材料和试剂

移液器吸头2-200μlEppendorf ？ epT.I.P.S. （埃彭多夫，货号：022492039）
移液器吸头50-1,000μlEppendorf ？ epT.I.P.S. （Eppendorf，目录号：022492055）
培养皿100 x 15毫米500 / cs（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
150 x 20 mm无菌培养管（Fisher Scientific，目录号：14-961-33）
Eppendorf ？安全锁定1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）冷冻（Simport，目录号：T310-2A）
接种环（Sigma-Aldrich，目录号：I0889）
Drigalski铲（3bscientific，型号：1010258）
B。枯草杆菌菌株
1. B。枯草杆菌菌株NCIB3610和JH642（芽孢杆菌遗传资源中心，目录号：3A1和1A96）
  NCIB3610菌株是一种野生型，未经内陷的参比菌株（源自Marburg菌株），擅长游泳，成群和滑行（Grau et al。，2015）。
  JH642是驯化的实验室菌株，衍生自菌株168，而该菌株又来自NCIB3610，后者仅精通游泳运动（Grau et al。，2015）。
2. B。枯草杆菌菌株RG4365（实验室储备，Grau等人，，2015）和同基因衍生物。
  RG4365菌株是源自纳豆菌株的未驯化野生型参考菌株，仅精通滑动运动（Grau et al。，2015）。
Luria Bertani（LB）肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
七水硫酸镁（MgSO 4 。7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
营养肉汤（Difco，目录号：BD234000）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
LB 1.5％（请参阅食谱1）
LB 0.3％琼脂（请参见食谱2）
LB 0.7％琼脂（请参见食谱3）
50％甘油（请参阅食谱4）
Difco孢子形成培养基（DSM）肉汤（请参见食谱5）

设备

锥形瓶（Fisher Scientific，目录号：FB5006000）
移液器（Gilson，目录号：F167300）
轨道振荡器（Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ SHKE4000）
冷藏培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Heratherm TM 通用协议微生物培养箱，目录号：51028064）
冷冻室（-20°C；低环境设备）（西门子，型号：So-Low Ultra C85-22）
高压灭菌器（Tuttnauer，型号：6690）
分光光度计（平行壁，型号：PWL3100）
立体显微镜（Carl Zeiss Stemi，型号：Semi 2000）
光纤光源（Carl Zeiss Stemi，型号：KL1500LCD）
数码相机（Canom，型号：PowerShot A80）。
本生灯（Humbolt，货号：H-5870）
涡流（Sigma-Aldrich，目录号：Z755621）

程序

枯草芽孢杆菌的高产孢子生产
1. 保持工作的焦虑状态，从相应的 B的甘油库存培养物中放一个循环（10μl）。在LB琼脂平板上接种枯草杆菌菌株，划线接种物，然后在37°C下温育。
  注意：接种在LB琼脂平板上的细菌可以在4℃下保存2到3周。但是，要长期保存，应在补充有25％甘油的培养物中冷冻保存。甘油的添加可稳定冷冻细菌，防止细胞膜受损并保持细胞存活。低温保存的芽孢杆菌可以在-80°C下稳定保存数年。为此，请生长 B。在37°C下于DSM肉汤中振荡（150 rpm）的枯草芽孢杆菌48小时，以获得高滴度的每毫升孢子。对生长的培养物在80°C的温度下进行15分钟的热震处理（热处理会杀死所有未形成孢子的营养细菌）。将此经过热处理的培养物与50％的甘油溶液等分混合（见4•配方），并轻轻混合。将试管在-80℃冷冻，直至使用。这样，低温（-80﹞C）和固有的孢子健壮性将使低温保存的菌株在很长一段时间内保持活力和活力，而不会因以后可能进行的后续冷冻和解冻循环而影响细菌存活。。要从甘油库存中回收细菌，请打开试管，并使用无菌环或移液器吸头从顶部刮下一些冷冻细菌。不需要使甘油细菌储备液完全融化。进行此过程时，请务必将甘油细菌储备放在冰上。使用孢子代替营养菌的最大优点是，除了随着时间的推移具有更大的稳定性外，所进行的热处理（80℃持续15分钟）可以消除可能的微生物污染物（不会孢子）可能在处理细菌培养过程中已经生长或引入。
2. 将2 ml无菌DSM肉汤放入无菌的150 x 20 mm管中。如上一步所示接种具有单个菌落的培养基。必要时，将相应的抗生素添加到培养基中。
3. 于37°C摇动（150 rpm）孵育48小时。
4. 要计算细菌的细胞产量（每毫升细胞数或菌落形成单位（CFU）），请对生长的培养物进行适当的系列稀释，然后将其铺在LB琼脂板上，并在37℃下孵育24小时，然后再进行CFU计数（请参阅过程B）。
5. 平行地，通过在LB 1.5％琼脂平板上铺一个环来检查生长的培养物的纯度，并在37°C下孵育24小时。
制备系列稀释液
1. 要开始此过程，请取出100μl细胞悬液，然后加入900μl去离子无菌水。摇晃或涡旋悬浮液，并标记为“ 10 -1 ﹑”。
  注意：此步骤可用于计算营养菌株和孢子。
2. 在样品沉淀之前，在移液器中用移液管吸取100升细胞悬液，并将其转移至900升去离子无菌水中。涡旋样品，并标记为“ 10 -2 ﹑。
3. 使用100μl先前的悬浮液和900μl去离子无菌水重复此稀释步骤。依次标记这些稀释试管，直到达到适当的稀释度（例如，试管“ 10 -7 ﹑”）。
4. 用Drigalski刮刀在LB琼脂平板中将100μl的10 -5 至10 -7 稀释液铺开，并在37℃下一式三份孵育24小时。
5. 每毫升CFU的数量可通过以下公式计算：
  
  哪里，
  计数的菌落数=是三个读板中存在的菌落数的平均值；
  转移到琼脂板上的体积：是以ml为单位的体积板（在这种情况下为0.1 ml）；
  稀释系数：等于最终体积除以等分试样体积。
B的制备。枯草培养用于传播实验
1. 在锥形瓶中加入100 ml非无菌LB肉汤。在121℃下高压灭菌20分钟。冷却烧瓶，并向培养基中接种8 x 10 5 C.F.U./ml的 B。按步骤A指示生长的枯草杆菌菌株。如果使用具有抗生素抗性的同基因突变体，则将相应的抗生素添加到培养基中。
  注意：在群体和滑动实验中，使用了NCIB3610菌株而不是JH642菌株，因为后者不产生生物表面活性剂表面活性素（Grau et al。，2015年），因此它无法聚集或滑动。
2. 摇动（175 rpm），在对数中期在37°C（O.D. 575 = 0.5）下孵育。 C.F.U.的数量每毫升，对于JH642菌株，在此生长期将在5 x 10 7 到7 x 10 7 左右。如果您使用其他细菌菌株，则必须事先制作标定（外径与C.F.U.）生长曲线以确定精确的外径。对应于所示的C.F.U.
铺板用于铺展实验
1. 要评估表面易位（变群，滑动）和/或游泳的类型，请准备分别添加0.7％或0.3％琼脂的LB（配方2和3）。
2. 在室温下将介质冷却至约50﹞C。
3. 将30 ml的培养基加入10厘米的陪替氏培养皿中（图1，A左部分）。
4. 使其在室温下而不是在冰箱中固化。
5. 在37℃的培养箱中干燥1小时（图1，A右部分）。
注意：
1. 进行铺展测定时，必须保持实验条件以保证实验的可重复性。介质的湿度是要控制的因素之一：很少的水将导致低运动性，而过多的湿度则会使游泳运动在不希望的条件下进行。为了控制水分含量，所有平板均在相对较低的温度（约50℃）下用琼脂培养基制备，并制成相同的厚度。这防止了由于在板盖中凝结而造成的水分流失。最后，在同一时间（〜1小时）内，在相同的干燥设备（即，37°C恒温箱）中，将铺展板一起干燥。该程序避免了例如两个板的湿度不同。琼脂的质量（即制造商即）会影响测试；我们建议在测试的复制或重复过程中不要改变琼脂的类型。
2. 始终使用不超过6小时准备的新鲜平板进行测定。不要存放准备好的盘子。
3. 如果添加了培养基，请检查它是否不会影响所需琼脂的浓度。如果是这种情况，请向未添加的培养基中以相同比例添加无菌水，或制备具有较高琼脂浓度的培养基以补偿这种稀释。
扩散分析

使用树莓程序，在培养皿的中心接种1升滴液，其中含有约6 x 10 7 细胞/ ml的C程序培养的培养物（图1B）。 > 注意：将液滴滴在琼脂上，以防止液滴飞溅或用尖端将琼脂打孔。可以使用其他工具进行接种，例如线接种针或无菌牙签，但是，不建议使用它们，因为接种量不精确且琼脂很容易损坏，这会影响该技术的可重复性。
等待几分钟以使液滴在琼脂中吸收，然后再孵育（图1C）。
注意：滴必须在孵育前完全吸收，以免洒在琼脂上。
在37°C下孵育48小时（图1D）。
注意：
1. 不要将陪替氏培养皿堆叠超过两个，以使所有培养皿中的温度传递都相同。
2. 可以根据所进行的实验和使用的细菌来修改测定的孵育温度。
图1.进行扩散分析的程序图。 A。用于铺展实验的板的制备和干燥方案。 B.产生细菌滴以接种散布板。 C.正确和不正确的方法将液滴沉积在铺板的培养基上。 D.如何孵育接种的铺板ON。
使用立体显微镜观察发达的游泳，蜂群和滑动细胞盘，并测量随时间变化的菌落直径（图2A）。应当从几个独立的俯视实验中拍摄有代表性的图片。
注意：因为生长通常不是圆形或均匀的，所以要测量不同的菌落直径。计算每次的平均直径（例如X 1 =（X 1A + X 1B ）/ 2）。＆nbsp;
绘制细菌传播直径随时间变化的图（图2B）。

图2.确定随时间变化的传播图。 A.从顶视图俯视细菌在测试板上传播的代表性图片。黄线表示菌落的直径。 B.的平均直径图（ eg ，X 1A + X 1B / 2 = X 1 ）殖民地与时间的关系。显示的值是三个独立时间的平均值（SD（一式四份）。
注意：菌株NCIB3610和RG4365的传播外观相似，这是NCIB3610的传播速度比RG4365的传播快（数据未显示）。 JH642菌株不会随时间在表面移动（例如，X 1 = X 2 = ..X i .. = X n ）。有关详细信息，请参阅Grau 等。（2015）。
当菌落的直径（d）大于在固体表面上不允许任何移动的培养基中形成的同一菌株的菌落的直径（d）至少大20％时，认为该细菌菌株是可移动的。 > eg ，LB 1.5 / 2.0％琼脂）（图3）。

图3.结果分析。 B的类型。结果获得的枯草芽孢杆菌动力。这些结果可以通过遗传分析加以验证，例如 hag 基因的基因失活（参与鞭毛合成），以确认或丢弃鞭毛介导的运动力或 eps 基因的失活（参与胞外多糖合成）以确认或放弃滑动运动。
注意：
1. 对于芽孢杆菌，到目前为止，已经报道了这三种类型的实用程序。
2. 变暖（鞭毛独立 hag EPS 独立）和滑动（鞭毛独立 EPS 依赖性）在发育过程中可能会在同一细菌菌落中发生。要知道这些细菌是否具有一种或两种类型的效用，可以进行以下类型的实验。如果您没有观察到游泳（鞭毛- hag 依赖性和 EPS 无关）类型的运动，但是确实在补充有0.7％琼脂的LB中发生，您正面临可能的滑动（鞭毛- hag 独立和 EPS -依赖）类型运动。如果您观察到补充了0.3％和0.7％琼脂浓度的LB中具有充分的运动性表型，则您的菌株可能具有一种（滑动）或两种类型的滑动性（滑动和群集）。为了区分群体运动和滑动型运动，必须进行突变，不允许合成鞭毛（ ie ，即 hag 基因），因为群体是鞭毛运动的依赖，而滑动不是。区分群体和滑动的另一种方法是滑动能力的基因失活（ ie ，涉及 EPS 对滑动至关重要，而又不会影响蜂拥而来的产品）。

数据分析

所有实验均使用随机设计进行。
显示的值是三个独立时间的平均值（SD（一式四份）。
使用学生的 t 检验，显着性水平为 P ＆lt;两组之间的比较为0.05。
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行校正，以进行多个比较。
使用单因素（ANOVA）检验零假设，即s.d的均值没有显着差异。七个菌株中的一个，然后进行Tukey的事后测试。
所有统计分析均使用GraphPad Prism版本5.0（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）进行。

菜谱

卢里亚·贝塔尼（LB）1.5％
1. 将20 g LB肉汤和15 g琼脂溶解到1 L dH 2 O中
2. 在121摄氏度，1个大气压下高压灭菌20分钟
3. 室温保存
卢里亚·贝塔尼（LB）0.3％
1. 将20 g LB肉汤和3 g琼脂溶于1 L dH 2 O
2. 在121摄氏度，1个大气压下高压灭菌20分钟
3. 室温保存
卢里亚·伯塔妮（LB）0.7％
1. 将20 g LB肉汤和7 g琼脂溶于1 L dH 2 O
2. 在121摄氏度，1个大气压下高压灭菌20分钟
3. 室温保存
50％甘油
1. 将25 ml的纯甘油（99.5％）溶于25 ml的dH 2 O
2. 在121摄氏度，1个大气压下高压灭菌20分钟
3. 室温保存
DSM汤
1. 将8 g营养肉汤，1 g KCl和0.25 g MgSO 4 七水合物溶解到1 L dH 2 O中
2. 在121摄氏度，1个大气压下高压灭菌20分钟
3. 室温保存

致谢

作者感谢阿根廷的CONICET和FONCyT，富布赖特（华盛顿特区）和皮尤（费城）基金会的支持和技术支持。 MB和RG分别是CONICET的博士后研究员和运营商研究人员。

利益争夺

作者没有利益冲突要报告。

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