对于任何遗传标签，重要的是将标签插入氨基酸序列中不会干扰目标蛋白质的结合相互作用，定位，折叠或功能的位置。为所有可行的蛋白质靶标规定遗传标签的位置超出了本文的范围。我们建议阅读Erik Snapp的论文“细胞生物学中荧光融合蛋白的设计和使用”，以讨论选择标签插入位点的问题（Snapp，2005年）。对于VIP标签，我们为标签放置提供以下建议。

1）

对于任何新的融合蛋白，我们建议分析定位，运输和功能，以确保标记的蛋白保留与未标记的蛋白相同的行为。

2）

避免将VIP标签放置在关键位置。换句话说，标签不应放置在催化残基，结合界面或翻译后修饰（例如，糖基化，磷酸化，酶原裂解，等）的位点。。此外，对于分泌的蛋白质，应将标签放置在信号肽之后，以避免被切割。

3）

如果可以的话，仔细评估蛋白质晶体结构对于决定将标签放置在何处可能是无价的。

4）

我们建议在VIP标签和目标蛋白之间包含一个短连接子（3-6个氨基酸）（Argos，1990年； Crasto和Feng，2000年； George和Heringa，2002年； Chen et al。， 2013）。

5）

实际上，我们假设与荧光蛋白（例如，GFP或mCherry）融合后仍能保持正常行为的蛋白将在同一位置耐受VIP标签。

6）

对于活细胞标记，CoilE标签应可在细胞表面接触。例如，对于成像转铁蛋白受体1（TfR1），我们将标签放置在细胞外C端结构域上。

7）

对于固定细胞标记，可以将标签置于N-或C-末端或mEmerald和actin之间的两个域之间（ ie ，如我们的mEmerald-CoilE-actin-C18构建体所述）。

该协议包括用于实现VIPER的FM成像细胞蛋白的方法。这些成像实验是在转染的哺乳动物组织培养细胞上进行的。在步骤A中，我们提供了将质粒DNA编码的VIP标签构建体引入细胞的转染方案。在步骤B中，我们描述了在活细胞表面上标记跨膜受体的方法。在过程C中，我们描述了在固定细胞中成像细胞内靶标的方法。该出版物由Doh等人（2019a）（概述了如何产生CoilR探针肽）和Doh等人（em）（2019b）进行了补充，后者讨论了如何使用VIPER CLEM成像的蛋白质。图1中提供了用于实现这些方法的决策树。

图1.用于实施VIPER标记细胞蛋白的决策树。程序以其出现的出版物的颜色进行编码。出版物1：Doh等人，2019a;出版物2：本文；出版物3：Doh等人，2019b。

材料和试剂

注意：“ *”表示对实验成功至关重要的品牌。
材料

聚苯乙烯10厘米组织培养皿（Thermo Scientific，Nunc TM ，货号：12565020）
聚苯乙烯6孔组织培养板（Thermo Scientific，BioLite TM ，目录号：12-556-004）
带＃1.5玻璃（即，Cellvis，目录号：C8-1.5HN或Thermo Scientific，Nunc TM Lab-Tek TM ，目录号：155411）
LDPE 500毫升挤压洗瓶（Thermo Scientific，目录号：24010500）
转移灯泡移液器（VWR，目录号：16001-182）

试剂

U-2 OS单元（ATCC，目录号：HTB-96）
CHO TRVb细胞（由纽约州伊萨卡市康奈尔大学蒂莫西·麦格劳教授提供）（麦格劳等人，1987年）
VIP标签蛋白的质粒DNA（由用户生成）
mEmerald-actin-C18（Addgene，目录号：53978）
人运铁蛋白Alexa Fluor TM 488结合物; TF-AF488（Invitrogen，货号：T13342）
* Lipofectamine TM 2000（Thermo Scientific，目录号：11668019）
汉姆（Ham）的F-12培养基（Life Technologies，Gibco TM ，货号：11765062）
McCoy的5A介质（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：16600082）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，不含钙或镁； DPBS（Gibco TM ，目录号：14190144）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：25200056）
胎牛血清； FBS（GE，Hyclone TM ，货号：SH30910.03）
Opti-MEM（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：31985070）
Hoechst 33342核酸染色剂（Invitrogen，目录号：H1399）
牛血清白蛋白（BSA）组分V（国际研究产品，目录号：A30075100.0）
浸油（Carl Zeiss Immersol TM 518 F，货号：4449620000000）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：71289-5G）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443-100ML）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：558255100GM）
火腿的F12媒体
甘油（Thermo Fisher，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP229 1）
Tris（Thermo Fisher，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP152-500）
蔗糖（Thermo Fisher，Fisher Chemical，目录号：D16-500）
活细胞块解决方案（请参阅食谱）
安装介质（请参见食谱）
固定细胞块解决方案（请参阅食谱）

设备

血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1475）
CO 2 加湿培养箱（New Brunswick Galaxy 170S，目录号：C0170S-120-0000）
组织培养罩（Thermo Scientific，1300 Series A2）
组织培养倒置光学显微镜（卡尔·蔡司，蔡司·普里莫弗特）
旋转盘共聚焦荧光显微镜（Zeiss AxioObserver上的Zeiss Yokogawa CSU-X1）
线扫描（Airyscanning）荧光显微镜（倒置显微镜支架上的Zeiss LSM880）

软件

斐济（ImageJ版本2.0.0-rc-46）（Schindelin等人，2012年）

程序

转染细胞系以表达VIPER标签的蛋白
VIP标签已成功用于许多细胞系中。在中国仓鼠卵巢（CHO）TRVb细胞中使用VIPER（过程B）进行了受体成像。 CHO TRVb细胞不表达TfR1或转铁蛋白受体2（McGraw等人，1987），这使其成为用于TfR1-CoilE成像的有用细胞系。在人类骨肉瘤细胞系U-2 OS中完成了对固定细胞中的细胞内靶标的标记（过程C）。我们在其他未在此出版物中讨论的细胞系（例如，HEK293和AU565）中使用了VIP标签。
＆nbsp;我们建议优化每个细胞系的接种密度和转染条件。有关用Lipofectamine 2000转染的更多信息，请参见ThermoFisher的协议发布号MAN0007824 Rev 1.0 （参考文献24）。在我们的程序中，我们建议在第1天传代细胞，在第2天转染细胞，并在VIPER在第3天标记细胞以进行成像（请参阅步骤BC）。
程序A的建议：
•在处理活组织培养细胞系时，请使用无菌技术并在组织培养（层流）通风橱中工作。
•当用编码CoilE标签的蛋白（例如，pcDNA3.1_TfR1-CoilE）的载体转染细胞时，我们还建议用未标签的蛋白转染细胞以比较标记特异性（例如，pcDNA3.1_TfR1）。未转染的细胞也是标记特异性的有用对照。
•TfR1-CoilE和mEmerald-CoilE-actin-C18的氨基酸序列可在序列中找到（补充文件）。
•DNA质量对于高转染效率至关重要。通过紫外光谱法定量DNA质量，并验证260/280 nm比率在1.8和2.0之间。
•将基因导入细胞的方法有很多，我们鼓励研究人员使用针对其细胞系进行了优化的方法。
1. 第1天：将细胞传代并接种到8孔的盖玻片中。
  1. 开始之前，请在组织培养显微镜（例如，通过明场照明，低放大倍数）上目视检查细胞，以确认细胞是否粘附，健康且融合度为80-90％。
  2. 每孔（用于U-2 OS或CHO TRVb）将5 x 10 4 细胞接种到Nunc TM Lab-Tek TM 8孔室中盖玻片。
  3. 对于其他细胞系，播种的密度应能在24小时后达到80-90％的融合度。
  4. 媒体中不要包括抗生素。
  5. 对于U-2操作系统，请在添加10％FBS的McCoy的5A培养基中培养细胞。
  6. 对于CHO TRVb细胞，请在含5％FBS的Ham's F-12培养基中培养细胞。
2. 将细胞在潮湿的组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育过夜。
3. 第2天：：准备转染混合物：
  1. 将载体DNA稀释到Opti-MEM中。
    1. 对于8孔室盖玻片，每孔使用500 ng DNA。
    2. 使DNA的体积小于转染混合物总体积的10％。
  2. 将Lipofectamine 2000稀释到Opti-MEM中，并孵育5分钟：
    1. 对于8孔室盖玻片，每孔使用1,000 ng Lipofectamine 2000。
  3. 合并等体积的Lipofectamine 2000和DNA溶液，并通过移液混合。 DNA与Lipofectamine 2000的最终比率为1：2。将混合物在室温下孵育至少30分钟。
4. 转染细胞：
  1. 从细胞中吸出培养基。
  2. 将Opti-MEM添加到孔中。对于8孔室盖玻片，每孔使用200μl。
  3. 通过添加50μl转染混合物，将转染混合物稀释到每个孔中（1：5稀释）。每个孔中的流体总体积应为250μl。
  4. 通过上下移液或摇动带腔的载玻片轻轻混合溶液。
  5. 将转染混合物中的细胞在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中培养4小时。
    1. 对于U-2 OS和CHO TRVb单元，建议使用此时间范围。
    2. 通过在TC显微镜上观察来监控细胞。转染过程中细胞大小和形状应保持不变。如果细胞收缩或分离，则调整转染条件。
  6. 抽吸以除去转染培养基，并用完全培养基（例如，含FBS的培养基）洗涤一次。
  7. 添加完整的培养基，并在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中生长至少24小时。转染后24至48小时内即可使用细胞。
应用：在活细胞上用VIPER标记跨膜受体
VIP标签可用于研究细胞表面受体，该标签可用于标记和跟踪活细胞中的受体。在对活细胞进行成像时，由于探针肽（例如，CoilR-Cy5）不具有活细胞功能，因此VIPER标记仅限于细胞表面。此功能对于观察受体的运输或本地化种群随时间的变化是一个优势。
＆nbsp;程序B描述了一种对细胞中铁摄取进行成像的方法。简而言之，细胞中铁的吸收是由称为转铁蛋白受体1（TfR1）的跨膜受体介导的。该受体通过网格蛋白介导的内吞作用结合并结合铁结合的转铁蛋白（Tf）进入细胞。我们使用VIPER观察此过程。具体来说，我们描述了一种用共聚焦FM成像的红色荧光CoilR-Cy5标记TfR1-CoilE的方法。作为受体的异染色剂，我们还用与TfR1结合的荧光Tf（即，Tf-AF488）处理细胞。为了阻止内吞作用，将细胞在4°C下标记为活细胞。本文所述方法可用于对其他细胞受体成像。
＆nbsp;受体标记是在活细胞上进行的，TfR1可以在活细胞或固定后成像。在过程B中，我们指定在成像之前将细胞固定。这样做是为了方便起见，建议用户优化标签条件。或者，如我们的出版物所述，可以对细胞进行实时成像（通过延时拍摄 ie ）以观察受体的运输（Doh et al。，2018）。
＆nbsp;程序B从第3天开始，将细胞转染到按照程序A所述在8孔室玻片中转染。我们建议包括未标记或单标记的成像对照。我们还建议通过包括未标记的蛋白质对照来评估VIP标签的特异性。图2提供了一个示例幻灯片布局。

图2.用于成像表达TfR1的CHO TRVb细胞的8孔室盖玻片的布局。上排：表达Coil-E标签受体（TfR1-CoilE）的细胞。下排：表达无标签受体（TfR1）的细胞。每个孔中的第一行表示转染中使用的载体。后面的行表示标记试剂，它们根据其荧光进行颜色编码。

步骤B的建议
•保留细胞形态和健康状况对于优化标记和成像很重要。
•处理细胞进行成像时，切勿让细胞干燥。从8孔盖玻片上去除液体的首选方法是轻拂翻转玻片，使玻片快速翻转。水的表面张力将确保在排空井孔后留有足够的流体层。
•通过将溶液轻轻分配到孔壁上来减少细胞损失。 DPBS可以存放在挤压的清洗瓶中，以方便清洗。
•使用探针肽优化标记。 VIPER标记效率将取决于探针肽的质量，孵育温度和时间以及目标蛋白质的性质（丰度和定位）。我们已经成功地使用1 nM至1 µM探针肽对目标蛋白进行了标记和成像。以前的与未标记肽竞争的实验表明，100 nM肽足以标记大多数丰富的蛋白质靶标（Doh et al。，2018）。 em>
1. 第3天：在组织培养显微镜（例如，通过明场照明，低放大倍数）上目视检查转染的细胞，以确认细胞是否粘附，健康且80-90汇合百分比。＆nbsp;
2. 除去培养基，并向每个孔中加入100μl的活细胞阻断液（配方1）。返回组织培养箱30分钟。
  注意：我们包括此步骤，以减少与活细胞表面的非特异性结合。＆nbsp;
3. 当细胞处于活细胞封闭液中时，在没有血清的预冷Ham's F-12培养基中制备标记溶液。
  1. 将CoilR探针肽和50μg/ ml Tf-AF488稀释到Ham的F-12培养基中。每孔至少准备100μl溶液。我们建议您先尝试使用100 nM CoilR-Cy5。
  2. 与标准的免疫标记优化类似，我们建议测试一定范围的探针肽浓度以获得最佳的信噪比（例如，1 nM至500 nM CoilR-Cy5）。
  3. 此时可以将其他标记试剂（例如配体，抗体或细胞器污渍）添加到标记溶液中。
4. 从每个孔中删除活细胞块解决方案。
5. 向每个孔中添加100μl冷标记溶液。标记细胞在4°C下30分钟，避光。
6. 用冰冷的DPBS清洗每孔三遍。
  1. 可选步骤：向每个孔中添加完整的Ham F-12培养基，并在37°C下孵育样品5至30分钟，以使标记的受体能够运输（例如，，胞吞酶）。
  2. 可选步骤：有关脉冲追踪标签的说明，请参阅我们先前的出版物（Doh et al。，2018）。
7. 使用冰冷的4％v / v多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液在4°C下固定15分钟固定细胞。
  1. 通过将20％v / v PFA稀释5倍于DPBS来制备固定剂。为每项实验制作新鲜的固定剂。
  2. 打开的20％v / v PFA溶液可以在密封的小瓶中最多保存2周。
8. 每个孔用DPBS洗涤两次。
9. 可选步骤：可以在此过程中的此时进行免疫标记。
10. 用Hoechst 33342（10μg/ ml）的DPBS溶液在37°C下将细胞核染色5分钟。
11. 用DPBS洗涤孔一次。
12. 将固定介质（配方2）添加到孔中。
13. FM成像单元。有关成像系统和采集参数的更多信息，请参阅Doh的支持信息（Doh 等人，2018年）。我们使用的成像参数总结如下：
  1. 在Zeiss Yokogawa CSU-X1旋转盘共聚焦显微镜上使用63x / 1.4 NA油浸物镜对图像单元进行成像。
  2. 使用针对每个通道优化的相同采集设置捕获单个共焦切片。
  3. 使用405 nm激发光和450/50 nm发射滤光片对Hoechst 33342成像。
  4. AF488使用488 nm激发光和525/50 nm发射滤光片成像。
  5. 使用633 nm激发和670/30发射滤光片对Cy5成像。
应用：在固定后的细胞中用VIPER标记细胞内靶标
在过程C中，我们描述了使用VIPER在固定细胞中成像细胞内靶标的方法。 VIPER能够选择性标记与固定细胞中细胞器相关的细胞蛋白，包括细胞骨架，细胞核和线粒体（Doh et al。，2018）。我们使用表达载体编码与绿色荧光蛋白mEmerald融合的靶蛋白。与荧光蛋白融合用于确认VIP标签蛋白正确定位。对于融合蛋白，将CoilE标签插入mEmerald和目标蛋白（例如，，β-actin或组蛋白H2B）之间。这种方法还可以用于标记其他细胞内靶标（Doh等，2018）。标记细胞内靶标需要在用CoilR探针肽处理之前固定细胞，因为该肽不能穿过活细胞膜。我们提供了另一种阻止固定细胞以减少非特异性标记的方法。与步骤B相似，我们建议小心处理活细胞以保持活力并减少细胞损失。
＆nbsp;在程序C中，我们描述了一种在表达融合蛋白的m-2的U-2 OS细胞中突出显示肌动蛋白的方法：mEmerald-CoilE-actin-C18。固定的细胞用CoilR-Cy5探针肽处理。此程序从第3天在8孔室盖玻片中转染的细胞开始，该细胞可以按照程序A中所述进行制备。我们建议为每种荧光团（ ie ，mEmerald， Hoechst和Cy5），并包括未标记的蛋白质对照（mEmerald-actin-C18）。图3提供了一个示例幻灯片布局。

图3.图8：用于表达表达mEmerald-CoilE-actin-C18（上排）或mEmerald-actin-C18（下排）的U-2 OS细胞的8孔盖玻片的布局。每个孔的第一行表示转染中使用的载体。后面的线表示标记试剂，其基于其荧光进行颜色编码。在此设置中，包括了三种探针肽浓度（ i ，10、100和200 nM CoilR-Cy5），以鉴定最佳标记条件。
1. 第3天：在组织培养显微镜上目视检查每个孔，以确认细胞是否粘附，健康并融合80-90％。
2. 除去培养基，并用DPBS冲洗一次。
3. 在室温下，用DPBS中4％v / v PFA固定细胞10分钟。
4. 用DPBS清洗每孔两次，以去除固定剂。
5. 在室温下用0.1％（v / v）Triton X-100的DPBS渗透细胞10分钟。或者，可以用DPBS中的0.1％（w / v）皂苷透化细胞。
6. 用DPBS冲洗孔两次以除去去污剂。
7. 除去DPBS，向每个孔中加入100μl固定细胞阻断液（配方3）。在室温下孵育30分钟。
8. 在封闭步骤中，在“固定细胞封闭溶液”中准备标记溶液：
  1. 在固定细胞阻断溶液中使用1至500 nM CoilR探针肽（ i.e。，CoilR-Cy5）。
  2. 我们建议测试一定范围的探针肽浓度以获得最佳信噪比。
  3. 每孔准备100μl溶液。此时可以将其他标记试剂（例如配体，一抗或细胞器染色剂）添加到标记溶液中。
9. 取出固定细胞块溶液，然后将准备好的CoilR标记溶液添加到每个孔中。保护玻片避光，并在室温下孵育30分钟。
10. 用DPBS洗涤孔3次。
11. 在室温下，用Hoechst 33342（10μg/ ml）在DPBS中染色细胞核5-10分钟。
12. 用DPBS洗涤孔一次。
13. 将固定介质添加到孔中。
14. FM成像单元。图4提供了表达mEmerald-CoilE-肌动蛋白-C18或mEmerald-肌动蛋白-C18的细胞的代表性显微照片。有关成像系统和采集参数的详细信息，请参阅Doh等人的支持信息（Doh等人，2018年），摘要如下： >
  1. 使用Zeiss Yokogawa CSU-X1旋转盘共聚焦显微镜（或类似系统）上的63x / 1.4 NA油浸物镜对图像单元进行成像。
  2. 使用针对每个通道优化的相同采集设置捕获单个共焦切片。
  3. 使用405 nm激发光和450/50 nm发射滤光片对Hoechst 33342成像。
  4. 使用488 nm激发光和525/50 nm发射滤光片对mEmerald成像。
  5. Cy5使用633 nm激发和670/30发射滤光片成像。
  图4.使用VIPER在U-2 OS细胞中突出显示肌动蛋白。用编码mEmerald-CoilE-Actin-C18（mEm-CoilE-Actin；顶行）或mEmerald的载体转染U-2 OS细胞。 -Actin-C18（mEm-Actin；底部），用CoilR-Cy5（100 nM）处理标记后固定，然后通过共聚焦FM成像。 CoilR-Cy5标记特异于CoilE标记的蛋白质，在合并的图像中，Cy5（品红色）和mEmerald（绿色）荧光出现共定位（白色）。在表达mEmerald-actin-C18的细胞中未观察到Cy5标记。合并包括假核蓝色（Hoechst 33342）。

菜谱

注意：

除非另有说明，否则缓冲液是在高压灭菌的去离子水中制成的。
Tris缓冲液的pH值会随温度而变化，应在室温下测量pH。
DPBS的pH为7.0。

活细胞阻断解决方案
Ham的F-12媒体中10％（v / v）FBS和6％（w / v）BSA
注意：块解决方案可以在其他介质中准备，例如McCoy用于U-2 OS单元的5A介质。
安装介质
90％（v / v）甘油
10 mM Tris pH 7.0
0.1％（w / v）叠氮化钠
固定细胞块解决方案
10％（v / v）FBS
5％（w / v）蔗糖
DPBS中2％（w / v）BSA

致谢

该项目的研究得到了OHSU医学院和美国国立卫生研究院（R01 GM122854）的支持。 JKD由波特兰大学科学家成就奖章（ARCS）资助。本文描述的协议最初在Doh，Zane，等人（em.etm。（Doh等人，，2018）中进行了描述。荧光细胞器构建体（肌动蛋白，H2B和水户）购自Addgene的Michael Davidson荧光蛋白文库。 CHO TRVb细胞由Timothy McGraw教授提供。我们感谢OHSU的同事为这项工作做出的贡献，特别是Hannah Zane博士和Jonathan White博士。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。 VIP技术正在申请国际专利（PCT / US17 / 60609）。

参考文献

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