表1.用于HIV-1 RT-LAMP分析的引物

材料和试剂

Axygen ® MicroVolume扩展长度过滤的移液器吸头（Axygen，目录号：TXLF10）
Axygen ® Universal Fit 100μl过滤的移液器吸头（Axygen，目录号：TF100RS）
Axygen ® Universal Fit 200μl过滤的移液器吸头（Axygen，目录号：TF200RS）
Axygen ® Universal Fit 1,000μl过滤的移液器吸头（Axygen，目录号：TF1000LRS）
Axygen 1.5 ml Snaplock微管（Axygen，目录号：MCT150CS）
Axygen 0.2 ml PCR ®管（Axygen，目录号：PCR02C）
LightCycler ® 480多孔板96，白色（罗氏，目录号：4729692001）
LightCycler ® 8管带，白色（罗氏，目录号：6612601001）
DreamTaq TM 绿色PCR预混液（2x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：k1081）
的pUC57-IN（含有HIV-1整合酶基因的部分片段：AF033819.3的序列是5'-ACGGTTAGGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGAATCAAGCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAAATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAGAACATGGAAAAGTTTAGTAAAACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTAGGGGATGGTTTTATAGACATCACTATGAAAGCCCTATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTG-3'）（由上海BioSune生物技术有限公司合成）
Qubit TM RNA HS检测试剂盒RNA（生命技术，目录号：Q32855）
WarmStart RTx逆转录酶（NEB，目录号：M0380L）
Q5 ®高保真DNA聚合酶（NEB，目录号：M0491L）
Bst 2.0 DNA聚合酶（NEB，目录号：M0537L）
快速诱变系统（转基因，目录号：FM111）
QIAgen病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen，目录号：52906）
QIAquick ®凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：GC-28706）
HiScribe T7高产率RNA合成试剂盒（NEB，目录号：E2040S）
WarmStart ®比色LAMP 2x预混液（DNA和RNA）（带有甲酚红）（NEB，目录号：M1800S）
等温扩增缓冲液（NEB，目录号：B0537S）
硫酸镁（MgSO 4 ）溶液（NEB，目录号：B1003S）
dNTP套件，100 mM解决方案（Thermo Fisher，目录号：R0186）
SYTO TM 9绿色荧光核酸染色剂（Invitrogen，目录号：S34854）
不含核酸酶的水（未经DEPC处理）（Ambion TM ，目录号：AM9938）
琼脂糖（Biowest，目录号：BY-R0100）
超纯水（Genview，目录号：GU3313-500）
GelRed核酸过滤染料（10000x）（TOROIVD，目录号：RSD100-25）
血浆样品（以前来自我们实验室的样品）
酵母提取物（类毒素，目录号：LP0021）
胰蛋白（（Oxoid，目录号：LP0042）
琼脂（上乡，目录号：120420）
氯化钠（沪市，目录号：10019318）
三水氨苄青霉素（Solarbio，目录号：A7490-5）
50x TAE缓冲液（Meilunbio，目录号：MA0004）
2000 DNA标记（Yeasen，目录号：10501ES60）
5000 DNA标记（Yeasen，目录号：10504ES60）
TIANprep迷你质粒试剂盒（Tiangn，目录号：DP103-03）
液体LB培养基（请参阅食谱）
100 mg / ml氨苄青霉素溶液（请参阅食谱）
耐氨苄青霉素的固体培养基（请参阅食谱）
耐氨苄青霉素的液体LB培养基（请参阅食谱）
2％琼脂糖凝胶（请参阅食谱）
1％琼脂糖凝胶（请参阅食谱）

设备

0.5-10μlEppendorf Research ®加上可调体积的移液器（Eppendorf，目录号：I32693E）
10-100μlEppendorf Research ®加上可调体积的移液器（Eppendorf，目录号：251596Z）
20-200μlEppendorf Research ®加上可调体积的移液器（Eppendorf，目录号：4830359）
100-1,000μlEppendorf Research ®加上可调体积的移液器（Eppendorf，目录号：4847859）
NanoDrop TM 2000分光光度计（Thermo Fisher，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000）
LightCycler ® 96系统（Roche，目录号：05819516001）
Bio-Rad CFX96 TM 实时PCR系统（Bio-Rad，目录号：785BR18555）
Eppendorf离心机5417R（Eppendorf，型号：5417R）
Eppendorf Mastercycler nexus（Eppendorf，目录号：6325ZK904949）
Tanon凝胶成像系统（Tanon，型号：2500）
Tanon EPS 300（Ta农，型号：300）
塔农电泳槽（Tanon，型号：400）

软件

LightCycler ® 96系统软件（Roche）
Bio-Rad CFX Manager 3.1软件（Bio-Rad）

程序

HIV-1野生型和突变RNA标准品的制备
1. 根据以下步骤，使用快速诱变系统构建两个突变型pUC57-IN质粒。用于构建突变质粒的引物在表2中。
  1. 制备PCR反应混合物（表3），PCR循环条件：酶激活和94°C下预变性3分钟，25个94°C下变性20 s变性，55°C下退火20 s并延伸在72°C下放置1分钟，然后在72°C下放置10分钟。
    
    表2。构建两个HIV-1突变质粒的引物
    
    注意：引入的突变体以红色字体显示。 F：正向引物； R：反向引物；穆：突变体。
    
    表3.两个HIV-1突变体的PCR反应混合物
    
    注：F：正向引物； R：反向引物；亩：突变体。
  2. 电泳检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳在恒定电压（140 V）下约30分钟，测量10μlPCR产物。
  3. PCR产物消化：向剩余的PCR产物中加入1μlDMT酶，混合并在37°C下孵育1 h。
  4. 将5μlDMT消化产物添加到50μl感受态细胞中，混合并置于冰上30分钟。然后将混合物在42°C下放置45 s，在冰上放置2分钟。
  5. 向混合物中加入250μl室温LB培养基（不含抗生素），以200 rpm，37°C的温度放置1 h。
  6. 将100μl细菌溶液均匀地铺在含有100μg/ ml氨苄青霉素的平板上，并在37°C的培养箱中孵育过夜。
  7. 将单克隆抗体放入含有100μg/ ml氨苄青霉素的3 ml LB培养基中，在37°C摇动培养（200 rpm）10-12 h。
  8. 提取质粒DNA用于Sanger测序（上海铂金公司），并验证突变的存在。将突变的质粒保存在-20°C以便进行后续实验。
2. 使用含有T7启动子的引物对（HIV T7-F：TAATACGACTCACTATAGACGGTTAGGGCCGCCTGT和HIV R：CAGTCGACGGGCCCGGGA）扩增HIV-1整合酶片段，并以野生型和突变型HIV-1质粒为模板。
  1. 在带盖的0.2 ml PCR ®管中，PCR反应混合物包括25μl2x DreamTaq TM Green PCR Master Mix，2μl的10μM每种引物（HIV T7 -F和HIV R引物）和2μlHIV-1质粒，最终体积为50μl。
  2. 循环条件是酶活化和在95°C下预变性3分钟，然后在95°C上变性40个循环30 s，在55°C下退火30 s，然后在72°C下延伸1分钟，在72°C下完全延伸10分钟。
3. 使用2％琼脂糖凝胶电泳在恒定电压（140 V）下约30分钟测量PCR产物。
4. 电泳后，在UV控制下从凝胶上切下特定的PCR产物，并使用QIAquick ®凝胶提取试剂盒按照制造商的说明进行纯化。
5. 使用HiScribe T7高产RNA合成试剂盒，以纯化的DNA为模板，通过体外转录获得RNA。
6. 使用NanoDrop TM 2000分光光度计对获得的RNA进行定量，并使用以下公式计算RNA的拷贝数：
  
  RNA拷贝数/毫升= [RNA浓度（g / ml）/（nt转录长度×340）]×6.022×10 ^ 23
7. 将RNA稀释至10 4 个/ ul，在带有盖的0.2 ml PCR ®管中等分至40μl，并保存在-80°C直至使用。
血浆样本病毒RNA提取
1. 按照制造商的说明，使用QIAgen Viral RNA Mini Kit从140μl血浆中提取病毒RNA。
2. 在50μl无核酸酶的水中洗脱提取的RNA，等分至每管25μl，并储存在-80°C直至使用。
通过实时错配HIV-1 RT-LAMP测定法对HIV-1进行定性检测
1. 混合引物组的制备（表4）
  通过将5μl100μm引物AceIN-F3，AceIN-B3a和AceIN-B3b分别添加到85μl无核酸酶的水中来制备混合引物组1。混合引物组2包括引物AceIN-FIPf和AceIN-FIPe各20μl100μm，40μl100μmAceIN-BIP和20μl无核酸酶的水。混合引物组3分别包含20μl100μm的AceIN-LF和AceIN-LB引物，以及60μl的无核酸酶的水。
2. 实时RT-LAMP混合物的制备（表5）
  在96孔PCR板或8管PCR试纸中，每个25μl反应混合物包括3μlRNA模板（RNA标准品或临床样品的RNA提取物），2.5μl10x等温扩增缓冲液，1μl100mM MgSO 4 ，3.5μl10 mM dNTP，0.075μl2个Q5高保真DNA聚合酶，1μl8个 Bst 2.0 DNA聚合酶，0.5μl15个热启动RTx逆转录酶， 1μl1 mM SYTO 9和1μl每个混合引物组（表4中的混合引物组1-3）。
  
  表4.耐错配RT-LAMP分析的混合引物组的制备
  
  注意：当不使用简并引物时，建议进行常规检测。
3. RT-LAMP循环条件：在62°C下进行60分钟循环反应1分钟。在每个周期收集荧光信号。
比色RT-LAMP检测（表5）
1. 比色RT-LAMP混合物的制备（表5）
  在8管PCR试纸中，每种25μl反应混合物均包括12.5μlwarmstart比色LAMP 2x主混合物，1μl每个混合引物组（表4中的混合引物组1-3），0.075μl2个单位的Q5高保真度DNA聚合酶和3μlRNA模板（RNA标准品或临床样品中的RNA提取物）。
2. 比色RT-LAMP循环条件：在62°C下反应50分钟。肉眼观察在20、30、40和50分钟时间点的颜色变化。

数据分析

实时不匹配RT-LAMP分析的结果可以通过LightCycler ® 96系统软件，Bio-Rad CFX manager 3.1软件（图1）或以其他实时方式实现的软件来查看PCR机器。阳性结果（存在HIV-1模板）显示清晰的“ S”型扩增曲线，阴性结果（无HIV-1模板）没有扩增曲线。 Ct值（扩增曲线出现的时间）与模板输入量负相关。

图1.实时错配的HIV-1 RT-LAMP的扩增曲线。使用LightCycler ® 96系统（A）或Bio-Rad CFX96 TM的扩增曲线实时PCR系统（B）。用作阳性对照的HIV-1 RNA标准用红色显示，来自HIV阳性受试者的临床样品用青色显示，来自HIV阴性受试者的样品或没有模板的样品用黑色显示。
在比色RT-LAMP检测测定中，可以用肉眼判断结果。从勃艮第到橙色或黄色的明显颜色变化被认为在30-50分钟时HIV-1阳性，这取决于设定的临界值（图2）。

表5.耐错配的RT-LAMP测定的实时和比色反应混合物

注：通过将2 U /μlQ5酶原液稀释10倍，可获得0.2 U /μlQ5高保真DNA聚合酶。

图2.比色RT-LAMP检测HIV-1。从勃艮第变为橙色或黄色的颜色被认为是阳性（+）。 NTC：无模板控件。突变的碱基标记为红色。 AceIN-F3是外部正向引物。

笔记

LAMP反应非常敏感。在操作过程中应注意避免污染，强烈建议对LAMP和其他扩增测定法进行严格的实验室分隔。
为避免潜在的污染，不建议对LAMP产品进行琼脂糖凝胶电泳。
由于每个反应中只使用少量的Q5高保真DNA聚合酶，因此可以将酶原液稀释至更低的浓度（例如，0.2 U /μl）以减少移液误差。
在反应中也可以使用其他高保真DNA聚合酶代替Q5酶。高保真DNA聚合酶的推荐最佳浓度为每25μlLAMP反应0.1至0.3个单位。
需要对每25μlLAMP反应的Q5高保真DNA聚合酶的确切数量进行优化，以检测每种特定病毒。
如果没有简并引物可供使用，则可以根据标准测定法制备引物混合物（表2）。
每个25μlLAMP反应的RNA模板量可以在实时版本的0-11.75μl和比色版本的0-8.75μl范围内进行调整（表3）。

菜谱

液体LB培养基
在1升超纯水中的10克胰蛋白,、 5克酵母提取物和10克氯化钠
混合并高压灭菌
100 mg / ml氨苄青霉素溶液
1克氨苄西林粉和5毫升超纯水
溶解后，加入超纯水至10毫升
将100 mg / ml氨苄青霉素溶液分配到1.5 ml EP管中，并储存在-20°C直至使用
耐氨苄青霉素固体培养基
在1升超纯水中的10克胰蛋白,、 5克酵母提取物，10克氯化钠和15克琼脂
混合并高压灭菌
加入1 ml 100 mg / ml氨苄西林溶液并混合
在每块板上倒约10毫升，固化后在4°C下储存
耐氨苄青霉素的液体LB培养基
在50 ml液体LB培养基中添加50μl100 mg / ml氨苄青霉素溶液并混合
2％琼脂糖凝胶
在100 ml 1x TAE和10μl10000x GelRed中加入2 g琼脂糖
1％琼脂糖凝胶
在100 ml 1x TAE和10μl10000x GelRed中加入1 g琼脂糖

致谢

该协议是根据我们先前发布的原始方法进行修改的（Zhou et al。，2019）。这项研究得到了中国国家自然科学基金（81672033和U1302224），中国国家科技重大专项（2017ZX10103009-002），中国科学院“一带一路”项目（153831KYSB20170043）的资助。科学，中国科学院上海巴斯德研究所的133个项目。资助者在研究设计，数据收集和分析，发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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