材料和试剂

盖玻片（18 x 18 mm，松浪玻璃工业公司，目录号：C218181）
玻璃皿（f 35 mm，AGC Techno Glass，货号：3970-035）
聚苯乙烯盘（f 35 mm，AGC Techno玻璃，目录号：1000-035）
聚苯乙烯盘（f 90 mm，Sansei Medical，目录号：01-013）
1.5 ml离心管（Greiner Bio-One，目录号：J618201）
50 ml离心管（Corning，目录号：430829）
摇晃（阪口）烧瓶（Sansyo，目录号：82-0317）
双面胶带（宽度15毫米，厚度0.086毫米，NICETACK，Nichiban）
Whatman TM 滤纸（GE Healthcare Life Sciences，目录号：3030-917）
牙签
A。密苏里州 431 T （NBRC 102363 T ）
酵母提取物（Becton，Dickinson and Company，目录号：212750）
肉提取物（京都，目录号：551-01240-8）
NZ-Amine ®（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：146-08675）
D（+）-麦芽糖一水合物（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：130-00615）
琼脂粉（Kokusan Chemical，目录号：2111136）
蛋白ept（Becton，Dickinson and Company，目录号：211677）
七水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Kokusan Chemical，目录号：2114992）
蔗糖（Kokusan Chemical，目录号：2111624）
工业级氨基酸（Becton，Dickinson and Company，目录号：223120）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Kokusan Chemical，目录号：2115140）
腐殖酸（东京化学工业，目录号：H0161）
氢氧化钠（Kokusan Chemical，目录号2112744）
氯化锌（ZnCl 2 ）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号263-00271）
六水合氯化铁（III）（FeCl 3 ·6H 2 O）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：091-00872）
二水合氯化铜（CuCl 2 ·2H 2 O）（Kokusan Chemical，目录号：2150417）
四水合氯化锰（MnCl 2 ·4H 2 O）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号139-00722）
四硼酸钠（Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O）（Kokusan Chemical，目录号：2114089 ）
钼酸铵（（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O）（国山化学，目录号：2152738）
氯化钠（NaCl）（Kokusan Chemical，目录号：2110733）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
碳酸氢铵（NH 4 HCO 3 ）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：017-02875）
YBNM琼脂培养基（请参阅食谱）
PYM汤（请参阅食谱）
HAT琼脂培养基（请参见食谱）
硝酸腐殖酸溶液（请参阅食谱）
痕量元素解决方案（请参见食谱）

设备

研钵和研杵
层流柜
烧瓶
离心机（久保田公司，型号：5200）
孵化器（PHC Holdings，型号：MIR-154）
微量移液器
相衬显微镜（奥林巴斯，型号：IX73）
物镜（奥林巴斯，型号：UPLFLN20×PH）
光学平台（JVI，型号：HAX-0605）
高速记录器系统（Digimo，型号：LRH1540），带有互补金属氧化物半导体（CMOS）摄像机

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

制备 A。密苏里州游动孢子
1. 接种 A。从YBNM琼脂培养基上的甘油储备液中提取出misouriensis 细胞，并将其在30°C的培养箱中培养2或3天（图1）。
  
  图1. YBNM琼脂平板（直径9厘米），在其上 A。missouriensis 菌丝体在30°C下生长4天
2. 用消毒的牙签切开琼脂培养基，制备琼脂片（约1平方厘米），其表面为A。Missouriensis 菌丝体已增殖（图2）。将琼脂片放入摇瓶中的PYM肉汤（100 ml）中以接种菌丝体，并培养 A。通过在30°C下以120 rpm的频率摇动2天，从而获得了密苏里州的密苏里州细胞（图3）。
  
  图2.准备用于接种 A的琼脂片。密苏里州
  
  图3. A的液体培养。密苏里州放在摇瓶中（在30°C下放置2天）
3. 通过在RT下以2,330 x g 离心10分钟收集细胞。
4. 将细胞悬浮在0.75％NaCl溶液（50毫升）中，在室温下以2,330 x g 的速度离心10分钟。
5. 将细胞重悬在0.75％NaCl溶液（10 ml；图4）中，并在一个HAT琼脂平板上接种一部分细胞悬浮液（0.1 ml）。
  
  图4. A。密苏里州菌丝体悬浮在0.75％NaCl溶液中
6. 铺展细胞悬浮液，并完全干燥HAT琼脂培养基的表面。
7. 将板在30°C下孵育至少7天（图5）。
  
  图5.上有 A的HAT琼脂平板（直径9厘米）。missouriensis 在30°C下生长7天。许多孢子囊在底质菌丝体上产生。
8. 将25 mM NH 4 HCO 3 溶液（10 ml）倒入HAT琼脂平板上（图6），并在30°C下孵育1 h。
  
  图6.倒入NH 4 HCO 3 在HAT琼脂上的溶液
9. 收集倒入的溶液，其中包含游泳游动孢子（大约10 4 -10 5 细胞/μl；图7）。保持溶液在室温下直至使用。
  
  图7. A。密苏里州含游动孢子的溶液
游动孢子附着力测试
1. 使用两片双面胶带将盖玻片附着到疏水性聚苯乙烯盘或亲水性玻璃盘上。通过将胶带布置成平行线并在盖玻片的两侧都开缝（图8）来制作隧道室。这种布置使得盖玻片和培养皿之间具有可再现的距离，从而确保了通道腔室的固定体积，并且还能够使用滤纸替换腔室内部的溶液。Kasai和Miyata（2013）已发布了使用类似隧道室的协议。
  
  图8.隧道室的图示
2. （可选；在疏水性聚苯乙烯皿的表面上进行BSA涂层）使用微量移液器，将1％BSA溶液倒入皿和盖玻片之间的空间中。保持室温1分钟。使用滤纸从腔室的一侧吸收1％BSA溶液。通过类似的程序，用25 mM NH 4 HCO 3 溶液清洗反应室。BSA涂层处理使碟子表面具有亲水性。通过处理，附着在碟子表面上的游动孢子的平均比例从41％（未经处理的碟子表面）下降到0.2％（BSA处理的碟子表面;木村等人，2019年））。
3. 用微量移液器小心地将含游动孢子的溶液（12 µl）放入培养皿和盖玻片之间的空间，而不会引入气泡。在室温下孵育室10分钟。
4. 使用配备有20倍物镜的相差显微镜记录粘附在培养皿表面的游动孢子和隧道中游动的游动孢子。实验室记录仪系统和CMOS相机可实现高速（每秒200帧）成像。沿垂直方向扫描显微区域，在3 s内对隧道室的分析区域进行扫描（总共600张图像）。
5. 使用微量移液器将25 mM NH 4 HCO 3 溶液（150μl）置于隧道的一侧，并使用另一端从另一侧吸收含游动孢子的溶液滤纸将溶液完全替换为25 mM NH 4 HCO 3 溶液，以除去不粘附在固体表面上的游动孢子。
6. 用显微镜拍摄粘附在培养皿表面的游动孢子。
数据分析
1. 将步骤B4中录制的电影文件转换为AVI文件。使用图像分析软件ImageJ无需压缩即可将步骤B6中记录的8位图像转换为TIF文件。
2. 使用步骤B4中记录的显微图像，通过ImageJ计算游泳游动孢子的总数以及附着在隧道室分析区域中的碟子表面的总数。用于ImageJ的Color_FootPrint宏（ http：// www .jaist.ac.jp / ms / labs / hiratsuka / images / 0/09 / Color_FootPrint.txt ）可以使游动的游动轨迹可视化（Hiratsuka et al。，2006年）。
  1. 使用命令“文件＆gt;打开电影文件”。打开”。选中“使用虚拟堆栈”和“转换为灰度”复选框。
  2. 使用命令“插件＆gt;启动Color_FootPrint宏”。宏＆gt; 彩色足迹彩虹”。该宏将游动孢子的游泳轨迹可视化（图9B）。
  3. 通过目视检查，计算在步骤B4中扫描的隧道室的分析区域中，碟形表面上的静止细胞的数量（图9A）和彩色轨迹的数量（代表游泳游动孢子的数量）。
    
    图9.通过ImageJ计算隧道室内游动孢子的数量。以600张扫描图像中的第一张图像为代表。B.输出图像；显示了彩色的轨迹。比例尺= 50μm。
3. 使用ImageJ在步骤B6中记录的显微图像，计算粘附在碟子表面上的游动孢子的数量。
  1. 使用命令“文件＆gt;打开图像”。打开”。
  2. 使用“矩形”工具选择在步骤B4中扫描的显微视野的分析区域，并使用命令“图像>剪切”修剪视野。作物”。
  3. 使用命令“ Image＆gt; 调整＆gt; 阈”。
  4. 使用命令“ Analyze＆gt; 分析粒子”。设置参数“大小”和“圆度”的适当值（图10）。
    
    图10.通过ImageJ计数培养皿表面上的游动孢子数量。 A.输入图像。比例尺= 20μm。B.输出图像。原始图像的一部分被放大显示。
4. 计算粘附率即，即粘附游动孢子与整个游动孢子的比例：C3 / C2。计算中应使用每单位面积的校正值。

笔记

在附着力测试中，游动孢子必须新鲜制备。收集后1小时内使用游动孢子。不应稀释收集的游动孢子，因为用缓冲液稀释可能会影响游动孢子的运动性。

菜谱

YBNM琼脂培养基
0.1％酵母提取物
0.2％肉提取物
0.2％NZ-胺®
1％D（+）-麦芽糖一水合物
将pH调整至7.0
在高压灭菌之前将琼脂添加至2％
PYM汤
0.5％蛋白ept
0.3％酵母提取物
0.1％MgSO 4 ·7H 2 O
将pH调整至7.0
高压灭菌肉汤
HAT琼脂培养基
0.1％蔗糖
0.01％酪蛋白氨基酸，工业
0.05％K 2 HPO 4
2％硝酸腐殖酸溶液
1％微量元素溶液
调节pH至7.5
在高压灭菌之前将琼脂添加至2％
腐殖酸溶液
1. 用研钵和研杵研磨10克硝酸腐植酸
2. 一点一点地添加100 ml的0.8％NaOH溶液并悬浮硝化腐殖酸粉末
3. 将悬浮液在105°C高压灭菌15分钟
4. 搅拌悬浮液直至冷却至室温
5. 再次将悬浮液在105°C高压灭菌15分钟
6. 搅拌悬浮液直至冷却至室温
7. 将悬浮液在4°C下以1,500 x g 离心10分钟
8. 将上清液转移到灭菌的玻璃瓶中并在4°C下保存
微量元素解决方案
0.004％ZnCl 2
0.02％FeCl 3 ·6H 2 O
0.001％CuCl 2 ·2H 2 O
0.001％MnCl 2 ·4H 2 O
0.001％Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O
0.001％（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O
高压灭菌解决方案

致谢

该协议改编自Kimura et al。（2019）。以上工作得到了No. 19H05685（至YO），18H02122（至YO），26252010（至YO）和17K07711（至TT），青年科学家资助计划。16H06230（至DN）和15K18669（至TT），以及JSPS研究研究员的No. 日本科学促进会（JSPS）和日本教育，文化，体育，科学与技术部（MEXT）的15J07768（致TK）。

利益争夺

作者声明与此手稿无关的利益冲突。

参考文献

Hayakawa，M.，Tamura，T.和Nonomura，H.（1991）。选择性隔离 Actinoplanes 和 Dactylosporangium J发酵生物工程 72（6）：426-432。
Y.平冢，M。宫田，Tada和T. Uyeda TQ。（2006）。由细菌提供动力的微旋转马达。美国国家自然科学中心（Proc Natl Acad Sci USA） 103（37）：13618-13623。
Kasai，T.和Miyata，M.（2013）。分析试剂对支原体滑动和粘附的抑制作用。 Bio-协议 3（14）：e829。
T.木村（T.Kimura），T. 密苏里放线猕猴中IV型游动孢子菌毛的特征。 J Bacteriol 201（14）：e00746-18。
总理莱彻（Lettercher）和新泽西州鲍威尔（2017）。 Ch虫（Chytridiomycota）中游动孢子超微结构特征的假想进化趋势。 Mycologia 106（3）：379-396。
Sharma，M.，Ghosh，R.，Tarafdar，A.和Telangre，R.（2015年）。一种有效的游动孢子生产，感染和实时定量< Phytophthora cajani 的定量方法在大气CO 2 升高下引起木豆疫霉病。 BMC植物生物学报 15：90.