SOB在氧化过程中会消耗分子氧，并生成硫酸盐（SO 4 2-）和两个质子（H + ）。H + 的产生会酸化培养基，从而降低pH值并增加EC（Oh et al。，2011）。在向水介质中的SOB反应器中引入有毒污染物后，SOB的生长和氧化受到抑制，导致EC的增加降低（Hassan et al。，2013）。但是，土壤的异质性及其吸附硫酸根离子的能力阻止了土壤中EC的增加，这使EC的使用成为使用SOB评估土壤毒性的不可靠指标。我们提出的方法引入了土壤接触毒性的直接接触评估，该评估是在一定的培养时间内使用SOB消耗的氧气作为新参数。

材料和试剂

0.5和2.0毫米测试筛（Chunggye Sanggong sa，首尔，韩国）
硫磺颗粒（MIDAS-SG，韩国美原商业有限公司）
10 ml玻璃注射器（印度Truth，Top Syringe Mfg Co（P）Ltd）
12 L塑料容器（进水和出水槽）
1.3升制成的丙烯酸容器（0.13 mx 0.13 mx 0.15 m）
6个DRAM CLR圆形玻璃小瓶20-400TD（KD品牌，目录号324020-2385）
不锈钢丝试管架（型号：TRS-2350，目录号：ROI-11-590）
20 MMX.100 PTFE铁氟龙橡胶塞（857518197L-610050-20，USA）
开顶螺帽（Daihan Scientific，WH.W240506螺帽，螺钉，8-425）
塑料秤盘（韩国实验室，B17-132-034-1815-002）
CuSO 4 ·5H 2 O （Sigma-Aldrich，目录号：209198-100G）
（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O （大荣，目录号：1073-4475）
FeSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：7782-63-0）
NH4Cl（纯正，目录号：18075-0350）
KCl（大荣，目录号：6566-4400）
NaH 2 PO 4 （大中，目录号：7615-4400）
Na2HPO 4 （大中，目录号：7613-4400）
NaHCO3（大田，目录号：7566-4400）
酵母提取物（酵母菌，目录号：212750）
CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3881-500G）
MnCl 2 ·4H 2 O（大中，目录号：5526-4400）
ZnSO 4 ·7H 2 O（大中，目录号：8607-4400）
K2Cr2O7（大荣，目录号：6572-4400）
CoCl 2 ·6H 2 O
洗碗精
合成培养基（请参见食谱）

设备

可调体积的微量移液器，0-200μl和100-1,000μl（美国Biorad Industries）
冷藏低温BOD培养箱（JSI Industries，韩国JSBI-150C）
摇动水浴（Lab Companion BS-31（55 L），型号：SKU：V018。AAH44311K）
数字精密水浴锅（大韩科学，韩国WB-11）
电导率仪（路创，型号：YK-2005CD）
数字电子秤（Scharwz，型号：SCH1812S）
气泵（PhilGreen，型号：BT-6500）
用于硫磺主培养反应器（SMCR）的20-30 cm柔性空气喷雾器
蠕动泵（Techno，实验室系统，型号：PP-150D；韩国POOLIM。CO）
Cisa BA 200N电磁数字筛振动筛（西班牙Cisa Cedaceria Industrial SL）
MasterFlex蠕动管

软件

Sigmaplot（Systat软件公司， https://systatsoftware.com/products/sigmaplot/ ）
Toxicalc（Tidepool科学软件， https://tidepool-scientific.com/ToxCalc/ToxCalc.html）

程序

硫主培养反应器（SMCR）
1. 维护SMCR可以为土壤毒性测试提供附着在硫颗粒上的一致且可重复的SOB培养物。
2. 在保持在38°C的培养箱中，准备工作容量为0.6 L的1.3 L由丙烯酸制成的SMCR。
3. 将500 ml 0.5-2 mm的硫颗粒放入装有600 ml合成培养基（配方中给出）的SMCR中（图1A），并保持在38°C的温度下。
4. 使用柔性空气扩散器和气泵以2-3 L / min的流速将空气引入SMCR，并在培养箱中以分批进料模式运行反应器。进水口和气泵也应放置在培养箱中，以保持38±1°C的温度。
5. 使用来自废水处理厂的10毫升需氧返回活性污泥作为初始接种物。
6. 使用合成培养基（38°C）以5分钟（20 ml / min）和2小时55分钟的分批反应模式循环喂入SMCR。
7. 或者，可以使用1 L烧杯手动操作SMCR，方法是每天两次喂入100 ml培养基并浪费100 ml培养基。
8. 可以通过监测EC的变化来确定SMCR中SOB的活性。EC的增加表明SMCR中SOB的增长。在使用SMCR进行毒性测试之前，应以补料分批方式连续运行5天以上。
  
  图1.硫磺主培养反应器（A）和毒性测试瓶（B）
土壤收集
1. 清除采样现场存在的所有砾石，混凝土和植物残渣。
2. 使用铲子或不锈钢勺子从0-30厘米的深度收集土壤。
3. 将土壤样品完全装入带标签的容器或袋子中，以除去任何顶部空间，并立即转移到实验室。
4. 将土壤样品通过2毫米筛。将过筛的样品保存在密封的塑料容器中，直到用于毒性测试为止。
土壤毒性测试
1. 将1克土壤样品放入配有塑料盖和特氟龙衬里橡胶塞的25毫升平底玻璃瓶中。
2. 将5 ml NMB培养基加到置于38°C水浴中的玻璃瓶中，以保持38°C的培养基温度（图2A）。
3. 当介质温度达到38°C时，小心地将10 g SOB附着的硫颗粒转移到保持在38°C水浴中的玻璃小瓶中（图2A）。
4. 为氧气分配了15.0 ml的液上空间（图1B）。用纯氧吹扫顶部空间6秒钟。
5. 立即用塑料盖和衬有特氟龙的橡胶塞子盖住小瓶。立即将这些准备好的小瓶转移到设置在38°C的振荡水浴中，并以90 rpm的速度搅拌10分钟。
6. 之后，将小瓶从振荡水浴中取出。通过将26 G的针头插入Teflon橡胶塞中5秒钟来平衡压力，然后立即在振荡水浴中重新孵育。
7. 运行两个对照样品：一个未污染土壤的对照样品；另一种是没有土壤（即NMB介质和硫颗粒中含有SOB）。
8. 一式三份运行对照和测试样品。由于SOB活性与温度有关，因此在整个样品制备过程中都严格保持温度（38°C）。
9. 在振荡水浴中孵育和搅拌6小时后，使用润滑玻璃注射器方法测量氧气消耗量。简而言之，SOB消耗的氧气量可以通过将玻璃柱塞移入注射器针筒中来测量。在测量每个小瓶中SOB消耗的氧气量之前，使用在100毫升蒸馏水中的两滴洗碗液洗涤剂组成的水溶液对玻璃注射器的柱塞和针筒进行润滑。润滑注射器后，将柱塞设置在10 ml标记处，然后将针平行于地面通过特氟龙橡胶塞插入测试瓶中。允许柱塞移动到注射器的针筒中，并在大气压之间达到平衡。注射器上的值对应于SOB消耗的氧气量，即测试瓶顶部空间的氧气减少（图2B）。
  注意：温育6小时后，水分控制中的耗氧量应超过5 ml，以可靠地确认对土壤的毒性。
  
  图2.测试小瓶，其中包含污染的土壤，硫颗粒和保存在水浴中的培养基（A），并通过10毫升玻璃注射器（B）测量耗氧量

数据分析

通过玻璃注射器方法确定在每个测试瓶的顶部空间中消耗的氧气的减少。由等式确定所测试的有毒化学物质对土壤中SOB活性的抑制作用。2.

图3给出了污染土壤的结果，该结果显然显示出比未污染土壤（对照）的耗氧量少。A和B样品的测定抑制率（％）分别为89.4％±4.2和99.4％±0.97。

图3.污染土壤样品的耗氧量

菜谱

合成培养基
1. 营养矿物质缓冲溶液
  3.1 g / L NH 4 Cl
  1.3 g / L氯化钾
  4.22 g / L NaH 2 PO 4
  2.75 g / L Na 2 HPO 4
2. 微量矿物质溶液
  7.34 mg / L CaCl 2 ·2H 2 O
  5 mg / L FeSO 4 ·7H 2 O
  2.5 mg / L MnCl 2 ·4H 2 O
  2.5 mg / L ZnSO 4 ·7H 2 O
  0.5 mg / L（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O
  0.5 mg / L CoCl 2 ·6H 2 O
  0.2 mg / L CuSO 4 ·5H 2 O

用蒸馏水（pH 6.8-7.0）将营养矿物质缓冲溶液（配方1a）稀释100倍后，添加以下成分：
200 mg / L NaHCO 3
5 ml / L微量矿物质溶液（配方1b）
50 mg / L酵母提取物

致谢

这项研究得到了韩国环境省“ SEM项目：2018002450001”的支持

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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