材料和试剂

13毫米玻璃盖玻片（VWR，目录号：631-0148）
薄丝状硼硅酸盐玻璃毛细管（哈佛仪器，目录号：30-0066）
薄硼硅玻璃毛细管（哈佛仪器，目录号：30-0094）
12孔细胞培养板，CellStar（Greiner Bio-One，目录号：665 180）
Microloader移液器吸头（Eppendorf，Thermo Fisher Scientific，目录号：10289651）
成年小鼠，6-12周， eg ，C57 / Bl6（杰克逊实验室，目录号：000664）
层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L2020）
去离子过滤水（dH 2 O）（Milli-Q，默克密理博，目录号：ZRXQ003WW）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氢氧化钾颗粒（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：P6310）
氢氧化钠颗粒（NaOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S / 4920/53）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5767）
L-天门冬氨酸（C 4 H 6 KNO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：A6558）
葡萄糖酸钾（C 6 H 11 KO 7 ）（Sigma-Aldrich，目录号：G4500）
腺苷5'-三磷酸（ATP）二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A7669）
5'-三磷酸腺苷（ATP）镁盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9187）
乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma- Aldrich，目录号：E3889）
磷酸肌酸二（tris）盐（Sigma-Aldrich，目录号：P1937）
鸟苷5'-三磷酸钠（GTP）水合钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
两性霉素B（Sigma-Aldrich，目录号：A4888）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
葡萄糖酸钾（C 6 H 11 KO 7 ）（Sigma-Aldrich，目录号：G4500）
氯化钙（CaCl 2 ）1 M溶液（Fluka，目录号：21114）
氯化镁（MgCl 2 ）1 M溶液（Fluka，目录号：63026）
提洛德细胞外液（请参阅食谱）
多孔膜片钳细胞内溶液（请参见食谱）
全电池电流钳解决方案（请参阅食谱）
两性霉素储备溶液（请参阅食谱）
层粘连蛋白涂层的盖玻片（请参见食谱）

设备

Digidata 1440A数据采集系统（分子设备）
Axopatch 200B膜片钳放大器（分子器件）
膜片钳记录室（Warner Instruments，RC-26室）
倒置显微镜Nikon TE200 Eclipse（Nikon）
微型操纵器（补丁之星）（科学）
移液器拉拔器PP-830（成茂）
Microforge MF-830（成志市）

软件

pCLAMP 10数据采集和分析软件（分子设备）
Origin 6.0分析软件（OriginLab公司）
GraphPad Prism v6

程序

从录制后的窦房结分离的起搏器心肌细胞（如Aziz 等人，2020年所述）在记录前至少1 h涂在层粘连蛋白包被的盖玻片上（配方5）。
注意：根据我们的经验，在隔离后，新鲜分离的SAN电池可在分离后最多4-5小时内用于膜片钳。
全细胞膜片钳/穿孔全细胞膜片钳
1. 使用两步移液器拔出器从合适的玻璃毛细管中吸取移液器（对于全细胞使用细丝，对于穿孔的膜片钳不使用细丝），并用微型锻造工具对其进行抛光，当用移液器溶液填充时，其电阻应在4至5MΩ左右对于全细胞配置（将移液器吸头放置在浴液中时，使用膜片钳放大器和pCLAMP记录软件测量移液器电阻）。对于多孔膜片钳，移液器电阻约为1.3-1.6MΩ。
  注意：移液器拔出器的热设置需要针对所需的阻力进行优化。对于不同的机器，情况会有所不同，但是例如，我们将移液器拉拔器（PP-830，Narashige）设置为62°C（1 st 拉力）和48 ° C（2 nd 抽出）用于全细胞贴片移液器（带细丝）并达到6°C（1 st 抽出）和43°C（2 nd 抽出）用于打孔移液管（无细丝）。第二个拉力对于移液器的形状和大小很重要。
2. 使用弯曲的镊子从板中取出盖玻片，将其细胞面朝上放入膜片钳腔中。用细胞外溶液连续灌注细胞（大多数膜片钳装置上都装有重力驱动的灌注系统，以允许在实验过程中连续灌注溶液）。
3. 用相关的细胞内溶液填充移液器（使用连接到微型加载器移液器吸头的1 ml注射器将其充满一半左右），然后轻轻轻拂移液器，然后将其放在移液器支架上，以除去气泡。对于带孔的膜片钳，首先将无两性霉素的细胞内溶液小心地浸入移液器尖端几秒钟，然后用含有两性霉素的储液回填移液器（配方2）。 > 注意：
  1. 去除气泡非常重要，以免损害全细胞进入电阻和电流/膜电位测量值。
  2. 使用非丝状玻璃毛细管作为打孔贴剂是有利的，因为它允许使用不含两性霉素的溶液填充移液器尖端的末端，这有助于通过延迟打孔来形成密封。对于时间“ 浸渍”末端（以填补游离两性霉素溶液的尖端）是很重要的，因为它可以影响到穿孔所述细胞这时必须进行优化所需的时间。通常，我们最初将笔尖“浸入” 2 s，然后观察它如何影响密封的形成和穿孔。如果难以形成密封或在密封形成之前细胞开始穿孔，则需要更长的“浸入”时间。
4. 使用微量操作器将移液器降低到浴液中。补偿移液器偏移后（使用膜片钳放大器），在显微镜下，用移液器接近并轻轻触摸所选的细胞，以使用负压（抽吸）形成高电阻的千兆欧（GΩ）密封。
5. 对于打孔的贴剂，请等待直到进入电阻（Ra）至少达到20MΩ（这取决于两性霉素的功效）。对于全单元格配置，请施加更大的负压以实现全单元格访问。Ra应低于10MΩ。在这两种配置中，都使用膜片钳放大器（具有内置电路来补偿这两个参数）来补偿全电池电容和串联电阻（70-80％）。注意每个电池的全电池电容（Cm）。
6. 为了进行采集，请将滤波器设置为2 kHz，采样率设置为10 kHz。
使用穿孔膜片钳技术进行全细胞滑稽电流（If）测量
1. 记录全电池如果来自SAN电池的电流，则应将放大器设置为电压钳模式（通过放大器接口上的开关来完成）。
2. 以下解决方案可用于检测和测量If 电流：穿孔贴片细胞内溶液和Tyrode细胞外溶液（配方1）。
3. 使用以下步骤协议获取电流-电压关系（参见图1）：将电池保持在-40 mV的保持电位。从-40 mV步进到-130 mV持续1300 ms，然后从+40 mV持续400 ms（此步骤用于研究失活特性），然后回到-40 mV持续350 ms。再重复9次，每步例如，-130，-120，-110 等。
  的增量变化为10 mV。
  
  图1.全细胞穿孔贴片电压钳记录急性分离的鼠类SAN细胞的If电流。 A.代表性全细胞If电流-电压迹线（顶部迹线）和电压钳用于获取它的协议（底部跟踪）。虚线表示从中获取数据以绘制BB中的稳态电流-电压关系的点。SAN细胞中鼠标If电流的稳态电流-电压关系。数据显示为
  平均±SEM，n = 14个细胞/ 6只小鼠。
使用穿孔的全细胞膜片钳进行电位测量（电流钳模式，请参见图2）

图2.电流钳记录，测量急性分离的鼠类SAN细胞的动作电位。 A.代表6 s的自发动作电位来自单个SAN细胞的穿孔贴片配置。B.从A放大，显示可以从动作电位记录中获取的各种参数，例如静息膜电位（RMP），最大舒张电位（MDP），峰值电位，达到峰值的时间和动作电位持续时间（APD）， 50％和90％振幅时的动作电位持续时间（分别为APD50和APD90）。C.使用常规的全细胞膜片钳从单个SAN细胞中代表6s的自发动作电位序列。D.从C放大，显示出BE中的各种参数，使用5 ms，1,000 pA触发信号（下部曲线）显示了BE中的代表动作电位曲线。B和D中显示了各种参数。自发动作电位。
1. 要测量SAN细胞的自发动作电位，请使用以下解决方案：穿孔贴片细胞内溶液（配方3）和Tyrode细胞外溶液（配方1）。
2. 一旦达到足够的全细胞接入电阻并补偿了全细胞参数，就切换到电流钳模式。pCLAMP的y轴标签应更改为mV。
3. 使用无间隙记录协议获取自发动作电位（不应用触发器-无间隙协议是连续记录，除了记录长度以外，没有任何用户定义的参数）。
4. 如果没有触发自发动作电位，则可以使用触发器启动动作电位触发-短5 ms的电流脉冲（通常在300至900 pA之间是最佳的）。触发频率可以根据需要设置。例如，1 Hz（每秒1次触发）或3 Hz（每秒3次触发）。
注意：如果细胞缺乏自发活动，则可以通过注入电流脉冲来触发动作电位。脉冲的大小可能因细胞而异，必须进行优化以触发完整的动作电位。
使用常规的全细胞膜片钳进行动作电位测量（通过放大器接口设置电流钳模式）（见图2）
1. 可以在常规的全细胞膜片钳配置中测量自发和触发动作电位。要在此配置中记录动作电位或膜电位的变化，请使用以下解决方案：全细胞电流钳细胞内溶液（配方4）和Tyrode细胞外溶液（配方1）。
2. 在“进入”整个单元并补偿整个单元的电容之后，切换到电流钳模式。
3. 记录自发或触发动作电位（请参阅过程D）。
注意：全细胞电流钳细胞内溶液的EGTA浓度较低（Ca 2 + 的缓冲较少），这有利于我们更好地记录动作电位。与较高EGTA的细胞内溶液相比，时间更长。

数据分析

可以使用Clampfit（pCLAMP软件包的一部分）对来自电压钳位和电流钳位记录的数据进行初始分析。可以使用MS Excel，Microcal Origin和GraphPad Prism进行进一步分析。
对于钳位电压记录（请参阅Nobles等人，2018年），绘制每个步骤的电压（x）与电流幅度（y）的关系可得出电流（I）-电压（V）的关系（参见图1）。可以使用Cm将电流幅度标准化为像元大小。根据IV关系，例如可以在药理学上挑战细胞时评估激活曲线和电压依赖性的变化。理想情况下，应该对至少5只小鼠分离的细胞进行膜片钳记录。可以从原始电流轨迹中确定更多信息。例如，时间进程以及激活和失活的速率。
可以首先使用Clampfit（pCLAMP软件的分析模块）上的事件检测功能来分析电流钳记录中的动作电位测量值，该功能可测量跳动频率，动作电位幅度，事件间隔和可变性。这也可以在Clampfit上手动完成以进行质量控制。此外，参数包括静息膜电位（RMP），最大舒张电位（MDP），峰值电位，到达峰的时间和动作电位持续时间（APD），振幅为50％和90％时的动作电位持续时间（分别为APD50和APD90））。还可以计算额外的AP持续时间，例如20％，30％等。可以根据动作电位幅度和峰值时间（动作电位幅度（mV）/峰值时间（ms））来计算上冲速度。有关详细信息，请参见2018年Aziz等。。

菜谱

注意：将溶液通过0.22微米的过滤器（Millipore）过滤，并在当天立即使用或等分冷冻。

蒂罗德细胞外液
140 mM 氯化钠
5.4 mM KCI
2.0 mM CaCl 2
1.0 mM氯化镁 2
5毫米HEPES
5.5 mM D葡萄糖
用NaOH调节pH至7.4
两性霉素原液（60 µg / µl）
3毫克两性霉素B
50 µl DMSO
彻底涡旋（如果溶解有问题，可能需要超声处理）。该溶液可以分装并在-20°C下保存长达2周
工作浓度为240 µg / ml（1 ml细胞内溶液中4 µl储备液）
多孔膜片钳细胞内溶液
130 mM L-天门冬氨酸
10 mM NaCl
2.0 mM ATP-钠盐
0.1 mM GTP-Mg盐
6.6 mM磷酸肌酸
0.04 mM氯化钙 2
10 mM HEPES
用KOH调节pH到7.2
全细胞电流钳细胞内溶液
130 mM葡萄糖酸钾
20 mM KCI
0.5 mM 氯化镁 2
2.0 mM ATP-Mg盐
0.3 mM GTP-Na盐
5.0 mM磷酸肌酸
0.05 毫米EGTA
10 mM HEPES
用KOH调节pH值至7.4
注意：在细胞内溶液中使用KOH代替NaOH，以免显着改变细胞内Na + 的浓度，从而改变动作电位特性。
层粘连蛋白涂层盖玻片
1. 将盖玻片放在12孔板的各个孔中。在每个盖玻片上1 µl 1 mg / ml层粘连蛋白
2. 用P200移液器吸头将层粘连蛋白均匀地铺在盖玻片上
3. 使用前至少要晾干一个小时

致谢

我们要感谢BHF的资助（RG / 15/15/311742）。这项工作得到了位于Barts的NIHR生物医学研究中心的协助。特别感谢Mangoni博士允许Nobles博士访问他的实验室以学习鼠SAN心肌细胞分离的程序。

利益争夺

作者没有竞争利益。

伦理

所有实验均按照英国内政部法规（由项目许可证PE9055EAD 覆盖）和美国国立卫生研究院（NIH第85-23号出版物，1996年修订）发布的《实验动物的护理和使用指南》进行。）。

参考文献

阿齐兹（Aziz，Q.），芬拉（M. Finlay），蒙塔涅（Montaigne），D。奥贾克（Ojake），李（Y.），安德森（N. 窦房结中的ATP敏感钾通道有助于控制心率和适应低氧。 J Biol Chem 293（23）：8912-8921。
Q.Aziz，M.Nobles和A.Tinker（2020年）。从鼠中性心房淋巴结急性分离细胞。生物协议 10（1）：e3477。
Hamill，OP，Marty，A.，Neher，E.，Sakmann，B。和Sigworth，FJ（1981）。改进了膜片钳技术，用于从细胞和无细胞膜片中进行高分辨率电流记录。 Pflugers Arch 391（2）：85-100。
诺布尔（Nobles，M.），蒙田（Montaigne），D。塞巴斯蒂安（Sebastian），S。伯恩鲍默（Birnbaumer）和A. 抑制性G蛋白同工型对成年鼠心房G蛋白门控内向K +电流的不同作用。 Am J生理细胞生理学 314（5）：C616-C626。