材料和试剂

消耗品
1. T175组织培养瓶（Fisher Scientific，目录号：07-000-384）
2. Basix 5 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：14-955-233）
3. Basix 10 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：14-955-234）
4. Basix 25 ml血清移液管（Fisher Scientific，目录号：14-955-235）
5. Basix 50 ml锥形管（Fisher Scientific，目录号：14-955-239）
6. 贝克曼250毫升离心瓶（Fisher Scientific，目录号：NC9304619）
7. 橡树岭管（VWR，目录号：76324-812）
8. 厚壁聚碳酸酯超速离心管（Fisher Scientific，目录号：NC9439275）
9. 18 Gauge Canula（Thomas Scientific，目录号：8957G34）
10. 10 ml注射器（Fisher Scientific，目录号14-841-54）
11. 1.5 ml锥形螺口管（美国科学公司，目录号1415-8700）
12. 24孔板（Fisher Scientific，目录号：07-000-030）
13. N-95口罩
实验模型：细胞系
1. HeLa细胞ATCC CCL-2
细菌菌株
1. 沙眼衣原体血清型L2 ATCC VR-902B
抗体
1. 沙眼衣原体 LPS抗体，小鼠单克隆Novus NBP1-28820
2. 兔抗小鼠IgG（H + L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 488 （Thermo Fisher，目录号：A-11059）
化学药品，多肽，重组蛋白和其他试剂
1. 泛影葡胺（Bracco公司，目录号：0270-0445-40）
2. 带有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Thermo Fisher，目录号：11875-093）
3. NaHCO 3 （碳酸氢钠）（Thermo Fisher，目录号：25080094）
4. 庆大霉素（Thermo Fisher，产品目录号：15710072）
5. 胰蛋白酶-EDTA 0.5％（Thermo Fisher，目录号：15400054）
6. 热灭活胎牛血清（VWR，目录号：89510-186）
7. 1x PBS，不含氯化钙和镁（Thermo Fisher，目录号：10010-049）
8. 1x HBSS，不含氯化钙和镁（Thermo Fisher，目录号：14170112）
9. 环己酰亚胺（MilliporeSigma，目录号：C4859-1ML）
10. KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：P285-500）
11. K 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：P288-500）
12. KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
13. NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-500）
14. L-谷氨酸（Fisher Scientific，目录号：A125-100）
15. DEAE Dextran（MP Biomedicals，目录号：ICN19513380）
16. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412-500）
17. 蔗糖
18. Na 2 HPO 4 （无水磷酸氢二钠）
19. NaH 2 PO 4 ·H 2 O（磷酸二氢钠一水合物）
20. 血琼脂平板
21. 酵母蛋白葡萄糖（YPD）琼脂平板
22. 10x K36（请参阅食谱）
23. 1个K36（请参阅食谱）
24. 蔗糖磷酸谷氨酸缓冲液（SPG）（请参阅食谱）
25. 30％胃泌素（请参阅食谱）
26. 54％胃泌素（请参阅食谱）
27. 44％Gastrografin（请参阅食谱）
28. 40％Gastrografin（请参阅食谱）
29. 10倍DEAE葡聚糖（请参阅食谱）
30. 1x DEAE葡聚糖（请参阅食谱）

设备

P200移液器
摇床
湿润的CO 2 细胞培养培养箱设置为37°C
落地式离心机Avanti JXN-30（贝克曼，目录号：B38624）
转子：JLA-16.250（贝克曼，目录号：363934）
转子：JLA-25.50（贝克曼，目录号：363058）
转子：JS-24.15（贝克曼，目录号：362396）
台式离心机Allegra X-14R（Beckman，目录号：A99465）
微量离心机Microfuge20R（Beckman，目录号：B31599）
Sonicator Q-sonica Q500（VWR，目录号：89207-036）
超声波探头CL-334（VWR，目录号：89207-036）
荧光显微镜
生物安全柜
-80°C冷冻室
大型细胞刮板（Fisher Scientific，目录号：08-100-241）

程序

注意：由于沙眼衣原体是BSL2病原体，因此所有步骤都必须在生物安全柜（BSC）中进行。开始纯化之前，请确保所有溶液均无菌。

接种和准备HeLa细胞
1. 接种8个T175烧瓶，使其具有可在1-2天内达到汇合的细胞浓度的早期传代HeLa细胞（＆lt; P10）。
  注意：我们已经在 Ct 的多个谱系（阴道，宫颈，结膜，包皮）的永生化原代上皮细胞中繁殖，但尚未对其进行大规模纯化这些细胞系主要是由于繁殖这些细胞所需的试剂成本过高。从理论上讲，纯化过程将与我们在该方案中描述的相同，唯一的变化是每种细胞类型的培养基。
2. 倒出8个T175融合HeLa细胞烧瓶的培养基。
3. 每个烧瓶用5 ml 1x磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞。确保使用5毫升血清移液器除去大部分洗液。
4. 向每个烧瓶中加入5 ml胰蛋白酶，轻轻涡旋以确保其覆盖了烧瓶的整个底部，然后在37°C下孵育细胞5-10分钟或直至细胞分离。
5. 向每个烧瓶中加入5 ml含10％FBS的RPMI 1640。将8个烧瓶中的细胞合并到1个烧瓶中。
6. 加入30 ml含10％FBS的RPMI 1640，准备20个新的T175烧瓶。
7. 向每个新烧瓶中加入4 ml稀释的细胞混合物（步骤A4）。播种足够的细胞以获得融合（1 x 10 7 /瓶）。
8. 将细胞在37°C下与5％CO 2 孵育24小时，直到HeLa单层铺满为止。
感染（20瓶批量）
1. 从-80°C冰箱中取出沙眼衣原体L2的等分试样，并在室温下解冻。使用感染复数（MOI）2.5（假设2 x 10 7 个细胞/瓶），在含10％FBS和10μg/ ml环己酰亚胺的5 ml RPMI 1640中制备沙眼衣原体接种物在汇合处。总共100毫升用于20个烧瓶。
  注意：对于具有裂解或毒性表型的突变体，将MOI降低至0.5。在RPMI 1640中包括用于选择突变体的任何相关抗生素。
2. 倒出每个烧瓶中的培养基。
3. 向每个烧瓶中加入5 ml步骤B1的接种物，并在37°C下缓慢摇动或摇动孵育30 min-1 h。
4. 向每个烧瓶中加入25 ml含10％FBS和10μg/ ml环己酰亚胺的RPMI1640。
  注意：环己酰亚胺可阻止宿主细胞合成以促进细菌复制
5. 在5％CO 2 下于37°C孵育36-48小时。
纯化
1. 倒出20个烧瓶中每一个的培养基。
2. 向20个烧瓶中的每一个中加入8 ml冰冷的1x K36（配方2）。
3. 使用大型细胞刮刀刮擦每个烧瓶。用1x K36细胞混合物冲洗每个烧瓶的背面，并将细胞悬液从10个烧瓶转移到冰上的250 ml离心瓶中。重复接下来的10个烧瓶，再加上另一个250 ml离心瓶。
  注意：应将来自10个烧瓶的细胞悬液分别添加到两个250 ml离心瓶中。将20瓶细胞悬液分成两个250 ml离心瓶将为混合提供足够的空间，并为所有向前进行的离心步骤提供平衡。整个纯化总共需要四个250 ml离心瓶。在步骤C6中将使用两个250 ml离心瓶，从步骤C7开始将使用两个。
4. 用5 ml K36冲洗T175烧瓶的背面，转移到另一个T175烧瓶中。继续漂洗并转移总共5个烧瓶。洗涤第五个烧瓶后，将细胞悬液加入冰上的250 ml离心瓶中。丢弃前5个T175烧瓶。其余烧瓶重复上述步骤。
5. 在60-100瓦下超声处理20 s，立即将离心瓶倒入冰中。每250 ml离心瓶重复超声处理两次，共进行超声处理
  注意：超声处理期间应戴N-95口罩，并应在BSC中进行超声处理。
6. 在4°C下以500 x g 离心10分钟。
7. 将每个上清液转移到冰上新的预冷250 ml离心瓶中。
8. 将每个沉淀重悬于100 ml冰冷的1x K36中。
9. 在60-100瓦下超声处理20 s，立即将离心瓶倒入冰中。每250 ml离心瓶总共重复超声处理两个周期。
10. 在4°C下以500 x g 的速度离心10分钟。
11. 将上清液加到步骤C7中预冷的250 ml离心瓶中。
12. 在4°C下以30,000 x g 离心20分钟。
13. 从每个250 ml离心瓶中取出上清液（有2个），并用30 ml 1x K36重悬每个沉淀。使用10毫升注射器上的18 ga套管分散。溶液应缓慢分散以防止起泡，应通过3-5次或直到溶液均匀。
14. 向厚壁聚碳酸酯超速离心管中加入8 ml的30％Gastrografin（配方4）。
  注意：泛影葡甲胺和泛影酸钠溶液可实现衣原体基本体的最佳密度梯度分离，且宿主碎片最少，细菌或毒性损失可忽略不计。由于碘含量高，它们通常在放射线照相中用作造影剂。
15. 将来自步骤C13的悬浮液轻轻地铺在Gastrografin上。用1x K36在试管顶部。
16. 在4°C下以40,000 x g 离心30分钟。
17. 倒出上清液并将沉淀物重悬于1x K36中，每个T175烧瓶使用1 ml（对于准备20瓶的样品，每沉淀物10 ml）。注意：要制备30％的种子原液而不是进行完全纯化，请将沉淀重新悬浮在SPG中（方案3）。转移到橡树脊管中，在4°C下以30,000 x g 离心20分钟。将沉淀物重悬于5 ml冰冷SPG中，等分并保存在-80°C。
18. 通过将以下物质非常缓慢地分层以制备Gastrografin密度梯度，以便将其放入厚壁的聚碳酸酯超速离心管中：8 ml 54％，12 ml 44％和5 ml 40％Gastrografin。
19. 轻轻地将步骤C17中的悬浮液添加到梯度中，并在顶部添加K36。
20. 在4°C下以40,000 x g 离心60分钟。
21. 使用套管收集两个较低层（54％和44％）之间的白色基本人体带，并将其转移到冰上预冷的橡树脊管中（图2A）。
22. 加入约10体积的冰冷SPG。
23. 在4°C下以30,000 x g 离心20分钟。将沉淀重悬于1毫升/瓶SPG中。必要时使用套管分散。用P200移液器将50-100μl分装到无菌O形圈中，并储存在-80°C下。
24. 通过将血琼脂板，酵母蛋白s葡萄糖（YPD）琼脂板和RPMI 1640培养基接种10μl纯化的EB来测试无菌性。
滴定度
1. 接种HeLa细胞用于滴定板
  1. 倒出汇合的HeLa细胞的T175烧瓶中的培养基。
  2. 每个烧瓶使用5 ml 1x PBS轻轻洗涤细胞。确保使用血清移液器除去大部分洗液。
  3. 向每个烧瓶中加入5 ml胰蛋白酶，轻轻摇动使其沿烧瓶背面分布，并在37°C下孵育细胞5-10分钟或直至细胞分离。
  4. 向烧瓶中加入5 ml含10％FBS的RPMI 1640。
  5. 将1 ml细胞添加到20 ml含10％FBS的RPMI 1640中。
  6. 将1 ml稀释的细胞混合物添加到24孔板的每个孔中。细胞应接种以获得每孔1 x 10 5 。
  7. 将细胞在37°C和5％CO 2 中孵育24小时。细胞应汇合。
2. 感染细胞
  1. 解冻一份纯化的EB。
  2. 将30μlEB加到270μl1x Hanks缓冲盐溶液（HBSS）中。涡旋混合。
  3. 用1x HBSS连续稀释1:10。
  4. 使用血清移液器从24孔板上除去培养基。
  5. 将每份稀释液200μl一式三份加到24孔板的3孔中。
  6. 加入含10％FBS和10μg/ ml环己酰亚胺的1 ml RPMI 1640。在5％CO 2 于37°C下孵育约24小时。
  注意：对于使用该方案制备的野生型沙眼衣原体L2，我们获得的滴度约为109 / ml。因此，我们将10 4 ，10 5 和10 6 稀释液。根据纯化效率，可能需要降低或升高平板稀释液。
3. 确定滴度
  1. 使用血清移液器从24孔板上除去培养基。
  2. 用0.5 ml 1x PBS清洗每个孔两次。
  3. 向每个孔中加入0.5 ml甲醇，并在室温下孵育20分钟。
  4. 除去甲醇并将其丢弃在甲醇废液容器中。
  5. 用0.5 ml 1x PBS清洗每个孔两次。
  6. 加入0.25 ml在1x PBS中以1：1,000稀释的抗LPS。在室温下于70 rpm的振荡器上孵育〜1 h。
  7. 用0.5 ml 1x PBS清洗每孔三遍。
  8. 加入0.25 ml在1x PBS中以1：1000稀释的抗小鼠488。在室温下于70 rpm的振荡器上孵育〜1 h。
  9. 用0.5 ml 1x PBS清洗每孔三遍。
  10. 最终清洗后，在每孔中保留0.5 ml 1x PBS。
    注意：板可以在4°C下保存，直到计数完成。
  11. 使用荧光显微镜上的20倍物体在每个孔中计数10个视野（图2B）。
    
    图2. EB的密度梯度纯化。 A. Ct L2的梯度纯化。黑色箭头表示EB在54％和44％界面处的位置。B.衣原体滴度板的免疫荧光。 Ct 用抗LPS（绿色）染色，白色箭头表示衣原体包涵体的例子。比例尺为50 µm。

数据分析

使用以下公式确定滴度：

滴度=（X / 10）x 196 x 5 x D

在哪里，
X是所计数的10个字段中的夹杂物总数；
196是使用20倍物镜的24孔板的视野数量；
5是镀一毫升的分数；
D是计数的稀释因子；
示例：如果使用10 4 稀释的样品在10个视野中观察到232个夹杂物。效价为（232/10）x 196 x 5 x 10,000 = 2.27 x 10 8 。

笔记

该协议涉及L2 EB的纯化，但是来自其他 C的EB的纯化。使用该方案可以完成沙眼炎的血清型，对感染，收获和用DEAE-葡聚糖进行预处理的时间进行了一些细微修改（表1）（Sabet et al。，1984年））。通过在每个烧瓶中加入5 ml 1x DEAE-葡聚糖对细胞进行预处理，然后在37°C下孵育30分钟。去除右旋糖酐，准备感染细胞。
此程序的一个常见问题是在纯化过程中如何将EB与RB分离。超声处理足以溶解RB和宿主细胞，同时保持EB完整。然后通过梯度离心将所有碎片从相对密集的EB中分离出来。
衣原体的纯化必须在2级生物安全实验室中进行。

表1. 沙眼衣原体血清型的纯化指南

菜谱

10倍K36
1. 溶解68 g磷酸二氢钾（500 mM KH 2 PO 4 ），87.1 g磷酸氢二钾（500 mM K 2 HPO 4 ），溶于900 ml蒸馏水中的74.5 g氯化钾（1 M KCl），8.7 g氯化钠（150 mM NaCl）。用1 N KOH调节至pH 7.0
2. 使用刻度量筒将体积调节至1 L
3. 分装在100毫升无菌瓶中
4. 高压灭菌并在4°C下储存
1个K36
将100毫升10x K36加入900毫升无菌蒸馏水中，并保存在4°C下
蔗糖磷酸谷氨酸缓冲液（SPG）
1. 溶解3.75 g蔗糖（10 mM），2.47 g无水磷酸氢二钠（17.4 mM Na 2 HPO 4 ），0.36 g磷酸二氢钠一水合物（2.5 mM NaH 2 PO 4 ·H 2 O）和0.72克L-谷氨酸在900毫升蒸馏水中。根据需要用1 N HCl或1 N KOH调节pH到7.4。pH值应该已经非常接近7.4
2. 使用刻度量筒将体积调节至1 L
3. 过滤器灭菌并储存在4°C
30％胃泌素
30毫升Gastrografin
70毫升1x K36
54％胃泌素
54毫升Gastrografin
46毫升1x K36
44％胃泌素
Gastrografin 44毫升
66毫升1x K36
40％胃泌素
40毫升Gastrografin
60毫升1x K36
10倍DEAE葡聚糖
将450μg/ ml的DEAE-葡聚糖溶于100 ml蒸馏水中以制备10倍的储备液
1x DEAE葡聚糖
1. 将10毫升10x Hanks缓冲盐溶液（HBSS）和10毫升10x DEAE-葡聚糖加到80毫升蒸馏水中
2. 使用7.5％NaHCO 3 将pH调节至7.4
3. 过滤消毒液并在室温下保存

致谢

这项研究得到了爱荷华大学微生物与免疫学系向MMW的启动资金的支持。该协议改编自Caldwell et al。，1981年。

利益争夺

作者没有利益冲突要声明。

参考文献

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Caldwell，HD，Kromhout，J。和Schachter，J。（1981）。沙眼衣原体的主要外膜蛋白的纯化和部分表征。感染免疫 31（3）：1161-1176。
Hodinka，RL，Davis，CH，Choong，J.和Wyrick，PB（1988）。 McCoy细胞对沙眼衣原体内吞作用的超微结构研究。感染免疫 56（6）：1456-1463。
Majeed，M.和Kihlström，E.（1991）。在沙眼衣原体重新分布到沙眼衣原体期间动员F-肌动蛋白和网格蛋白感染免疫 59（12）：4465-4472。
Omsland，A.，Sager，J.，Nair，V.，Sturdevant，DE和Hackstadt，T.（2012）。沙眼衣原体在沙门氏菌中的发育阶段特定的代谢和转录活性 Proc Natl Acad Sci US A 109（48）：19781-19785。
斯基普（P斯基普），休斯（C.休斯），麦肯纳（T.McKenna），爱德华兹（R.Edwards），朗里奇（J.），汤姆森（Thomson），NR和克拉克（Clarke）（2016）。沙眼衣原体感染和复制形式的定量蛋白质组学。 PLoS One 11（2）：e0149011。
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