定功能的示例行为序列
  
  视频2.具有拳击功能的示例行为序列
以下行为也可以评分，但被认为是社交或自发游戏行为：
1. 追逐当一只动物主动追逐另一只时得分。只有“追逐者”获得追逐分数。
  注意：通常，追逐先于突袭或拳击行为。
2. 有弹性的步态-当一只动物以一系列“跳跃”或“跳跃”的形式在赛场上移动时得分。
还可以对以下非游戏性社交行为进行评分：
1. 肛门生殖器嗅探-当一只动物主动嗅探另一只动物的肛门生殖器区域时评分。
2. 舔和修饰–当一只动物积极舔或修饰另一只动物的头部或生殖器部位时得分。
3. 挤在一起-当两只动物都非常靠近/彼此接触却没有参与任何其他形式的社交行为（嗅/舔/修饰）时得分。两只动物都缩得分。
4. 爬上/爬下-当一只动物爬上另一只或下时得分。
  注意：这通常发生在环境探索期间。
还可以对以下环境探索行为进行评分：
注意：这些行为最好按照动物花在每个类别上的时间进行评分。
1. 在床上挖掘和挖洞–记为一只动物在床上挖洞或筑巢的持续时间。
2. 咀嚼床上用品-记为一只动物在其爪中握住一块床上用品并对其进行咀嚼的持续时间。
3. 常规竞技场调查-评分为一只动物嗅探或抬起后腿探究测试竞技场墙壁的持续时间。
统计分析：
1. 如果年龄是感兴趣的实验因素，则数据可以表示为每天的平均值，并使用重复测量方差分析进行分析（更多示例，请参见图3A和Argue和McCarthy，2015年）。
2. 如果不关心年龄，则可以根据实验组的数量，对单个动物的整天数据进行平均，并使用 t 检验或ANOVA进行分析（请参见图3B-3E和VanRyzin 等，2019年获得更多示例）。
  
  图3.样本数据。 A.样本数据显示了P27-P30每天男性和女性的总运动量（突跳，大头钉和长方体）。B.样本数据显示了所有四个测试日中A的总比赛数据的平均值。CE。来自B的样本数据分为突点（C），大头针（D）和方框（E）。数据表示为平均值±SEM。蓝色和红色线条/条分别表示男性和女性。空心圆圈表示单个动物的值。* = P ＆lt; 0.05，** = P ＆lt; 0.01。

笔记

在第一个测试日之前，可以在野外测试中对动物进行一般运动活动和探索行为的测试，以排除各组之间活动差异的任何混淆。通常，我们从未发现男性和女性之间的基线活动差异，但是实验操作可能会影响这一点。
由于动物将开始在被褥下挖洞，因此在试验场上铺满过多的被褥会导致社交行为的减少和环境探索的增加。
我们在逆光：黑暗周期中测试动物，并在黑暗周期开始后1-2小时开始进行行为测试。重要的是要保持行为分析的时间跨几天一致，以避免任何昼夜节律对行为的影响。
根据测试天数，动物的年龄和药理操作，动物可能会在青春期开始时开始表现出性行为（在我们的殖民地中约为P40）。在这种范例中，我们不将性行为视为一种社会行为，因为在我们的经验中这种情况很少发生。但是，如果它频繁发生，则可以将其作为一组单独的行为进行分析，以确定青春期是否较早发生。
男性和女性的游戏行为沿从高到低的连续性表达。平均而言，男性相对于女性处于连续体的“高端”，但自然个体变异性却相当大。每组动物可能都会有一些高玩性雌性和低玩性雄性。这种自然的行为变异性并不是将这些动物排除在分析范围之外的原因。而是计划具有足够样本量的实验来说明这一点。我们建议每性至少8只动物。
游戏对应该是同性，同等待遇。在给定的游戏对中混合性别或待遇可能会导致中间的游戏表型（即，更嬉戏的伴侣会增加低打的大鼠游戏，反之亦然）。有关示例，请参见Argue和McCarthy，2015年。

致谢

这项工作是由美国国立卫生研究院R01MH52716和R01DA039062资助MMM的，该协议改编自Argue和McCarthy，2015年以及Vanryzin等，2019年。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

伦理

此处描述的所有动物操作步骤均应根据马里兰大学医学院动物护理和使用委员会的规定执行（协议编号0517007，06 / 30/20）。

参考文献

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