材料和试剂

50 ml锥形管（例如，Falcon 50 ml锥形离心管，康宁公司，目录号：352070）
尼龙网（孔径为100μm）切成11 x 11 cm正方形
手术胶带
1.5 ml微量离心管（例如，1.5 ml采样管，圆底，FUKAE KASEI Co.，Ltd.，目录号：131-615C）
培养皿
纸巾
永久标记
A。拟南芥植物在22°C和10小时光照下生长4周
注意：我们建议将已知具有明显抗性和易感表型的基因型作为对照。在使用 C进行感染检测的情况下。 higginsianum MAFF 305635，Ws-2和Ler-0可以分别用作抗药性和易感表型的对照。
C。 Higginsianum 菌株
在陪替氏培养皿中制备的马铃薯葡萄糖琼脂（尼苏制药有限公司的马铃薯葡萄糖琼脂，目录号：05709）
消毒水

设备

带有橡胶密封盖的气密透明塑料容器
油漆刷（高压灭菌）（例如，尼龙平头水彩笔（棕发），Artec Co.，Ltd.，目录号：10629）
注意：可以使用任何画笔。我们对油漆刷进行高压灭菌，以消除先前实验中的任何污染物，然后将其重复使用。
漏斗（高压灭菌）
注意：出于相同的原因，我们对漏斗进行高压灭菌。
离心机（例如，高速冷冻微型离心机，TOMY SEIKO Co.，Ltd.，目录号：MX-307）
培养箱（黑暗条件下，24°C）（ e.g。，Cool培养箱，三菱电机公司，目录号：CN-25C）
带BLB灯的生长室（明/暗= 12 h / 12 h，24°C）（ eg ），生长柜，三洋电机株式会社，目录号：MLR-350和黑光蓝，日立有限公司，目录号：FL40SBLB）
血细胞计数器（例如，Reichert Bright-Line，Hausser Scientific Co.，目录号：1492）
光学显微镜（例如，双目显微镜，奥林巴斯公司，目录号：CX31）
可以测量5μl的移液器（例如，PIPETMAN Classic P20，Gilson Inc.，目录号：F123600）
喷雾瓶（500毫升）
数码相机（例如，EOS Kiss X6i，佳能公司，目录号：6557B001）
相机架（例如，复印架CS-A4，LPL Co.，Ltd.，目录号：L18142）
剪刀
钳子
白色塑料托盘
规模

软件

1. ImageJ v1.52p（Rasband，WS，ImageJ，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰，美国， https ：//imagej.nih.gov/ij/ ，1997-2018年）

程序

制备 A。拟南芥植物和 C。希金斯人文化
1. 在12个小时的黑光蓝色荧光灯/ 12小时的黑暗条件下于24°C在马铃薯葡萄糖琼脂上培养真菌菌株1周（图1A）。
2. 设置至少8个复制 A。在密封的透明塑料容器中用约1厘米的水（图1B）测试每种基因型的拟南芥植物。
  注意：此透明塑料容器的盖子上应有橡胶密封条，以在感染期间保持100％的湿度条件。
3. 使用永久性标记物标记每个植物的3个叶柄的完全展开的叶子（图1C）。
  注意：我们建议您在开始准备分生孢子悬浮液之前先完成上述所有步骤。
  
  图1. A的制备。拟南芥植物和 C。 higginsianum 文化。 A. 7天大的 C文化。马铃薯葡萄糖琼脂上的higginsianum MAFF 305635在24°C下在12小时黑光蓝色荧光灯光照/ 12小时黑暗条件下孵育。 B.带有 A的气密透明塑料容器。拟南芥植物。 C.使用永久标记标记的叶柄（白色箭头）。
接种 C。希金斯菊属
1. 将高压灭菌的过滤漏斗放在50 ml的锥形管中，并用一块手术胶带将折叠的尼龙网片固定在漏斗上（图2A）。
2. 在培养皿中的真菌培养物中加入10 ml室温无菌水，并用高压灭菌的涂刷轻轻刮擦表面以释放分生孢子（图2B）。
3. 将分生孢子悬浮液倒入漏斗中的尼龙网，将菌丝体和分生孢子分开（图2C）。
  注意：分生孢子应该穿过尼龙网，但菌丝体不能穿过。
4. 在室温下以4,500 x g 离心5分钟后，通过倾析除去上清液（图2D）。
5. 将分生孢子沉淀重悬于2 ml蒸馏水中。
6. 在Eppendorf ？微量离心管中准备1/100稀释的分生孢子在蒸馏水中的悬浮液，并使用血细胞计数器测定原始悬浮液的浓度（图2E）。
  注意：根据分生孢子浓度，您可以准备不同的稀释系列，以在血细胞计数器上获得〜100分生孢子/ mm2。
7. 在Eppendorf ？微量离心管中准备至少1 ml 5 x 10 5 分生孢子/ ml悬浮液。
8. 打开透明塑料容器的盖子，并用移液器在所选叶片的表面上每片叶片接种5μl分生孢子悬浮液（图2F）。
  注意：我们建议对病原体进行种植的植物进行接种，以最大程度减少运输过程中接种的分生孢子悬浮液从叶表面流失的风险。
9. 用喷雾瓶将自来水喷在透明塑料容器盖的背面。然后，密封容器的盖子并将容器小心地放入生长室中。
  注意：感染后5天才打开盖子，以在感染期间保持100％的湿度。
  
  图2.用 C接种。 higginsianum 。 A。设置分离菌丝体和分生孢子。 B.使用油漆刷刮擦真菌培养物以获得分生孢子悬浮液。 C.通过尼龙网过滤分生孢子悬浮液。 D.离心后的分生孢子沉淀。 E.血细胞计数仪上的分生孢子（黑色箭头）。棒＝100μm。 F.用移液管将分生孢子接种在叶片表面。
准备症状图像
1. 将数码相机设置在相机支架上，并设置放大倍率，光圈，快门速度和ISO。
  注意：调整相机和曝光设置以最大程度地减少图像中的阴影和反射。重复实验时，请确保使用相同的设置以提高可重复性。因此，我们还建议您在没有窗户的房间里拍照，以免受到阳光的影响。
2. 打开透明塑料容器的盖子。如有必要，请使用纸巾轻轻擦拭叶子表面的水滴，以免捕获水反射光。
3. 切下标记的叶柄，将叶子放在白色托盘上并拍照。
  注意：白色托盘为图像提供统一的白色背景。确保在接种叶片的图像中包括标尺。

数据分析

注意：有关使用ImageJ进行数据分析的信息，您还可以参考本文提供的视频教程（视频1和2）。

视频1.如何使用ImageJ分析感染叶片的图像

视频2.如何使用R在蜂巢箱图中可视化获得的数据

按照 https://imagej.nih.gov/ij/download上的说明，在您的环境中安装ImageJ。 html 。
注意：下面描述的过程已经在Windows10 1903版和macOS Mojave 10.14.5下进行了测试。
下载ImageJ宏 lesion.ijm和lesion_loop.ijm 并保存它们在同一目录中。
在ImageJ中打开受感染叶子的照片。文件＆gt;打开＆gt;选择您的照片或将图像文件拖放到ImageJ主菜单栏上。
打开ROI管理器。分析＆gt;工具＆gt;投资回报率经理。
使用矩形工具将每片叶子设置为照片上的关注区域（ROI），然后通过在ROI Manager中按“添加”来添加此ROI（图3A）。
注意：要将每个ROI添加到ROI Manager，您可以使用快捷键。（默认设置为[t]。）
将ROI以.zip文件格式保存在您的首选目录中。在ROI管理器中：更多＆gt;保存＆gt;选择目标目录。
注意：您可以通过将.zip文件拖放到ImageJ主菜单栏上来加载ROI。
打开“阈值颜色”菜单，然后将颜色空间设置为HSB。图像＆gt;调整＆gt;颜色阈值＆gt;选择颜色空间作为HSB。
通过更改HSB阈值找到阈值以定义照片中的病变（图3B）。确认适当的阈值后，单击“原始”，然后关闭“阈值颜色”菜单。
注意：在此步骤中，您可以参考已知具有抗性和易感表型的对照基因型图像来定义阈值。 Tsushima 等（2019）中使用的设置如下：色相，0-255；饱和度110-140；和亮度0-255。通常，我们仅从默认设置中调整饱和度值以定义病变区域。自定义适用于图像的设置后，请确保在重复分析时使用相同的设置。
在文本编辑器中打开lesion.ijm，根据步骤8中确定的设置编辑阈值并保存。在lesion.ijm中，min [0]和max [0]，min [1]和max [1]以及min [2]和max [2]分别指示色调，饱和度和亮度的最小和最大阈值（图3C）。
在ImageJ中安装lesion.ijm和lesion_loop.ijm。插件＆gt;宏＆gt;安装＆gt;选择lesion.ijm或lesion_loop.ijm
使用直线工具在照片的刻度上测量10毫米。然后，在对话框中设置比例。分析＆gt;设置比例尺＆gt;输入已知距离（10）和长度单位（mm）。
注意：如果您以相同的放大倍数拍摄照片，则可以在对话框中勾选“全局”，并将此比例尺应用于所有后续分析的图像。
打开“设置度量”对话框，然后勾选“面积”，“平均灰度值”和“限制阈值”。分析＆gt;设置度量＆gt;在对话框中打勾。
运行ImageJ宏。插件＆gt;宏＆gt;运行＆gt;选择lesion_loop.ijm。
注意：您可以为运行宏分配一个快捷键。插件＆gt;快捷方式＆gt;添加快捷方式。
将结果另存为逗号分隔（.csv）文件。在结果中：更多＆gt;保存＆gt;选择要保存结果的目录。
重复以打开下一张照片，设置ROI，运行lesion_loop.ijm并保存数据，直到处理完所有图像为止。
例如，使用R或Excel分析检测到的病变区域。下面描述了一个示例，该示例如何使用R在蜂巢箱图中可视化获取的数据。
注意：我们在中提供示例文件> sample_files.zip 来测试所有数据分析步骤。这包括 C的图像。被希金斯虫感染的 A。拟南芥叶子（Ler-0_ChWT.JPG和Ws-2_ChWT.JPG），ROI文件（Ler-0_ChWT.zip和Ws-2_ChWT.zip），从ImageJ获得的检测到的病变区域的原始数据（Ler -0_ChWT.csv和Ws-2_ChWT.csv），病变区域数据的格式重新设置为用作R分析的输入（Ws_Ler.csv），R代码以生成图3D中的蜂群图（beeswarm.Rmd），以及预期的输出运行R代码（Lesion_area.pdf）。
准备包含病变区域数据的.csv文件。
注意：请按照Ws_Ler.csv 中的格式设置文件
打开RStudio并通过键入install.packages（“ beeswarm”，依赖关系= TRUE）和install.packages（“ ggsci”，依赖关系= TRUE）来安装“ beeswarm”和“ ggsci”软件包。
注意：一旦安装了这两个软件包，则无需从下一次开始安装它们。
通过在控制台中键入setwd（“ PATH_TO_DIRECTORY”），将包含.csv文件的目录设置为工作目录。
在RStudio中，打开sample_files.zip中包含的beeswarm.Rmd。并在第21行中更改.csv文件名。然后，单击“运行当前块”。这将在您的工作目录中创建“ Lesion_area.pdf”文件。图3D使用本文提供的示例文件显示了预期的结果。

图3.使用ImageJ中的颜色阈值进行数据分析。 A.在照片上设置关注区域（ROI）。黄色矩形表示将使用颜色阈值测量的ROI。箭头指示矩形工具和直线工具。 B. ImageJ的“阈值颜色”菜单。 ROI中的红色部分将被检测为病变。 C. Lesion.ijm在文本编辑器中打开，指示分别指定色调，饱和度和亮度的最小和最大阈值的行。 D.使用本文提供的示例文件得到的预期结果。

致谢

该协议源自我们已发表的工作（Tsushima et al。，2019年）。这项工作得到了A.T的JSPS研究学者的部分资助。（17J02983）和KAKENHI（K.S.的17H06172和P.G.的19K15846）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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