材料和试剂

解剖孔（Winlab，目录号：190029500）
解剖钳（Fine Science Tools，Dumont，目录号：55）
载玻片和盖
胶带
黄色和白色移液器技巧
冰桶
果蝇初三龄幼虫（幼虫孵化后ALH 60小时）
BSA（牛血清白蛋白，Sigma-Aldrich，目录号：A3059）
针对纺锤体极点蛋白（例如抗γTubulin（小鼠单克隆抗γTubulin，Sigma-Aldrich，目录号：T5326））和抗磷酸化组蛋白3（PH3）的初级抗体，以确定中期核（兔多克隆抗PH3）（Ser10），Millipore，货号：06-570）
与Alexa Fluor 488（山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor Plus 488，Invitrogen，目录号：A32723）和555（山羊抗兔IgG，Alexa Fluor Plus 555，Invitrogen，目录号：A32732）偶联的二抗
Na 2 HPO 4
氯化钾
氯化钠
海卫一X-100（西格玛奥德里奇，目录号：T8787）
PFA 16％溶液（EM级，电子显微镜科学，目录号：15710）
与荧光团相连的鬼笔环肽（Alexa Fluor 633鬼笔环肽，Invitrogen，目录号：A22284），用于确定细胞和组织的形态
Vectashield安装介质（Linaris，目录号：H-1000）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱）
PBT（请参阅食谱）
封闭试剂（请参见配方）
PBT-0.1T中的4％多聚甲醛（PFA）（请参阅食谱）

设备

轨道振动器
共聚焦显微镜
高压灭菌器

软件

莱特·莱卡（Lite Leika）
图片J
Excel

程序

根据以下方案对幼虫脑进行染色
注意：所有清洗和孵育都是在定轨摇床上缓慢进行的。
1. 在冷PBS中，每个基因型大约解剖15个大脑。尽量不要延长解剖时间超过20分钟，以保持材料的质量。使材料已经在冰冷的PBS上解剖。
2. 通过在PBT-0.1T中的4％PFA中温和搅拌孵育20分钟来固定。
3. 更换溶液3次，用PBT冲洗，然后再轻轻搅拌3 x 15分钟，以洗涤。在这些洗涤过程中，清洁粘附在其上的其他组织的大脑。
4. 在室温（RT）下，将大脑在PBT + 0.1％BSA中孵育至少1小时。
5. 在适当的稀释度下，将脑与相应的一抗在封闭剂中于4°C孵育过夜。
6. 更换溶液3次，用PBT冲洗，然后每次清洗3 x 15分钟。
7. 在黑暗中与适度稀释的二抗在封闭剂中于室温孵育2小时。
8. 更换溶液3次，用PBT冲洗，然后每次清洗3 x 15分钟。
9. 在室温用PBS洗涤10分钟。
10. 除去PBS后，将Vectashield添加至孔中，并在4°C下放置过夜（此孵育有助于安装步骤）。
11. 使用图1所示的桥接方法将大脑固定在载玻片上，保留其三维结构。
  
  图1.安装桥的方法果蝇大脑
12. 粘贴两片胶带，在它们之间留出一个狭窄的空间（大约5毫米），如图1所示。
13. 用切好的黄色移液器吸头将大脑放入最小体积的Vectashield中。
14. 用切开的白色移液器吸头除去多余的Vectashield。
15. 安排大脑，使腹侧朝上。
16. 加盖玻璃并用2条胶带固定。
17. 用Vectashield填充桥下的空间。
影像采集
使用具有HCX Plan Apochromat 63x / 1.32-0.6 NA油共聚焦扫描物镜的Leica立式DMR显微镜记录荧光图像。使用每个z堆栈中焦平面之间的距离为0.8μm的2倍缩放。

数据分析

使用ImageJ打开Z堆栈（如图2所示）

图2. Z堆果蝇早期三龄幼虫脑半球。 PH3，γ-微管蛋白和鬼笔环肽染色分别以红色，绿色和蓝色显示。
注意：重要的是仅分析神经上皮细胞看起来与纵向神经上皮平面更垂直的部分。

主轴角度测量
1. 选择“角度”工具并绘制一条连接两个中心体的线，按鼠标按钮并相对于平行于神经上皮顶表面的第二条线绘制一个角度，如图3所示。然后按＆lt; m＆gt; ;将会出现一个带有测量结果的窗口。
  
  图3.有丝分裂纺锤体角的测量
  
  注意：这些测量通常需要在xy平面中进行校正，以使两个主轴都位于单个Z平面中。为避免过度校正，仅考虑在相同或两个连续Z平面中具有中心体的有丝分裂进行定量。
2. 收集所有测量值。
3. 将结果另存为excel文件。
4. 在Excel中打开文档。复制带有角度结果的列，并将其粘贴到新列中（图4中示例中的列A）。按顺序排列数据（示例中的B列），然后执行以下步骤。第1步：通过应用以下公式变换90度以上的值：y = 180-x（在示例中为C列），其中x是在测量中获得的值。第2步：将所有数据划分为类别（例如，每15度）。
  
  图4.用于对有丝分裂纺锤体定向进行数据分析的Excel工作表
  
  使用以这种方式排列的数据，执行不同的统计检验以查看两个总体相对于平面是否具有相同的有丝分裂角分布。建议您很好地理解并正确定义控件的行为，以及定义数据是否遵循参数分布。
  注意：相对于顶面的角度等于或小于30度被认为是野生型。
有丝分裂细胞定位的测量
1. 选择“直线”工具，并在每个有丝分裂细胞中绘制两条线：一条从心尖表面到中性板的中间（并按＆lt; m＆gt;），另一条从心尖的顶点到基端。上皮细胞位于有丝分裂细胞所在的位置（并按＆lt; m＆gt;）。这些行分别对应于图5中的“ a”和“ b”。
  
  图5.测量神经上皮内有丝分裂细胞的相对位置
2. 收集所有测量值。
3. 将结果另存为excel文件。
4. 在Excel中打开文档。
5. 计算每个细胞的有丝分裂板相对于上皮顶侧的相对位置（％，在图6的示例中为D列），方法如下：
  
  其中“ a”是从根尖表面到有丝分裂板的距离，“ b”是在该位置上皮的整个宽度（另请参见图5）。
6. 对所有数据进行排序，看看有丝分裂核如何沿NE的apico-基轴排列。
  
  图6.用于对有丝分裂相对细胞距离进行数据分析的Excel工作表
7. 以这种方式排列的数据表示有丝分裂细胞沿神经上皮的apico-基底轴的分布。然后，执行不同的统计检验以分析两个样本之间的可能差异。

测量了给定基因型的两个参数（有丝分裂纺锤体定向和有丝分裂细胞距离）后，就可以进行相关性以确定一个参数是否对另一个有影响。例如，在Franco和Carmena（2019）中，我们确定对照组中80％的细胞分裂为NE的最顶端部分（0-40％）。即使我们找不到定位失败与主轴定向之间的直接关系，我们也可以得出结论，基础有丝分裂更倾向于显示有丝分裂主轴对齐的缺陷。

菜谱

PBS
10 mM Na 2 HPO 4
2.68 mM氯化钾
140毫米氯化钠
pH 7.4
通过高压灭菌消毒
PBT
含0.3％Triton的PBS
封闭剂
含0.1％BSA的PBT
PBT-0.1T中的4％多聚甲醛（PFA）
用0.1333％Triton稀释PBS中的16％PFA

致谢

我们的实验室得到了经济与竞争力部（MINECO）的西班牙资助BFU2012-33020和BFU2015-64251，以及FEDER（欧洲区域发展基金）的支持。阿利坎特的神经科学研究所是“ Severo Ochoa”卓越中心。使用此协议的原始研究论文是Franco和Carmena，2019。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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Franco，M.和Carmena，A.（2019年）。 Eph信号控制神经上皮细胞中的有丝分裂纺锤体定向和细胞增殖。 J Cell Biol 218（4）：1200-1217。
Ichikawa，T.，Nakazato，K.，Keller，P.J.，Kajiura-Kobayashi，H.，Stelzer，E.H.，Mochizuki，A.和Nonaka，S.（2013）。全胃胚化过程中整个小鼠胚胎的实时成像：表皮和中胚层细胞的迁移分析。 PLoS One 8（7）：e64506。
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