材料和试剂

35毫米培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号FB0875712）
血清移液管，50 ml
1 L高压灭菌瓶，用于制造和储存培养基
保鲜膜
微孔胶带（3M，目录号：1530-0）
花盆12厘米
钳子
竹烧烤串，30厘米
铝箔
小筛网或Whatman TM 3MM Chr色谱纸（GE Healthcare，目录号：3030917），用于去除种子中的谷壳
2 ml防沸腾微量离心管（VWR International，目录号：76332-080）
1.5 ml微量离心管（VWR International，目录号：87003-294）
15 ml无菌聚丙烯锥形离心管（例如，康宁生命科学，目录号：431470）
50 ml无菌聚丙烯锥形离心管（例如，康宁生命科学，目录号：431472）
用于1.5毫升和2毫升试管的塑料架子
塑料巴斯德吸管5.8 ml（VWR International，目录号：612-4494）
装有振动筛上管的塑料盒
微量移液器的提示
耐化学手套（ eg ，VWR International丁腈检查手套，目录号：82026-426）
带腔的玻璃显微镜载玻片（ eg ，Ted Pella，目录号：260241）
面罩
护目镜
冰桶
泡沫包装
涡旋样品的小盒子（尖端盒盖很理想）
12 ml 16 x 100 mm KIMAX管，带PTFE表面橡胶衬里盖（VWR International，目录号：SCERSP45066A-16100）
KIMAX管的试管刷
瓷杵和臼，50毫升容量（ eg ，Coorstek，目录号：60310）
2毫米和1毫米氧化锆（二氧化锆）珠
2 ml旋盖管（例如，Precellys 2 ml带O形圈的空增强管，目录号：9000538）
紫外线注射器过滤器，直径4毫米，尼龙，孔径0.45μm（色谱专业，目录号：CSUV04N451）
1 ml BD结核菌素注射器（VWR International，目录号：309659）
Kimwipes（Kimtech，目录号：34120）
200μl螺口微型瓶（色谱专业，目录号：C581311）
HPLC小瓶的顶盖（色谱专业，目录号：C223711M）
8毫米，0.060英寸天然PTFE /硅胶隔垫（色谱专业，目录号：C243M）
干冰
钌红，用于显微镜检查（西格玛奥德里奇，目录号：00541）
无水碳酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S263）
碳酸氢钠（小苏打）
meso -赤藓糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7500）
L-（-）-岩藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：F2252）
L-（+）-阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
L-鼠李糖（Sigma-Aldrich，目录号：R3875）
D-（+）-半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G6404）
D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
D-（+）-甘露糖（Sigma-Aldrich，目录号：M2069）
D-（+）-木糖（Sigma-Aldrich，目录号：X3877）
D-（+）-半乳糖醛酸（Sigma-Aldrich，目录号：48280）
硫酸，获得ACS Plus认证（Thermo Fisher Scientific，目录号：A300-212）
95％乙醇
超纯水中的70％乙醇（v / v）
HPLC级甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34885）
超纯水中的80％HPLC级甲醇（v / v）
HPLC级丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：439126）
氢氧化钠溶液（50％w / w合格的NaOH，Thermo Fisher Scientific，目录号：SS254-4）
无水乙酸钠（CH 3 COONa，Thermo Fisher Scientific，目录号：S210-500）
超纯水（25°C时为18.2MΩcm）
琼脂（Thermo Fisher Scientific，目录号BP1423）
1 M KOH用于调节培养基的pH
5号阳光混合料（Sungro）或您选择的生长培养基（请参见注释）
在最小培养基上，添加或不添加琼脂（请参见食谱）
20 mM碳酸钠溶液（请参阅食谱）
钌红溶液（请参阅配方）
100 mM单糖储液（请参见食谱），在-20°C下储存
72％（w / w）硫酸（请参阅食谱）
单糖标准品的稀释系列（请参见食谱）
meso -赤藓糖醇溶液，5 mg / ml（请参阅食谱），在-20°C下储存
1 M NaOH（HPAEC-PAD洗脱液）（请参阅配方）
200 mM NaOH（HPAEC-PAD洗脱液）（请参阅配方）
1 M乙酸钠（HPAEC-PAD洗脱液）（请参见食谱）

设备

微量移液器，容量从5μl到1 ml
5 ml，10 ml，100 ml，1.5 L和2 L容量瓶
100毫升烧杯
3 x 2 L带有塞子和真空管的真空侧臂烧瓶，用于对HPAEC洗脱液进行脱气
pH计
磁力搅拌器和搅拌棒
高压釜
具有光照水平和温度控制的生长室（用于平板和植物生长至成熟）
分析天平
微量离心机
实验室平衡
具有3英寸平台的Vortex混合器（Scientific Industries，Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
轨道振动筛（New Brunswick Scientific，Innova 2000平台振动筛）
带照相机的解剖显微镜或复合显微镜（例如，带有Leica DFC450C的Zeiss Axioscop2和Leica应用套件4.2）
通风柜
带有Reacti-Therm加热模块的Reacti-Vap蒸发器（Thermo Fisher Scientific，目录号：TS-18825）（Thermo Fisher Scientific，目录号：TS-18822）
氮气（N 2 ）气体（Praxair，NI MT），已连接到Reacti-Vap
制冰机
进入真空管线（例如，建筑物整体真空）以对HPAEC-PAD解决方案进行除气
离子色谱法（IC）：Dionex DX600系统配备如下：
1. AS50自动进样器
2. GP50梯度泵
3. ED50电化学检测仪
4. CarboPac PA1标准孔保护罩（4 x 50 mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：043096）
5. CarboPac PA1分析柱（4 x 250 mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：035391）

软件

Chromeleon 6.8色谱数据系统软件（Thermo Fisher Scientific，Dionex）
Python 2.7（ https://www.python.org/download/releases/2.7/）
科学Python（SciPy）软件包（ https://www.scipy.org/install.html ）
记事本++（Don Ho， https://notepad-plus-plus.org/ ）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

用于HPAEC分析的种子生长
正确生长种子以进行HPAEC分析至关重要，因为如果种子未完成发育，黏液释放会受到损害。使用标准的生长条件，一起生长野生型和突变体以及浇水直到种子发育完成，这非常重要，如下所述。此外，有关生物复制品制备的详细信息，请参见注释。
1. 在陪替氏培养皿中用琼脂将所有基因型的种子播种在拟南芥 AT培养基上。种子不需要消毒，因为这种培养基不含糖。
2. 用微孔带密封板。
3. 置于连续光（100-150μmol/（s m 2 ）光合有效辐射PAR）下20°C的生长室中。
4. 7-10天后移植幼苗。
  1. 为每种基因型准备一个12厘米的土壤混合料（请参阅注释）。
  2. 将30毫升不含琼脂的AT培养基加入土壤顶部。
  3. 使用镊子将每种基因型的8棵幼苗移植到一锅土壤中。
  4. 盖上保鲜膜以保持湿度。
  5. 返回生长室。
  6. 3-4天后取下保鲜膜。
5. 一旦植物结实（3-4周），就在每个盆中收集所有八种植物的花序茎，并用铝箔将它们绑在竹桩上。
6. 给植物浇水，直到最后一个角果变黄并开始变干。
7. 收获种子，并收集相同基因型的种子。确保除去种子上的所有谷壳。可以使用小筛子（注意在不同批次的种子之间进行清洁）或通过在粗糙的纸上收集种子（例如 Whatman 3MM纸），然后倾斜并轻轻摇动纸以使种子健康卷到第二张纸上，留下谷壳和未发育的种子。种子可以在两张纸之间转移几次，直到种子没有谷壳为止。
拟南芥种子挤压粘液的制备。戴上耐化学药品的手套和实验室外套
1. 确定在水溶液中水合的成熟种子的最佳粘液释放。
  1. 将每种基因型（包括野生型）约50粒种子分别放入2 ml试管中。
  2. 加入1 ml超纯水，并以最大速度涡旋5秒钟，以润湿种子。
  3. 将试管放在足够大的盒子中，以便试管自由滚动，然后以130 rpm的速度放在定轨摇床上。
  4. 摇动1小时后，移开试管，将其垂直放置在试管架中，让种子静置1-2分钟。
  5. 使用巴斯德塑料移液器，在不干扰种子的情况下，尽可能多地除去并丢弃水。
  6. 加入1 ml的0.01％钌红溶液，然后以130 rpm的速度将试管放回振荡器的盒子中。
  7. 1小时后，将试管移到架子上，让种子静置1-2分钟，然后像以前一样移走并丢弃钌红。
    注意：一旦变色，不要让种子变干，因为粘液不会再水化形成种子周围的光环。
  8. 加入0.5 ml超纯水，然后将种子转移至空心玻片（无需盖玻片）。
  9. 使用复合显微镜以低放大倍数（5x）查看种子，并通过比较野生型对照和感兴趣的基因型之间的晕圈大小来确定水是否有效释放了粘液[图1，将野生型（A）与 mum2比较（B）]。
  10. 如果用水不能有效释放粘液，请用碳酸钠溶液代替水重复整个过程。许多基因型 eg ， mum2 将在碳酸钠中释放出比水中更多的粘液[图1，将水中（em）中的 mum2 与<碳酸钠（D）中的em> mum2 。为了比较，包括用碳酸钠（C）处理的野生型]。确定碳酸钠的最低浓度非常重要，因为碳酸钠会干扰单糖的HPAEC-PAD检测，因此可以有效释放粘液。使用20 mM碳酸钠从 mum2 释放粘液。比较用水释放的粘液和碳酸钠释放的粘液的成分。
    
    图1.在野生型（A）和 mum2 （B）中用水处理后，并在用20野生型（C）和 mum2 （D）中的mM碳酸钠。比例尺= 500μm。
    注意：染色过程中已去除了非粘性粘液。
  11. 确定了最佳的粘液释放后，请继续执行步骤B2。（在水中制备挤出的粘液）或下面的B3（在碳酸钠中制备的挤出粘液）。
2. 在水中制备挤出的粘液。使用按照A中所述生长的种子，并记录批次。
  1. 通过称重每个重复约20 mg种子，为每种基因型准备4个重复。记录每次重复的精确重量。
  2. 将每个复制品放入2 ml试管中，并加入1.4 ml超纯水。确保所有种子都悬浮在溶液中，而不是通过涡旋5秒钟而漂浮在表面上。
  3. 加入5μl5 mg / ml的 meso -赤藓糖醇内标。
  4. 通过在3英寸涡旋混合器上放一个塑料盒，准备样品进行涡旋处理，并用侧面放置的试管填充样品，所有试管的方向相同。在包装盒中装满气泡包装纸，并用胶带将其牢固固定，以确保管子不会移动。有关去除粘液的更多详细信息，请参见注释。
  5. 在涡旋混合器的“涡旋＃3”设置上涡旋2小时。
  6. 样品涡旋时，准备标准液（有关重要的技术注意事项，请参见注释）。必须准备，处理新标准并与每组样品一起运行。
    1. 将100 mM单糖原液稀释至2 mM，然后进行系列稀释以提供1 mM，0.5 mM，0.25 mM，0.125 mM，0.0625 mM溶液，以提供总共6种糖标准液（请参见食谱）。
    2. 将每种糖标准品0.5 ml转移到KIMAX管中。
    3. 将5μl5 mg / ml meso -赤藓糖醇添加到每个标准品中。
  7. 从涡旋混合器中取出样品，放在试管架上，让种子沉降1-2分钟。不要离心，因为粘液会沉淀。
  8. 将1 ml含黏液的上清液移至KIMAX管中。请参阅注释以正确清洁管子。
  9. 去除粘液后，按照步骤B1e-B1i所述，用钌红对种子染色，并拍照以记录去除了多少粘液。
  10. 使用Reacti-Vap，在60°C的N 2 气流下干燥样品和标准品（分批）。干燥后，可根据需要将管盖好并储存在-20°C下。
  11. 在通风橱中，戴上安全眼镜，向每个样品和标准液中添加17.4μl72％的硫酸，并盖上试管。
  12. 将样品和标准品在冰上孵育2小时，每30分钟通过最大涡旋5-10秒进行混合。
  13. 在通风橱中，添加482.6μl超纯水，使最终浓度为4％硫酸。
  14. 在121°C（15 psi / 1 Bar / 1 ATM）上拧紧瓶盖并高压灭菌1小时。
  15. 从高压釜中取出，使其冷却。
  16. 在通风橱中，将样品转移到干净的1.5 ml试管中，并以16,000 x g 的速度离心1分钟以沉淀碎片。
  17. 使用1 ml注射器和0.45μm尼龙注射器过滤器将样品和标准品过滤到干净的1.5 ml管中。如果有“爆裂”声，请用Kimwipe包裹注射器和过滤器之间的连接点。
    注意：如果样品很难过滤，则过滤器被堵塞，应更换。
  18. 将每个样品200μl装入带盖和隔垫的HPLC小瓶中。样品和标准品可保存在-20°C的HPLC小瓶或1.5 ml试管中，以防止微生物滋生。
3. 在碳酸钠中制备挤出的粘液。这里描述的协议是用于挤出20 mM碳酸钠中的粘液。如果使用不同的浓度，应调整添加的72％硫酸的量，因为某些碳酸盐会与硫酸反应并改变最终浓度。有关更多详细信息，请参见注释。使用按照A中所述生长的种子，并记录批次。
  1. 通过称重每个重复约20 mg种子，为每种基因型准备4个重复。记录每次重复的精确重量。
  2. 将每个复制品放入2 ml试管中，然后加入1.4 ml 20 mM碳酸钠。确保所有种子都悬浮在溶液中，而不是通过涡旋5秒钟而漂浮在表面上。
  3. 加入5μl5 mg / ml的 meso -赤藓糖醇内标。
  4. 通过在3英寸涡旋混合器上放一个塑料盒，准备样品进行涡旋处理，并用侧面放置的试管填充样品，所有试管的方向相同。在包装盒中装满气泡包装纸，并用胶带将其牢固固定，以确保管子不会移动。有关去除粘液的更多详细信息，请参见注释。
  5. 在涡旋混合器的“涡旋＃3”设置上涡旋2小时
  6. 样品涡旋时，准备标准液（有关重要的技术注意事项，请参见注释）。必须准备，处理新标准并与每组样品一起运行。
    1. 将100 mM单糖原液稀释至2 mM，然后进行系列稀释以提供1 mM，0.5 mM，0.25 mM，0.125 mM，0.0625 mM溶液，以提供总共6种糖标准液（请参见食谱）。
    2. 将每种糖标准品0.5 ml转移到KIMAX管中。
    3. 加入5μl5 mg / ml meso -赤藓糖醇和1 ml 20 mM碳酸钠。如果将不同浓度的碳酸钠用于粘液提取，则此处的添加量应调整为与以下步骤B3h中取出的1 ml样品相同。
  7. 从涡旋混合器中取出样品，放在试管架上，让种子沉降1-2分钟。不要离心，因为粘液会沉淀。
  8. 将1 ml含黏液的上清液移至KIMAX管中。请参阅注释以正确清洁管子。
  9. 去除粘液后，按照步骤B1e-B1i所述，用钌红将种子染色，以记录去除了多少粘液。
  10. 使用Reacti-Vap，在60°C的N 2 气流下干燥样品和标准品（分批）。干燥后，可根据需要将管盖好并储存在-20°C下。
  11. 在通风橱中，戴上安全眼镜，向每个样品和标准液中添加19.07μl的72％硫酸，并盖上试管。
  12. 在冰上孵育样品和标准品2小时，每30分钟通过最大涡旋5-10 s进行混合。
  13. 在通风橱中，添加480.9μl超纯水，使最终浓度为4％硫酸。
  14. 在121°C（15 psi / 1 Bar / 1 ATM）上拧紧瓶盖并高压灭菌1小时。
  15. 从高压釜中取出，使其冷却。
  16. 在通风橱中，将样品转移到干净的1.5 ml试管中，并以16,000 x g 的速度离心1分钟以沉淀碎片。
  17. 使用1 ml注射器和0.45μm尼龙注射器过滤器将样品和标准品过滤到干净的1.5 ml管中。如果有“爆裂”声，请用Kimwipe包裹注射器和过滤器之间的连接点。
    注意：如果样品很难过滤，则过滤器被堵塞，应更换。
  18. 将每个样品200μl装入带盖和隔垫的HPLC小瓶中。样品和标准品可保存在-20°C的HPLC小瓶或1.5 ml试管中，以防止微生物滋生。
从成熟的完整种子制备酒精不溶性残留物（AIR）。使用按照A中所述生长的种子，并记录批次
1. 通过称重每个重复约20 mg种子，为每种基因型准备4个重复。记录每次重复的精确重量。
2. 使用以下技术之一将种子均质化：
  1. 将每个复制品放入1.5毫升试管中，并将种子在1.5毫升试管中的干冰中冷冻。用干冰冷却研杵和研钵，将冷冻的种子研磨成细粉，然后将冷冻的粉末转移回1.5毫升试管中，并保存在干冰上。该过程产生了很好的结果，但是很费时。
  2. 将每个复制品放入带有3至5个2 mm氧化锆珠的2 ml螺帽管中，在干冰上冷冻，并在组织匀浆器中以6,500 rpm的转速破碎20 s。选择不会在组织均质器中破裂的试管非常重要。
3. 将1 ml 70％（v / v）乙醇添加到装有冷冻研磨种子的试管中，并通过涡旋使组织完全悬浮。如果使用研钵和研钵进行研磨，请在试管中加入3至5个2毫米氧化锆珠，以帮助重悬组织。
4. 在65°C（使用Reacti-Vap中的加热块）孵育10分钟。
5. 将样品在连接到涡旋混合器的盒子中涡旋振荡（如步骤B2d中所述）10-15分钟，以溶解代谢糖。
6. 以16,000 x g 的速度离心15 s。不要再旋转太久，否则沉淀将很难重悬。
7. 除去上清液，并用超纯水中的1 ml新鲜的70％（v / v）EtOH代替。
8. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。
9. 除去上清液，并用超纯水中的1 ml 80％（v / v）HPLC级MeOH代替。
10. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。
11. 除去上清液，并替换为1 ml 100％HPLC级MeOH。
12. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。
13. 除去上清液，并用1 ml新鲜的100％HPLC级MeOH代替。
14. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。
15. 除去上清液，并用1 ml 100％HPLC级丙酮代替。
16. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。
17. 除去上清液，并用1 ml新鲜的100％HPLC级丙酮代替。
18. 如上所述，涡旋10-15分钟，然后再次离心。除去大部分丙酮，剩下少量丙酮，可通过短暂涡旋将其重悬。
19. 使用微量移液器，将重悬的沉淀物（在丙酮中）转移到干净的2 ml管中，将沉淀物留在后面。
20. 使管道在通风橱中敞开，以干燥空气。丙酮将迅速蒸发，留下浅褐色的AIR沉淀。
21. 称量产生的AIR（应该超过3 mg AIR）并记录准确的重量，然后将AIR转移到KIMAX管中。
22. 向每个试管中加入20-30个1毫米氧化锆珠，盖上试管，并短暂涡旋以将沉淀破碎成粉末。珠子还将有助于在硫酸中混合样品。
23. 向每个样品中加入500μl100％HPLC级丙酮和20μl5 mg / ml meso -赤藓糖醇，并在N 2 气流下于60°C干燥C使用Reacti-Vap。丙酮有助于蒸发水，与仅蒸发20μl水相比，残留的团块少。
24. 准备标准（有关重要的技术注意事项，请参见注释）。必须准备，处理新标准并与每组样品一起运行。
  1. 将100 mM单糖原液稀释至2 mM，然后进行系列稀释以提供1 mM，0.5 mM，0.25 mM，0.125 mM，0.0625 mM溶液，以提供总共6种糖标准液（请参见食谱）。
  2. 将每种糖标准品0.5 ml转移到KIMAX管中。
  3. 向每管中加入5μl5 mg / ml的 meso -赤藓糖醇。
  4. 使用Reacti-Vap，使用Reacti-Vap在60°C的N 2 气流下干燥标样。
25. 干燥后，如果需要，可以将装有标准品和样品的试管加盖并保存在-20°C下。
26. 在通风橱中，戴上安全眼镜，向每个样品中添加70μl的72％硫酸，向每个标准物中添加17.4μl的72％硫酸，并盖上试管。
27. 将样品和标准品在冰上孵育2小时，每30分钟通过涡旋5-10秒进行混合。
28. 在通风橱中，向样品中添加1.93 ml超纯水，向标准物中添加482.6μl，使最终浓度为4％的硫酸。
29. 在121°C（15 psi / 1 Bar / 1 ATM）上拧紧瓶盖并高压灭菌1小时。
30. 从高压釜中取出，使其冷却。
31. 在通风橱中，将样品转移到干净的1.5 ml试管中，并以16,000 x g 的速度离心1分钟以沉淀碎片。
32. 使用1 ml注射器和0.45μm尼龙注射器过滤器将样品和标准品过滤到干净的1.5 ml管中。如果有“爆裂”声，请用Kimwipe包裹注射器和过滤器之间的连接点。
  注意：如果样品很难过滤，则过滤器被堵塞，应更换。
33. 将每个样品200μl装入带盖和隔垫的HPLC小瓶中。样品和标准品可保存在-20°C的HPLC小瓶或1.5 ml试管中，以防止微生物生长。
在25°C下使用CarboPac PA1 Guard和分析柱，采用高效阴离子交换色谱和脉冲安培检测（HPAEC-PAD）对单糖进行分离和定量
1. 分离酸性糖。
  1. 使用0.4 ml / min的恒定洗脱液流速。
  2. 用10％1M NaOH，1％1M乙酸钠和89％超纯水平衡色谱柱10分钟。
  3. 每个样品和标准液分别进样10μl。
  4. 使用30分钟的线性梯度分离酸性糖，达到40％的1 M乙酸钠，并保持1 M NaOH恒定（图2）。
  5. 用线性梯度1 M NaOH清洁色谱柱，该梯度在10分钟内达到30％，同时将1 M乙酸钠降至1％（图2）。
  6. 在注入下一个样品之前，将洗脱液以其起始浓度10分钟（10％1M NaOH，1％1M乙酸钠和89％超纯水）重新平衡10分钟（图2）。 br />
    
    图2.分离糖类的洗脱液梯度
2. 分离中性糖。
  1. 使用1 ml / min的恒定洗脱液流量。
  2. 用100％超纯水平衡色谱柱10分钟，然后启动柱后泵，该泵向检测器提供200 mM NaOH，用于柱中分离单体中性糖。
  3. 每种样品注入10μl。
  4. 用柱后检测用100％超纯水洗脱中性糖35分钟。
  5. 用20％1 M NaOH清洁色谱柱10分钟。
  6. 下次进样前，用100％超纯水冲洗10分钟以重新平衡色谱柱。
3. 从Chromeleon进行峰集成和数据导出。
  1. 查看Chromeleon中生成的文件（请参见图3和4中的示例）。
  2. 手动积分色谱仪，将样品中峰的极限保持在与标准品中峰极限相似的保留时间。 meso -赤藓糖醇内标的基线和目标峰（GalA）应该具有平坦的基线；使用Chromeleon工具功能区中的垂直/水平工具调整基线。将更改保存到峰积分。
  3. 将曲线下面积的值从Chromeleon软件的“集成”选项卡导出到Excel。
  4. 在进行进一步分析之前，请确保标准物对任何给定的单糖均显示线性响应，即 ie ，1 mM标准物的峰面积应恰好是2 mM标准物的一半，依此类推。可以通过在Excel中绘制峰面积与标准品浓度的关系并进行线性回归来测试。截距应接近0，R 2 接近1，以确保准确定量。
    
    图3.用CarboPac PA1分析柱分离中性糖（Ara，Rha，Gal，Glu，Xyl，Man）。在该样品中未检测到Fuc，但保留时间约为5.5分钟。。
    
    图4.用CarboPac PA1分析柱分离糖（GalA）

数据分析

如果尚未在工作站 eg 上安装Python和SciPy，请如下安装：
1. 安装Python 2.7.16（ https://www.python.org/downloads/release/ python-2716 / ），并记下安装Python的目录。
2. 打开命令提示符，然后键入“ cd”（不带引号）。
3. 打开文件资源管理器，然后导航到Python27文件夹。
4. 将Python27文件夹拖放到命令提示符中，然后按Enter。命令提示符应如图5所示。
  
  图5.设置Python27后的命令提示符
5. 转到scipy.org/install.html，然后复制以深灰色突出显示的代码，如图6所示：
  
  图6.安装SciPy的代码
6. 将代码粘贴到命令提示符中，然后按Enter。
7. 将安装SciPy软件包。
自定义作为该协议一部分提供的MonosaccharideComposition.py Python代码。由于最终样品量不同，因此必须在粘液和AIR数据处理之间更改代码。
1. 使用Notepad ++打开“ MonosaccharideComposition.py” Python文件（请参阅补充1 ）。
2. 编辑最终样品量。胶浆样品的最终体积为0.5 ml，AIR样品样品的最终体积为2 ml。要调整样品制备过程中使用的不同最终体积，请更改代码的第162行：“ finalCor = finalCorrections（已校准，校正， 6 ， 0.5 ）”，其中最后一个数字（此处以红色和粗体显示）表示以ml为单位的体积。
3. 编辑使用的标准数量。转到第161和162行，找到如下代码：“ calibrated = Calibration（校正， 6 ）”和“ finalCor = finalCorrections（校正，校正， 6 ， 0.5 ）”。如果不同，将代码中的数字6（红色）替换为使用的标准数量。
4. 保存自定义的Python文件。
准备HPAEC数据以进行分析
1. 将从Chromeleon获得的积分峰面积粘贴到模板Excel电子表格中。由于最终样品量不同，因此需要准备用于黏液和整个种子AIR样品的单独电子表格。
  1. 酸性和中性单糖分别进行分析，因此需要作为单独的文件进行处理。模板Excel电子表格具有用于输入酸和中性糖数据的单独工作表（请参见补充2 ）。
  2. 确保使用单糖缩写：Ara代表阿拉伯糖，Xyl代表木糖，Fuc代表岩藻糖，Rha代表鼠李糖，GalA代表半乳糖醛酸，Gal代表半乳糖，Man代表甘露糖，Glc代表葡萄糖，因为它们将用于确定校正系数。用于水解。
  3. 输入用于提取粘液的种子或用于完整种子的AIR的质量（以毫克为单位）。
  4. 样品名称和标准名称中请勿包含空格。
  5. 在标准浓度后添加“ mM”。这是必需的，以便在处理过程中可以将标准品与样品区分开。
  6. 对于每个基因型，通过在基因型名称后添加“＃”和复制号来标记复制。必须将其包括在内，以便将重复项分组在一起。
2. 从Excel复制数据，将其粘贴到Notepad ++中，然后另存为.txt文件。确保.txt文件末尾的数据下方没有多余的行，否则它将无法正常运行。
运行保存在B中的自定义的Monosaccharide Composition.py Python代码
1. 将Monosaccharide Composition.py文件拖放到命令提示符中，然后按Enter。
2. 将打开一个弹出窗口：导航并选择积分峰面积的.txt文件。
3. 将打开一个弹出窗口：选择文件名和已处理数据的位置，然后按Enter。处理后的数据将被保存。
4. 使用Excel打开已处理的制表符分隔的数据文件。可以将每个样品和糖的数据剪切并粘贴到Excel中进行处理。计算每种基因型的每种糖的平均nmol / mg和标准偏差，并绘制图表。

笔记

拟南芥更喜欢浅豌豆土壤，以前我们使用了1：1：1的泥炭：珍珠岩：with石并用AT培养基施肥，但发现已制备出富含泥炭的培养基，例如5号阳光混合物（Sungro ）效果很好，更方便。由于5号阳光混合料不含肥料，因此，按照步骤A所述，在使用液态AT最低限度培养基（请参阅食谱）种植之前，我们应浇水一次。我们建议您按照通常的步骤种植植物。如步骤A中所述，直到最后的长角果变黄之前，对水生植物至关重要。在不同时间种植几套独立的种子，包括野生型种子，以捕获由生长条件的细微差异引起的任何变异，这一点也很重要。我们建议按照步骤A中所述，使种子独立生长3个副本，并分别对每个种子进行单糖分析。请注意，在一个HPAEC实验中（如步骤B所述），制备的4个重复样品是生物学的，而不是技术重复样品。在我们手中，一起准备和分析的同一批种子的复制品之间几乎没有差异。
通过将用于提取的20 mg种子分成4 x 5 mg等分试样（记录的精确重量），然后用0.35 ml水/碳酸钠和1.25μl5 mg / ml提取每5 mg等分试样，可以增加从种子中去除黏液的能力。 meso -赤藓醇。按照上述说明涡旋后，重新混合4等分试样，然后取1 ml，并继续进行标准操作。
正确清洁用于酸水解的KIMAX管对于防止污染很重要。用HPLC级甲醇洗涤试管以除去所有可溶的糖，然后在通风橱中干燥。样品处理后，首先准备碳酸氢钠（小苏打）在水中的溶液。戴着安全眼镜，实验服和耐化学腐蚀手套，用小苏打溶液填充装有碎屑和残留硫酸的KIMAX管。浸泡至少2小时，然后使用试管刷擦洗试管中的碎屑，并用自来水彻底清洗。最后，在空气干燥之前，请用洗碗机清洗或用超纯水彻底冲洗。
精心准备标准曲线以将峰面积转化为单糖量至关重要，这是准确添加 meso -赤藓糖醇内标的必要条件。使用分析天平（1毫升超纯水重1克）测试微量移液器的准确性。PAD检测器检测到的样品值必须在外标的校准范围内。如果样品的读数比最高浓度标准品（2 mM）高，请以较少的组织或较高的标准品浓度重复该步骤。
如果将不同浓度的碳酸钠用于粘胶挤出，则必须调整添加的72％硫酸的量，因为碳酸钠将与酸反应，从而降低浓度。碳酸钠与硫酸之间的反应如下：
H 2 SO 4 + Na 2 CO 3 →Na 2 SO 4 + CO 2 + H 2 O
1摩尔硫酸与1摩尔碳酸钠反应。如果使用20 mM碳酸钠，则1 ml粘液样品中将存在0.02 mmoles的碳酸钠，中和需要0.02 mmoles的硫酸。72％的硫酸的摩尔浓度为12 M（比重1.622 g / cm 3 ），因此中和需要1.67μl的72％硫酸。因此，所需的硫酸总量为1.67μl+ 17.4μl= 19.07μl。

菜谱

在极小的培养基中
我们使用在实验室中开发的AT最小培养基（Haughn and Somerville，1986），但是您可以选择使用 Arabidopsis 生长培养基。对于AT最低培养基，请先制备储备溶液并将其高压灭菌于1 L瓶中（请参见表1）。要准备培养基，请将正确数量的每种营养储备液添加到800 ml超纯水中（请参见表1）。将原浆加入水中以防止不溶性磷酸钙络合物沉淀。容积最大为1L。

表1. AT最低媒介

注意：我们用不含琼脂的AT最低培养基浇灌土壤混合物，但这可能不是必需的，具体取决于您选择的土壤混合物（请参阅注释）。用于浇水的最低限度培养基不需要高压灭菌，但应保存在黑暗中以防止藻类生长。
对于平板，用KOH将培养基的pH值调节至5.8，加入7 g / L琼脂并高压灭菌。高压灭菌后，培养基可以在室温下保存在瓶子中，平板在4°C下用保鲜膜包裹。
钌红溶液
0.1％（w / v）钌红的储备溶液
将50毫克钌红溶于50毫升超纯水中
在4°C下储存在50 ml锥形管中
0.01％（w / v）钌红的工作溶液
在50 ml锥形管中，将5 ml稀释到50 ml超纯水中，并储存在4°C
注意：这些解决方案很好，只要颜色不是紫色或棕色即可。一旦变色，应将其丢弃并准备新鲜的溶液。
碳酸钠溶液（20 mM）
1. 将212 mg无水碳酸钠溶于80 ml超纯水中
2. 使用容量瓶用超纯水补足100毫升
3. 室温保存
硫酸72％（w / w），比重1.634 g / cm 3
注意：穿着实验室工作服时，戴上口罩和防化学手套在通风橱中进行准备。
缓慢将665 ml浓硫酸（比重1.84 g / cm 3 ，96％溶液）添加到333 ml超纯水中，同时缓慢并连续搅拌
计算公式：
体积 1＆nbsp;×比重 1＆nbsp; ×％溶液 1 =体积 2＆nbsp; ×比重 2 ×％解决方案 2
单糖储备液，100 mM
1. 为了制备100 mM单糖原液，其中分别包含100 mM L-（-）-岩藻糖，L-（+）-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-（+）-甘露糖，D -（+）-木糖，D-（+）-半乳糖醛酸，称量下表2中每种糖的适当量
2. 溶于超纯水，并在容量瓶中加至5 ml
3. 以1毫升等分试样的形式保存在-20°C的无菌1.5毫升试管中
  
  表2.单糖原液的制备
单糖标准品的稀释系列
准备表3中所示的稀释系列。使用超纯水进行稀释。

表3.单糖标准品稀释系列的制备
meso -赤藓糖醇溶液，5 mg / ml
1. 要制备5 mg / ml的母液，称出50 mg的 meso -赤藓糖醇。溶于超纯水，并在容量瓶中加至10 ml
2. 转移到无菌的15 ml锥形管中
3. 储存在-20°C
1 M NaOH（HPAEC-PAD洗脱液）
1. 用50 ml塑料移液管称取120 g 50％（w / w）NaOH放入干净的烧杯中，然后转移到1.5 L容量瓶中
2. 使用超纯水，将烧杯冲洗至容量瓶中，直至达到刻度
3. 转移至带有磁力搅拌棒的真空瓶中，并通过真空脱气至少2 h
200 mM NaOH（HPAEC-PAD洗脱液）
1. 用50 ml塑料移液管称取32 g 50％（w / w）NaOH放入干净的烧杯中，并转移到2 L容量瓶中
2. 使用超纯水，将烧杯冲洗至容量瓶中，直至达到刻度
3. 转移至带有磁力搅拌棒的真空瓶中，并通过真空脱气至少2 h
1 M乙酸钠（HPAEC-PAD洗脱液）
1. 称出82.03 g无水乙酸钠
2. 溶于超纯水，并在容量瓶中补足至1 L
3. 转移至带有磁力搅拌棒的真空瓶中，并通过真空脱气至少2 h

致谢

该协议源自Dean et al。（2007）中的原始协议，并对Šola et al。（2019b）进行了少量修改。这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的GWH和SDM发现补助金的支持

利益争夺

作者没有金融或非金融竞争利益。

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