p class = “pptt”> 材料和试剂

组织培养板（Sarstedt，目录号：83.3902）
细胞提升器（Fisher，目录号：8100240）
微型管（Axygen，目录号：MCT-150-C）
96孔透明多板PCR板（Bio-Rad，目录号：MLL9601）
Microseal'B'密封件密封件（Bio-Rad，目录号：MSB1001）
人类细胞系（ eg ，HaCaT永生化的人类角质形成细胞）
适当的组织培养基（例如，Eagle培养基的Dulbecco改良+ 10％胎牛血清）
抑肽酶（Fisher，目录号：61-637-010MG）
Leupeptin（Fisher，货号：50550413）
PMSF（RPI Corp.，目录号：P20270-5.0）
DNase I酶（Promega，目录号：M610A）
EDTA（Fisher，货号：BP120-500）
EGTA（Calbiochem，目录号：4100-50GM）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L5750-5KG）
氯化钠（Fisher，目录号：BP358-10）
RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R4875-100MG）
蛋白酶K（Fisher，目录号：BP1700-100）
无菌去离子H 2 O
氯仿（Fisher，目录号：C298-500）
EtOH（Pharmco-Aaper，目录号：111ACS200）
5x无色GoTaq反应缓冲液（Promega，目录号：M792A）
10 mM dNTP（Promega，货号：U151B）
GoTaq DNA聚合酶（Promega，目录号：M300B）
正向引物（请参阅过程）
反向引物（请参阅过程）
FAM标记的探针（请参阅过程）
KCl（Fisher，目录号：P217-500）
Na 2 HPO 4 （Fisher，目录号：S374-500）
KH 2 PO 4 （Fisher，目录号：P285-500）
NaOH（Fisher，目录号：BP359-500）
MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M0250-1KG）
CaCl 2 （Fisher，目录号：BP510-500）
蔗糖（Fisher，目录号：BP220-1）
海卫一X-100（Fisher，货号：BP151-100）
苯酚晶体（Fisher，目录号：A92-100）
8-羟基喹啉（Fisher，目录号：AC121900250）
Tris Base（Fisher，目录号：BP152-5）
1x PBS溶液，保存在4°C冰箱中（称为冰冷）（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
DNase缓冲液（请参见配方）
Tris-饱和苯酚（请参阅食谱）
TE缓冲液（请参阅食谱）

设备

移液器（VWR）
离心机（Eppendorf微型离心机，型号：5424，货号：022620401）
注意：对于需要转换以用于不同型号的离心机的人，下面列出的所有”rpm”还包括g的RCF。
等温水浴（Fisher，目录号：2223）
带水冷却器系统的Bioruptor 300 Plus超声处理设备（Diagenode，目录号：B01020001和B02010003）
CFX96实时PCR检测系统，包括C1000热循环仪机箱（Bio-Rad，目录号：185-5096）
高压灭菌器（Steris，型号：SG-120科学重力灭菌器）

软件

MS Excel for Mac 2011版本14.6.0
CFX Manager版本3.1（Bio-Rad，目录号：184-5000）

程序

基因组DNA收集
1. 将新鲜的蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液和DNase缓冲液中至终浓度：5 µg / ml抑肽酶，5 µg / ml亮肽素和1 mM PMSF。将缓冲液存放在冰上。
2. 从1 x 10 cm平板收集人细胞系（每个实验条件；〜5 x 10 6 细胞/平板）：
  1. 吸出细胞培养基。
  2. 用4 ml冰冷的1x PBS溶液洗涤细胞并吸出。重复一次。
  3. 加入500 µl冰冷的1x PBS到板中。
  4. 使用细胞提升器刮擦细胞，并将细胞悬浮液收集到微管中，并置于冰上。
3. 将细胞以10,000 rpm（〜9,400 xg）离心5 s沉淀，然后用移液管小心移出并丢弃1x PBS上清液。应在冷藏室中进行。
4. 将细胞沉淀重悬于300μl具有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，并在冰上孵育5分钟。此步骤将创建要在下面分析的染色质/ DNA。
5. 在4°C下以4,000 rpm（〜1,500 xg）离心裂解液5分钟。
6. 用移液管小心地除去并丢弃上清液，然后将DNA沉淀重悬于含蛋白酶抑制剂的300 µl DNase Buffer中。
7. 在4°C下以4,000 rpm（〜1,500 xg）离心裂解液5分钟。
8. 将DNA沉淀重悬于300μl含蛋白酶抑制剂的DNase缓冲液中。无需量化DNA。
9. 将100 µl裂解液等分到两个单独的微管中（一个用于”DNase I”，一个用于”No DNase I”）。请注意，此处正在评估每种条件下相等量的染色质/ DNA，并且在以下数据分析中将使用未切割的输入DNA（ ie ，无DNase I）的归一化方法。移液时要准确。DNA在这里不是粘性的，因为它们是染色质样品，DNA仍在核小体上，等等。裂解缓冲液不会（故意）破坏核结构，因此研究人员可以使用DNA酶I在步骤B中对染色质进行询问。协议。
DNase I反应和底物制备（根据实验条件）
1. 仅将3个单位（3 µl）DNase I酶添加到一个微管中（”DNase I”），通过轻拍进行混合，并将两个微管在室温下孵育7-8分钟。
  注意：孵育时间是通过反复试验（凭经验）使用不同的10 cm细胞平板测试DNAse I暴露的特定孵育持续时间来确定的。太短会限制核酸酶的效力，太长会导致针尖活性超出实验条件之间可检测差异的线性范围。对于不同的基因座，染色质会有很大的不同，并且DNase I在不同的位点具有不同的效力，这使得很难预先确定裸露的总输入DNA的优化步骤来进行染色质分析的DNase I持续时间。例如，对于Nepon-Sixt 等人（2019）中获得的结果（图8c和d中的图形），我们通过经验测试确定了DNase 7分钟我对染色质进行了可接受的部分消化，但未进行过充分消化，也未详尽无遗，可以在评估的实验条件下测量Lamin B2基因座的DNase I敏感性差异。您的经验测试将遵循相同的协议，对所研究的特定染色质位点进行DNase I持续时间的初步确定。
2. 向每个微管中加入4.25 µl 0.25 M EDTA pH 8.0和2.1 µl 100 mM EGTA（分别为10 mM和2 mM最终浓度），通过轻拍混合，并在65°C水浴中孵育10分钟以终止反应。。
3. 向每个试管中加入5.75 µl 10％SDS（终浓度0.5％），并混合。
4. 用Bioruptor 300轻声处理8分钟，打开30秒/关闭30秒。
5. 向每个微管中加入20 µl 2.5 M NaCl（〜500 mM最终浓度）。
6. 向每个微管中加入1 µl 10 mg / ml RNase A（终浓度50 µg / ml），通过移液混合，并在37°C水浴中孵育30分钟。
7. 向每个微管中加入3 µl 10 mg / ml蛋白酶K（终浓度250 µg / ml），通过移液混合，并在42°C水浴中孵育过夜。
8. 在离心机中快速旋转微管以去除盖子上的冷凝物。
9. 向每个试管中加入约350 µl无菌去离子H 2 O（dH 2 O），并用苯酚/氯仿提取纯化DNA：
  1. 向每个微管中加入250 µl Tris饱和苯酚和250 µl氯仿，倒置8-10次以充分混合。
  2. 以12,000 rpm（〜13,500 xg）离心管5分钟。
  3. 将水层（顶层）分别移至新的微管中。
  4. 在每个试管中加入500 µl氯仿。
  5. 以12,000 rpm（〜13,500 xg）离心管5分钟。
  6. 将水层（顶层）分别移至新的微管中。
  7. 向试管中加入100％的冰冷的冰，摇匀，并在-20°C下孵育1小时。
10. 在4°C下以12,000 rpm（〜13,500 x g ）离心管25分钟以沉淀DNA。
11. 通过将微管倒置在架子上并在室温下孵育10分钟，丢弃上清液和干燥的DNA沉淀。
12. 将每个DNA沉淀重悬于50 µl TE缓冲液中，制成DNA底物。同样，无需定量DNA，但必须注意移液的准确性。
DNA底物的qPCR分析
1. 创建用于qPCR分析的预混液，其中包含以下内容（每个实验条件足以进行四次重复的10 µl反应，每个反应分别带有”DNase I”和”No DNase I”）：
  1. 无菌去离子水 2 O：35 µl
  2. 5x无色GoTaq反应缓冲液：10 µl
  3. 10 mM dNTP：1 µl
  4. GoTaq聚合酶：1 µl
  5. 正向引物（10 µM）：1 µl（ eg ，用于Lamin B2 ori可及性分析的序列：5'-GCTACACTAGCCAGTGACCTT-3'）
  6. 反向引物（10 µM）：1 µl（ eg ，用于Lamin B2 ori可及性分析的序列：5'- GTTCTGCCTCTGAGTTTATTCCTG-3'）
  7. FAM标记的探针（10 µM）：0.5 µl（ eg ，用于Lamin B2 ori可及性分析的序列：5'-/ 56-FAM / -TTAGACATCCGCTTCATTAGGGCAGAGG- / 3BHQ_1 / -3'）
2. 等分试样49.5 µl母液分别混合到两个微管中。
3. 对于每种实验条件，将0.5 µl'DNase I'DNA底物添加到一个试管中，将0.5 µl'No DNase I'DNA底物添加到另一个试管中，并混合均匀。
4. 将每种反应混合物等分10 µl放入96孔多孔板的4孔中。
  注意：如果可能，请尽量避免使用96孔板边缘的外部孔。根据我们的经验，外部区域的使用可能导致结果的不可重现的可变性，这可能是由于温度问题造成的。
5. 用密封垫（Microseal'B'密封垫）覆盖96孔板，然后按以固定。
6. 将96孔板放入CFX96实时PCR检测系统中，然后运行以下程序：
  1. 95°C 10分钟
  2. 95°C持续15 s
  3. 60°C 1分钟
  4. 重复步骤b和c 40 x。
7. 使用CFX Manager分析qPCR结果，以使用FAM获得定量循环（Ct）值。

数据分析

对于每个实验条件下，根据下式分析结果：100/2 的Ct（DNA酶I）- 的Ct（无DNA酶I ），其中，所述数据归一化到输入DNA（' 无DNA酶I ' ）。对于研究者选择研究的每种实验条件，将分别执行此操作。然后将DNase I消化染色质中DNA的能力的变化绘制在图表上，以确定测试的实验条件是否使基因座对DNase I消化更敏感（因此被解释为染色质可及性更开放）。最终数据将如何显示在图表中的示例可以在Nepon-Sixt等人（2019）的图8c＆d中看到。参考图8c中的实验。以图1为例，接下来说明如何数学分析在测试条件下获得的数据，并以图形方式绘制最终结果。
＆nbsp; 例如，比较两个实验条件[ eg 和正常 Myc 表达（si-Control； eg ，荧光素酶对照， si-Luc），并带有 Myc si-RNA抑制功能；参见参考。1，图8c，左对条线]：如果对于“无DNase I”，对于Ct值为24，对于”DNase I”，其Ct值为26，则计算将为100/2 26-24 = 25 [注意，此处选择的整数与我们在参考文献8c中获得的数字不完全相同。1，但此处为了简化说明如何执行所需的数学运算而使用]。这意味着在一种实验条件下（ eg ，具有正常的 Myc ； si），使用经过DNase I处理的底物相对于没有DNase I的样品产生了25％的信号-Luc / Control）。如图8c的Y轴所示，这也称为”25％未处理的输入染色质/ DNA”。1.然后对其他实验条件（ eg ，带有 Myc si-RNA暴露和 Myc 表达缺失的样品）进行；参考文献1中的图8c中的si- Myc 。例如，如果后者针对“无DNase I”给出的Ct值为24，对于”DNase I”采样给出的Ct值为25，则计算将为100/2 25-24 =50。这意味着在这种实验条件下，使用带有DNase I处理的底物相对于没有DNase I的样品产生了50％的信号（例如， Myc ，si- 丢失Myc ）。可能是因为si-RNA丢失了 Myc 表达，使得测试的基因座对DNase I消化的敏感性降低（相对于si-Luc对照），因此从染色质的角度来看更加紧凑（添加的DNase I酶难以获得）。因此， Myc 表达的缺失导致基因座在其染色质状态下更加浓缩。在分析技术重复（从同一天开始分析单独的样品并接种细胞）后，将这些数据绘制在图表上。给出相同结果的生物复制品（从在不同日期收集的不同细胞平板分析的样品）将需要进一步提高解释的有效性。

笔记

如果研究者希望通过内部对照/比较将有关基因座的数据归一化，例如已知基因或启动子在测试条件之间没有染色质变化（需要在单独的测试中首先进行验证），那么就需要对该位置（内部控制/比较）和相关位置进行单独的分析。然后，将所讨论基因座结果之间的变化归一化为假定不变的对照/比较基因座中的任何变化。但是，重要的是要了解，当一个细胞使细胞处于各种条件（例如由于药物引起的全局效应或重要转录因子的siRNA丢失）时，许多基因座都会发生变化，因此使用生物学和技术复制品可能更好测试以取得统计上有效的解释。
此方法并非旨在比较两种不同细胞类型中的同一基因座，而是经过验证可用于比较暴露于不同实验条件的同一细胞类型中一个基因座发生的染色质变化（请参阅Nepon-Sixt et等 [2019]）。

菜谱

1x PBS溶液；放在4°C的冰箱中（称为冰冷）
制作10倍PBS溶液（如下所示），然后将1:10稀释至1倍
80 g NaCl（1.4 M）
2 g氯化钾（26.8 mM）
14.4 g Na 2 HPO 4 （101.4 mM）
2.4 g KH 2 PO 4 （17.6 mM）
将无菌的去离子H 2 O（dH 2 O，以下使用）加入800 ml
用10 N NaOH将pH调节至7.4
将dH 2 O加到1 L
高压灭菌并冷却至室温
裂解缓冲液
10 mM Tris pH 7.5
5毫米MgCl 2
1 mM CaCl 2
10 mM氯化钾
300 mM蔗糖
0.1％的Triton X-100
DNase缓冲液
10 mM Tris pH 7.5
5毫米MgCl 2
1 mM CaCl 2
10 mM氯化钾
300毫米蔗糖
Tris-饱和苯酚（如果需要，可以使用市售的Tris-Phenol，但我们的方法可让研究人员控制苯酚的含量和饱和度）
1. 在37°C水浴中用100 ml dH 2 O溶解100 g苯酚晶体
2. 加入0.1克8-羟基喹啉（0.1％w / vol）并摇动混合
3. 通过摇动以1：1体积的0.5 M Tris pH 8.0饱和等分试样，然后进行分离。丢弃Tris溶液作为苯酚废物（重复1次）
4. 摇动以1：1体积的0.2 M Tris pH 8.0饱和，然后分离。丢弃大多数Tris溶液作为苯酚废物，只留下一小层
TE Buffer pH 7.5
10 mM Tris pH 7.5
1 mM EDTA pH 8.0

致谢

该协议改编自Nepon-Sixt等人（2019）。Alexandrow实验室得到了NIH R01-CA130865和R21-CA155393的支持。

利益争夺

所有作者都承认，在撰写此手稿时，他们没有相互竞争的财务或非财务利益。

参考文献

Nepon-Sixt，BS，Bryant，VL和Alexandrow，MG（2019）。 Myc 驱动的染色质可访问性将Cdc45组装成CMG解旋酶。 a> Commun Biol 2：110。
Pemov，A.，Bavykin，S。和Hamlin，JL（1998）。核基质的附着介导了染色质结构的特定改变。 Proc Natl美国Acad Sci 95（25）：14757-14762。
Wong，PG，Glozak，MA，Cao，TV，Vaziri，C.，Seto，E。和Alexandrow，M。（2010）。 Cdt1展开的染色质通过HBO1和HDAC11-geminin的相反功能调节MCM的加载。细胞周期 9（21）：4351-4363。