材料和试剂

穿孔塑料瓶（330毫升，直径70毫米，高度107毫米；嘉丰园艺产品有限公司，重庆，中国）
锥形烧瓶
培养皿（直径90毫米，江苏盐城汇达医疗器械有限公司）
画笔（1厘米宽），用于收集新鲜的鸡蛋
0.22 µm注射器过滤器（美国颇尔公司）
刮铲（长20厘米，尖端宽4厘米）
PCR试管（Biosharp Life Sciences，合肥，中国）
1.5 ml微量离心管（Biosharp Life Sciences，合肥，中国）
孔径为60 µm的金属筛（瑞士Sigma-Aldrich Co. Ltd.，目录号：Z289744）
铝箔
封口膜（美国Bemis PM-996）
10 ml无菌注射器（Hamilton ®注射器，瑞士Sigma-Aldrich Co. Ltd.）
滤纸（90毫米直径，阜阳特种纸业有限公司，中国杭州）
甘蔗（Semcharum sinensis） Roxb。（中国福建省漳州市）
用于扩增细菌16S rRNA基因（27F：5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ' ，1492R：5 ' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ' ）（上海生物工程有限公司，上海，中国）
Trans2K ® DNA标记（Transgene BioTech。Co. Ltd.，中国北京）
蒸馏水
乙醇（Sigma-Aldrich，CAS号：64-17-5）
次氯酸钠（NaClO）（Sigma-Aldrich，CAS号：7681-52-9）
抗生素
1. 卡那霉素（Sigma-Aldrich，CAS号：70560-51-9）
2. 四环素（Sigma-Aldrich，CAS号：64-75-5）
3. 庆大霉素（Sigma-Aldrich，CAS号：1405-41-0）
4. 红霉素（Sigma-Aldrich，CAS号：114-07-8）
胰蛋白（（OXOID，目录号：2406419）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，CAS号：746398）
氯化钾（KCl）（CAS号：7447-40-7）
无水磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（CAS编号：7558-79-4）
盐酸（CAS号：7647-01-0）
磷酸一氢钾（KH 2 PO 4）（CAS号：7778-77-0）
酵母提取物（CAS号：8013-01-2）
琼脂（CAS号：9002-18-0）
氢氧化钠（CAS号：221465）
DNA提取试剂盒（DNeasy血液和组织试剂盒，德国恰根）
6x DNA上样缓冲液（TRANS ®，转基因生物技术有限公司，中国北京）
0.5x TAE缓冲液（Tris-Acetate EDTA）
2x Taq PCR Mastermix（天健生物技术有限公司，中国北京）
Tris-HCl（Solarbio生命科学有限公司，中国北京）
冰醋酸（CAS号：64-19-7）
抗坏血酸
蔗糖
酪蛋白
玉米粉
阿维切尔
胆固醇
氯化胆碱
肌醇
山梨酸钾
对羟基苯甲酸钠
EDTA二钠（CAS号：6381-92-6）
琼脂糖（转基因生物技术有限公司，中国北京）
TRANS ®溴化乙锭凝胶染料（Transgen。Biotech。Co. Ltd.，中国北京）
10x PBS储备溶液（请参阅食谱）
抗生素原液（请参阅食谱）
LB琼脂培养基（请参见食谱）
10倍的TAE储备溶液（请参阅食谱）
RPW幼虫的人工食品（请参见食谱）

设备

Heal Force safe-1200LC生物安全柜（Heal Force Bio-meditech Holdings Co. Ltd.，中国上海）
高压釜（中国深南LDZF-75KB-II）
SCIENTZ-48组织裂解仪（中国宁波宁波生物技术有限公司）
海尔冰箱（中国青岛海尔有限公司）
剪刀（世界精密仪器公司，美国萨拉索塔）
尖头镊子（3.9 x 3.0 x 1.0英寸，世界精密仪器公司，美国萨拉索塔）
带弯曲的圆形尖端的镊子（1.65毫米x 0.05毫米x 120毫米，宽度x厚度x长度，世界精密仪器公司，美国萨拉索塔）
使用Yiheng ®孵化器（500 x 460 x 800 mm，中国上海宜亨仪器有限公司）来饲养轴突幼虫（条件设置为37°C，黑暗24小时）
BIO-RAD T100 TM PCR热循环仪（美国Bio-Rad Co. Ltd.）
Eppendorf 5804 R离心机（德国Eppendorf有限公司）
凝胶电泳仪（六一仪器有限公司，中国北京）
Nikon ®体视显微镜（日本尼康有限公司）
赛富ZRX-260培养箱，用于维持RPW实验室人数（260升，中国宁波实验仪器有限公司）
Nanodrop 1000（Thermo SCIENTIFIC，美国）
微波（中国美的电器有限公司）
电磁搅拌器（江苏金坛市荣华实验仪器有限公司）
BSA124S电子天平（德国Sartorius Co. Ltd.）
紫外线透射仪（中国北青科技有限公司）
层流罩（Heal Force Safe-1200LC）

软件

IBM SPSS Statistics（22.0）

程序

昆虫的养护
1. 被困在福建省福州市平潭区（北纬119°32′，北纬25°31′）和福建农林大学金山校区（北纬119°30′）的成年人建立并维持了RPW实验室种群。，26°08′N）。在27±1°C，75±5％相对湿度和24 h暗光条件下，在孵化器（Saifu ZRX-260，Ninbo实验仪器有限公司，中国）中给RPW个体喂甘蔗茎。适用于成虫的幼虫和12小时亮/ 12小时黑暗（35毫米x 10毫米，长x宽，图1）。
  
  图1。红色棕榈象鼻虫（Rhynchophorus ferrugineus）的四个不同生命阶段
2. 将雌性和雄性RPW成虫放在带孔的塑料瓶中。为它们提供甘蔗茎切片（30毫米x 15毫米，长x宽）以供喂养和产卵。每三天更换一次食物。
3. 产下12小时后将新鲜的鸡蛋切成薄片，将甘蔗茎切片切成薄片，以进行去绒毛，产生RPW GF幼虫。
制备人造食品和抗生素原液
1. 制作RPW人造食品（请参见配方1）并准备抗生素储备溶液（请参见配方2）。
2. 针筒过滤器（0.22 µm）将抗生素储备液分装。
3. 在可高压灭菌的1 L锥形瓶中准备人造食品，并使用高压灭菌器在121°C下灭菌20分钟。
4. 当温度降至约55°C时，将抗生素混合物（600 mg / kg，每个150 mg / kg）和1 g抗坏血酸添加到高压灭菌的人造食品中。
5. 固化后，准备一批平行的不含抗生素的人工饮食，用等体积的无菌蒸馏水代替。
6. 固化后，在培养皿中准备好等分的人造食品，并用封口膜密封，以免RPW个人更换食物时潜在的微生物污染。
  注意：在生物安全柜中执行此步骤。
7. 饮食可以保存在4°C以便以后使用。
通过卵去绒毛作用产生RPW GF个体
1. 用75％的乙醇消毒所有工具，包括画笔，金属筛，刮铲（20 cm x 4 cm，长x宽），镊子和镊子。
2. 打开紫外线灯30分钟，以消毒层流罩的表面和内部的其他材料。
3. 将鸡蛋分为两组：a）未去皮蛋（对照组）和b）去皮蛋。每组使用30个鸡蛋。
4. 对于蛋的去绒毛，请按照Koyle et al。（2016）的以下步骤处理去蛋的蛋：
  1. 用10％的次氯酸钠溶液（NaClO）清洗刚产下的鸡蛋3-5分钟，然后通过金属筛过滤。
  2. 将这些鸡蛋用75％的乙醇冲洗两次，然后通过金属筛过滤。
  3. 将这些鸡蛋用无菌蒸馏水洗涤两次，以洗去漂白剂（NaClO）和乙醇，并通过金属筛过滤载有去壳蛋的水。对于对照组的鸡蛋，只能用高压灭菌的蒸馏水洗净，然后通过金属筛过滤载有鸡蛋的水。
5. 在立体显微镜下观察去壳蛋，我们发现去壳蛋与对照相比变成白色（图2）。
  
  图2.红色棕榈象鼻虫， Rhynchophorus ferrugineus 的未去壳和去壳蛋。（A）仅用高压灭菌蒸馏水洗涤未去壳的鸡蛋，（B）去皮蛋用10％次氯酸钠溶液（NaClO），75％乙醇和无菌蒸馏水洗涤。
6. 将经过去绒毛的鸡蛋转移到无菌的培养皿中（直径90毫米），并在层流罩（Heal Force Safe-1200LC）内用一些经过紫外线消毒的湿吸收棉。在黑暗中，蛋可以在27±1°C和75±5％相对湿度的条件下在层流罩内孵化。
7. 每隔24小时观察卵以进行孵化。两到三天后，它们会孵化。
8. 将新生幼虫转移到带有3 g固体人工饮食（步骤C6）（有或没有抗生素）的新无菌培养皿中。每两天刷新一次食物。
9. 将RPW幼虫维持在27±1°C，75±5％相对湿度和24 h黑暗光周期中。
10. 每三天更换一次人造食品。
11. 为了验证我们协议的效率，此处指定了四组：1）去壳蛋+含抗生素的食物，2）去壳蛋+不含抗生素（DNA）的食物，3）非去壳蛋+含有抗生素（NDA）的食物，以及4）非去皮蛋+不含抗生素的食物（常规饲养CR）。第1和第3组中的幼虫保留在层流罩中，而其他两个组（分别作为阳性和阴性对照）保留在培养箱中（Ninbo实验仪器）。
通过培养依赖性和非依赖性测定验证无菌RPW个体
肠解剖和均质化
1. 为了验证RPW的GF状态，从每个处理中随机选择三个幼虫（第5龄幼虫，图3）作为解剖的重复样本，每组至少折衷了三个重复样本。
2. 为了消除相关微生物对RPW幼虫体表的潜在影响，将标本浸入10％NaClO中30秒钟，浸入75％乙醇中90秒钟，并用无菌蒸馏水冲洗两次。此步骤在层流罩内部完成。
3. 在无菌显微镜下，在干净的培养皿中，用消毒的剪刀和镊子在立体显微镜下解剖肠壁。
4. 使用组织溶解器（48个组织溶解器，宁波信实生物技术有限公司，中国）在装有1 ml无菌PBS的1.5 ml微量离心管中匀浆收集的肠。
  
  图3.第五个RPW幼虫的肠道
通过培养依赖性分析验证无菌RPW个体
1. 用无菌PBS连续稀释（10 -1 -10 -4 倍）肠匀浆。
2. 一式三份，将100 µl稀释的匀浆物在LB琼脂平板上。
3. 在37°C下需氧培养板24小时，然后检查细菌生长。
4. 如预期的那样，在含有添加了抗生素的食物的去蛋壳蛋的肠匀浆中的板上没有细菌菌落出现（去蛋壳蛋+含有抗生素的食物，图4）。但是，细菌菌落在含有其他三组肠道匀浆的平板上长大（图4）。因此，有证据表明成功产生了RPW GF幼虫。
  
  图4.不同治疗组的RPW幼虫肠道中细菌生长的培养依赖性验证。在无菌（GF）组的幼虫肠道中未观察到细菌菌落：抗生素处理过的食物（去皮+含抗生素的食物）。但是，在其他三个治疗队列中发现了细菌菌落：DNA（去皮蛋+未添加抗生素的食物），NDA（未去皮蛋+已添加抗生素的食物）和常规饲养的CR（未去皮蛋+未添加抗生素的食物）。
通过与培养无关的测定法确认无菌RPW个体
1. 按照制造商的指导，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen），将步骤D4中裂解的肠道（肠道解剖和均质化）用于提取总肠道细菌DNA。
2. 在80 µl缓冲液AE中重复两次最终洗脱，以提高DNA产量。
3. 通过在1％溴化乙锭染色的凝胶上运行，并使用Nanodrop 1000（Thermo Scientific，美国），对提取的DNA的纯度和浓度进行定量。
4. 准备25 µl PCR反应系统：
  50 ng模板DNA
  1μl的每个前向（27F：5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ' ）和反向引物（1492R：5 ' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ' ）
  12.5 µl 2x Taq PCR Mastermix（天健生物技术有限公司，中国北京）
  最高25 µl，PCR级ddH 2 O
5. 通过添加1 µl PCR级ddH 2 O作为模板，设置PCR阴性对照，而其他试剂保持不变。
6. 在表1所示的热条件下运行PCR反应。
  
  表1.基于细菌16R rRNA的PCR测定的热条件
7. 在1％琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物。通过将1.0 g琼脂糖溶解在100 ml 0.5x TAE缓冲液中，并用微波将溶液完全溶解，来制备1％琼脂糖凝胶。
8. 小心地将凝胶溶液倒入琼脂糖凝胶铸盘中，以避免形成气泡，并使其聚合至少30分钟。
9. 将凝胶放入装有0.5x TAE缓冲液的电泳装置中。
10. 将4 µl PCR产物与1 µl上样缓冲液混合，并添加到凝胶孔中。
11. 加载5 µl 2,000 bp DNA标记，并在90 V下运行凝胶30分钟。
12. 在紫外光下可视化凝胶以检测预期大小为1,500 bp的目标条带。
13. 在RPW GF幼虫中未观察到目标PCR带，它出现在其他三个组中（图5）。此结果与文化相关方法的结果相符。
  
  图5.使用基于细菌16S rRNA的PCR测定法验证肠道细菌衍生的PCR产品。 GF（去壳蛋+含抗生素的食物），DNA（去壳蛋+不含抗生素的食物）NDA（非去皮蛋+含抗生素的食物）和常规饲养的CR（非去皮蛋+不含抗生素的食物）。
结论
在这里，我们开发了一个协议来生成RPW无菌幼虫，以进一步研究RPW幼虫与其相关的肠道细菌之间的相互作用。此方法需要严格的无菌条件，换句话说，本协议中的每个步骤都应在层流罩内完成。综上所述，按照我们在此报告的操作规程，RPW GF幼虫可以由去皮蛋产生，将其在无菌条件下饲养在无菌人工食品上。

数据分析

运行方差单向分析（ANOVA），以确定不同治疗组中细菌CFU的重要性。确定了不同队列中细菌菌落数量的显着差异。与CR昆虫相比，来自DNA和NDA组的RPW个体的肠道被细菌菌落的数量明显减少（图6）。

图6.不同处理组的RPW幼虫肠道中细菌菌落形成单位（CFU）的定量。在37°C孵育24小时后，计算每块板的CFU数量。运行单向方差分析（Tukey的HSD事后多重比较）以检测各处理过程中细菌CFU的统计差异。字母表示 P ＆lt; 0.05。GF（去皮蛋+含抗生素的食物），DNA（去皮蛋+不含抗生素的食物），NDA（非去皮蛋+含抗生素的食物）和常规饲养的CR（未去皮蛋+不含抗生素的食物）。

菜谱

RPW幼虫的人造食品（表2）

表2。用于RPW饲养的人工饮食组成
抗生素原液（表3）

表3.抗生素储备液和工作浓度的制备
10x PBS储液
1. 通过溶解80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na 2 HPO 4 和2.4 g KH 2 制备PBS储备溶液（10x）将PO 4 放入锥形瓶中的800毫升蒸馏水中
2. 在磁力搅拌器上充分混合，并用HCl将pH调节至7.4，最终体积为1 L
3. 在121°C下高压灭菌溶液20分钟，并在4°C下等分储存
LB琼脂培养基
1. 取5克胰蛋白,、 5克氯化钠，2.5克酵母提取物，7.5克琼脂，将其加入400毫升蒸馏水中。将其在1 L锥形瓶中充分混合。
2. 用NaOH将pH调节至7.0，最终体积为500 ml
3. 在121°C下高压灭菌介质20分钟
4. 让琼脂冷却至55°C，然后将（20 ml）琼脂倒入灭菌的培养皿中
5. 让其聚合约40分钟，然后用石蜡膜密封
6. 将LB琼脂板保存在4°C的冰箱中
10倍TAE储备液
1. 通过在800 ml蒸馏水中溶解48.4 g Tris，11.4 ml冰醋酸和3.7 g EDTA二钠来制备TAE储备溶液（10x）
2. 搅拌溶液直至完全溶解，并用蒸馏水制成最终体积1L。无需对溶液进行灭菌并将其保存在室温下

致谢

我们非常感谢中国国家自然科学基金（31470656），中国国家重点研究开发项目（2017YFC1200605）和福建省自然科学基金（2018J01705）的财政支持，该协议是根据我们以前的工作修改而来的（doi：10.3389 / fmicb.2019.01212）已发布在微生物学前沿中。

利益争夺

作者宣称他们没有任何竞争利益。

伦理

根据标准的伦理规范对 Rhynchophorus ferrugineus 个体进行治疗。

参考文献

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