材料和试剂

24孔板（Corning，目录号：3563847）
T-75烧瓶（Corning，目录号：431464）
Falcon ® 50 ml高清晰度PP离心管（Corning，目录号：352070）
Posi-Click 1.7 ml微量离心管（Denville，目录号：C2170）
10毫升注射器（BD，货号：309695）
25 G和18 G针（BD）
C57BL / 6小鼠（6-8周大）
细胞系：Jurkat，克隆E6-1（ATCC，目录号：TIB-152）
胎牛血清（Thermo Fisher，目录号：16000）
RPMI 1640 Medium，GlutaMAX TM 补充剂和HEPES（Thermo Fisher，目录号：72400）
青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher，目录号：15140）
GlutaMAX TM 补充（Thermo Fisher，目录号：35050）
星形孢菌素（Sigma-Aldrich，目录号：19-123）
DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher，目录号：14190）
FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I（BD Pharmingen，目录号：556547）
小鼠IL-10 ELISA试剂盒（BD，目录号：565252）
BD BBL脱水培养基（Fisher Scientific，目录号：211716）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D2560）
70％乙醇
Jurkat T细胞的完整培养基（请参见配方1）
3％（w / v）Brewer巯基乙酸盐培养基（请参见配方2）
1x绑定缓冲区（请参阅配方3）
RPMI-1640-10（请参阅第4章）
0.5 mg / ml星形孢菌素（1,000x存量）（请参见第5条）

设备

组织培养罩（生物安全柜，Forma Scientific，型号：1284）
37°C，5％CO 2 加湿培养箱（Thermo Forma，型号：3110 Series II）
离心机（Thermo Scientific，ST8台式离心机）
光学显微镜（奥林巴斯，CK30）
流式细胞仪（BD，FACSCalibur）
无菌手术剪刀（Miltex，MH5-302）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：02-671-5）
高压灭菌器

软件

FlowJo软件（7.6.1）
GraphPad Prism

程序

传代Jurkat细胞系
1. 将生长中的细胞从T-75烧瓶转移到50 ml离心管中，然后在室温下以300 x g 离心5分钟。
2. 除去并丢弃上清液（细胞沉淀上方的旧生长培养基），然后用新鲜的完整生长培养基重悬细胞沉淀。
3. 将适量的Jurkat细胞悬液添加到一个新的T-75烧瓶中，该烧瓶中装有15 ml完全生长培养基，每10天约有10 5 个活细胞/瓶，并每3-4天传代培养一次。
4. 将培养瓶置于37°C，5％CO 2 湿润培养箱中。
诱导Jurkat细胞凋亡
1. 通常在播种后两天收获指数生长的Jurkat细胞（初始浓度为2 x 10 5 细胞/ ml，最终浓度为6-8 x 10 5 细胞/ ml ），以300 xem 的速度离心5分钟（Jurkat细胞的继代培养/收获/洗涤步骤相同）。
2. 将细胞重悬于新鲜培养基中至终浓度为1 x 10 6 细胞/ ml，并接种到新的T-75烧瓶中。另一个烧瓶将用作未诱导细胞的阴性对照（请注意，将有两组，一组用于凋亡，另一组用于非凋亡对照组）。
3. 将星形孢菌素添加到Jurkat细胞培养物中，终浓度为0.5μg/ ml，并在37°C，5％CO 2 湿润培养箱中孵育6-8小时。将相同体积的DMSO加入对照Jurkat T细胞培养物中。
4. 加入星形孢菌素/ DMSO后，通过将2 ml细胞培养基转移到新鲜的Falcon管中并离心，收获细胞以在不同时间（即，3、6、12 h）染色。继续在37°C，5％CO 2 湿润培养箱中于T-75烧瓶中培养其余细胞。
FITC Annexin V凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞凋亡
1. 用冷DPBS洗涤两次收获经星形孢菌素处理的Jurkat细胞，以终止反应。
2. 在1x结合缓冲液中以5 x 10 6 细胞/ ml的浓度重悬细胞。
3. 将100μl溶液（〜5 x 10 5 细胞）转移至新的1.7 ml微量离心管中
4. 加入2μlFITC Annexin V和2μlPI，轻轻涡旋细胞，在室温下孵育15分钟或在冰上孵育30分钟，在任何一种情况下均避光。
5. 向每个试管中加入400μl1x结合缓冲液，洗涤两次（以400 x g 离心5分钟），并在1小时内通过流式细胞仪进行分析（图1）。
  
  图1.星形孢菌素诱导的Jurkat细胞凋亡。诱导后6 h，通过Annexin V和碘化丙锭（PI）染色的流式细胞仪分析了早期和晚期凋亡细胞的百分比。。数字表示亚种群的百分比。
腹腔注射巯基乙酸盐
1. 用25 G针将10％的注射器充满3％Brewer巯基乙酸盐培养基。
2. 每只小鼠将2 ml溶液注入腹膜腔，使炎症反应持续4天。
收获和培养巯基乙酸盐引起的腹膜巨噬细胞
1. 用CO 2 对小鼠实施安乐死，并用70％的乙醇清洁腹部。
2. 用无菌剪刀沿中线做一个小切口，然后手动缩回腹部皮肤，露出透明的腹膜壁。
3. 用9 ml DPBS或RPMI-1640-10（配方4）填充10 ml注射器，然后用25 G针将收获培养基注入腹膜腔。
4. 按摩腹部约30 s，并使用10毫升18 G针注射器恢复腹腔积液而不会刺破任何腹部器官（每只小鼠可回收约8毫升液）（视频1）。
  
  视频1.收获腹膜巨噬细胞（步骤E2-E4）
5. 从注射器上取下针头，将腹膜液分配到冰上的15 ml离心管中（在整个过程中应保持细胞冷却）
6. 在冷藏离心机中以400 x g 的速度离心腹膜细胞5分钟。弃去上清液，然后轻轻地上下移液，将细胞沉淀重悬于5 ml RPMI-1640-10培养基中。
7. 使用血细胞计数器对细胞进行计数（将100μl细胞悬液与900μl锥虫蓝混合，以1:10稀释）。
8. 用RPMI-1640-10调节细胞浓度，并以5 x 10 5 细胞/孔（每孔500μl培养基）的浓度接种到24孔板中。
9. 通过在37°C，5％CO 2 湿润培养箱中培养2-3小时，使细胞粘附到板上。通过用1 ml加热的PBS轻轻洗涤3次来去除非贴壁细胞（剩余细胞应大于90％巨噬细胞）。
用凋亡的Jurkat细胞刺激腹膜巨噬细胞
1. 过夜培养后，用500μl不含FBS的RPMI-1640更换腹膜巨噬细胞的培养基。
2. 以5：1的比例将100μl诱导和评估的凋亡Jurkat细胞（悬浮在无FBS的RPMI-6140中，浓度为25 x 10 6 细胞/ ml）。
3. 凋亡细胞攻击后8小时，16小时收获细胞培养上清液。
4. 在冷藏离心机中以500 x g 离心收集的样品10分钟，然后小心地将澄清的上清液（〜600μl）转移到新试管中，而不会干扰细胞沉淀。
通过ELISA检测IL-10的产生（图2）

图2.巨噬细胞响应凋亡细胞而产生IL-10。用凋亡的Jurkat细胞（AC）刺激5 x 10 5 巯基乙酸盐诱导的腹膜巨噬细胞（5：1）交流电与巨噬细胞的比例），并分析IL-10的产生。

数据分析

使用FlowJo软件（7.6.1）进行分析。平均三个独立的重复样本，以获得每个样品的单次读数。
要评估Jurkat细胞的凋亡，请使用未染色的阴性对照来确定膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）阳性细胞的绝对边界。确保将对照细胞（DMSO处理过的细胞）产生的数据与未染色的阴性对照进行比较。
对于ELISA，请减去空白样品的值，以避免背景读数。
平均值和标准差（SD）用作描述性统计数据。两组之间的比较使用未配对的双尾学生 t 检验（ P <0.05被认为具有统计学意义）。

菜谱

Jurkat细胞的完整培养基
RPMI 1640培养基，GlutaMAX TM 补充剂和HEPES（450毫升）
50毫升（10％）胎牛血清
5毫升（100x）青霉素-链霉素
5毫升（100x）GlutaMAX TM 补品
3％（w / v）布鲁尔巯基乙酸盐培养基
1. 将30 g BD BBL脱水培养基（Fisher science）悬浮在1000 ml蒸馏水中，并高压灭菌。
2. 冷却后，等分至50 ml离心管中，可在室温下于黑暗中保存3个月
1个绑定缓冲区
10x Annexin V结合缓冲液（组分编号51-66121E）：0.1 M HEPES / NaOH（pH 7.4），1.4 M NaCl，25 mM CaCl 2
对于1倍的工作溶液，请将1倍的10倍的Annexin V结合缓冲液稀释至9份的蒸馏水
注意：应重新准备1x绑定缓冲区。
RPMI-1640-10
要准备RPMI-1640-10，请另外添加含10％（v / v）胎牛血清的RPMI-1640培养基
0.5 mg / ml星形孢菌素（1,000x存量）
1. 在400μl二甲基亚砜（Sigma-Aldrich）中溶解200μg星形孢菌素（Sigma-Aldrich）
2. 分装并保存在-20°C并在每次使用前解冻等分

致谢

这项工作得到了XM的NIH资助（1R21AI110815）的支持。该协议改编自Chung EY 等人。（2007年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

钟永安，刘健，霍马，Y。，张永健，布伦多兰，A。萨格斯，M。，韩健，西尔弗斯坦，R。，塞勒利，L和马X.（2007 ）。凋亡细胞吞噬过程中巨噬细胞中白介素10的表达是由同源域蛋白Pbx1和Prep-1介导的。免疫力 27（6）：952-964。