材料和试剂

玻璃管（Fisher，目录号：11852363）
移液器吸头（Gilson，目录号：F167104; F167103; F167101）
移液器
1 ml注射器（BD，货号：309628）
10 ml注射器（BD，货号：305959）
50 ml注射器（BD，货号：300865）
0.22μm针头过滤器（Merck，目录号：SLGP033RS）
21 G注射器针头（Sarstedt，货号：85.1162）
23 G注射器针头（BD，目录号：300800）
27 G注射器针头（BD，目录号：302200）
14 ml圆底管（Falcon，目录号：352059）
1.5 ml微量离心管（Trefflab，目录号：96.07811.9.03）
2 ml微量离心管（Trefflab，目录号：96.09329.01）
EDTA涂层毛细管（Sarstedt，目录号：16.444）
凝集比色皿（特定于凝集计; 例如，海伦娜（Helena），目录号：1473）
鼠标（杰克逊实验室，目录号：000664）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3059）
胶原蛋白（海伦娜（Helena），货号：5368）
凝血酶（Merck，货号：69671-3）
ADP（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
血小板活化因子（Sigma-Aldrich，目录号：511075）
血小板表面标记：
1. 抗人CD41-PE（用于检测整联蛋白α-IIb，Biolegend，克隆：HIP8，目录号：303706）
2. 抗人CD42b-PE（用于检测GPIb，Biolegend，克隆：HIP1，目录号：303905）
活化的血小板标记物：
1. PAC-1-FITC（用于检测活化的整联蛋白α IIb β 3 ，Thermofisher，克隆：PAC-1，目录号：MA5-28564）
2. 抗CD62P-FITC（用于检测α颗粒释放，Biolegend，克隆：AK4，目录号：304903）
3. 抗CD63-AF488（用于检测致密颗粒释放，Thermofisher，克隆：MEM-259，目录号：MA5-18149）
4. 抗人膜联蛋白V-FITC（Biolegend，目录号：640914）
5. 抗人IL-1α-FITC（R＆amp; D，克隆：3405，目录号：FAB200F）
大鼠单克隆抗小鼠CD42b（Emfret，目录号：R300）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：C8532）
Atroxin（Sigma-Aldrich，目录号：11335）
汉克的平衡盐溶液（HBSS）（西格玛奥德里奇，目录号：H9394）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
交联的胶原蛋白相关肽（CRP-XL）（理查德·法恩代尔教授，生物化学系，剑桥， https://collagentoolkit.bio.cam.ac.uk/thp/generic ）
磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
Tris base（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：75746）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
液氮
去离子水
盐酸
无血清DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：05671）
不含钙的蒂罗德缓冲液（波士顿生物产品公司，目录号：BSS-350）
柠檬酸钠用于血液的抗凝作用（请参阅食谱）
汉克的EDTA平衡盐溶液（HBSS）（请参阅食谱）
FAC缓冲区（请参阅食谱）
Laemmli缓冲液（请参阅食谱）

设备

-20°C冷冻室
带有旋转转子的离心机，适用于15 ml管（Eppendorf，型号：5810R）
超声波仪（Diagenode，Bioruptor，型号：UCD-200）
Accuri流式细胞仪（BD，型号：C6）
液氮杜瓦瓶
微量天平
37°C保温箱
啮齿动物的保温箱（Able Scientific，型号：ASHE011AR）
鼠标保护器（Braintree Scientific，型号：SHORTI STD）
体重秤
AggRAM凝集计（Helena Biosciences，110/220型）
蛋白质凝胶电泳仪

软件

C6分析软件（BD Accuri，目录号：653122）或其他适当的分析软件。

程序

注意：在室温下对活血小板执行所有实验步骤–请勿将血小板放在冰上。整个过程的示意图如图1所示。

图1.这些协议中概述的流程的示意图

人血采集
注意：建议使用柠檬酸钠抗凝以产生血清，但其他抗凝剂也可用于这些方案。有关更多详细信息，请参见注释部分。
1. 用成人同意的21 G注射器针头将9 ml静脉血抽入10 ml注射器中。这应该由有经验的抽血医师执行。
2. 从注射器上取下针头，立即将血液轻轻转移到装有1 ml 3.8％柠檬酸钠的圆底14 ml离心管中（请参见食谱）。
3. 轻轻颠倒三遍试管，将血液与柠檬酸钠混合。
采集小鼠血液
注意：建议使用柠檬酸钠抗凝以产生血清，但其他抗凝剂也可用于这些方案。有关更多详细信息，请参见注释部分。
1. 从鼠标背踏板静脉或其他静脉非末端收集部位收集75 µl血液。为了从踏板静脉收集血液，请将鼠标置于限制器中，并用23 G注射器针头穿刺静脉。通过将EDTA涂层毛细管固定在穿刺部位来收集血液。预热小鼠极大地有助于识别踏板静脉。
2. 或者，使用23 G针头和1 ml注射器在终端麻醉下通过心脏穿刺收集900 µl血液。从注射器上取下针头，立即将血液转移到装有100 µl 3.8％柠檬酸钠的微量离心管中。
流式细胞仪计数全血中的血小板
注意：在移液过程中，应避免气泡和多余的体积转移。
1. 通过轻轻颠倒试管几次来混合全血。
2. 使用20 µl移液器吸头，收集10 µl血液。用纸巾擦拭尖端外部以去除多余的体积。
3. 向190 µl FACs缓冲液中添加10 µl血液（请参见食谱）。轻轻地上下移液，将移液器吸头洗净至缓冲液中。
4. 轻轻移液将其充分混合，并弃去100 µl。在剩余的100 µl中加入0.5 µl抗CD41-PE（或其他荧光团偶联的血小板标记抗体），并轻轻混合。
5. 在室温下于黑暗中孵育20分钟。
6. 轻轻移液均匀混合。
7. 用干净的移液器吸头取出40 µl。用纸巾擦拭尖端外部以去除多余的血液。转移到1,960 µl FAC缓冲液中。
8. 颠倒六次，轻轻混合。
9. 立即通过流式细胞仪进行分析，以中速收集50 µl FSC-H阈值为25,000（或在不损失血小板事件的情况下消除噪声的最大阈值）。在每个样品之间进行反冲洗，并用样品之间的组织擦拭样品注入口，以去除多余的体积和血液。
  注意：对于无法进行体积测量的流式细胞仪，请使用计数珠。
10. 将数据显示为FSC-A对FL2-A（或所用抗体的适当荧光通道）。
11. 通过将来自血小板门和血小板/ RBC符合门的计数相加，记录阳性染色的血小板种群的计数（图2）。
12. 最终稀释度为1：1005，因此可以使用以下公式确定血液中的血小板计数：
  
  注意：如果使用液体抗凝剂，则必须考虑稀释系数。例如，对于1 ml：9 ml柠檬酸钠的血液，需要将上式中的值乘以[10/9]。人和小鼠的典型血小板计数分别为150-450 x 10 3 / µl和1,000 x 10 3 / µl。
  
  图2.结果示例，显示通过流式细胞仪分析血小板数量。在按流式细胞仪分析之前，将如上所述稀释的全血用抗CD41-PE染色。血小板和血小板/ RBC重合群体在FL2中具有较高的荧光。
从全血中产生富含血小板的血浆
1. 在RT <350> x g 下将全血离心20分钟。
2. 血液将分为两层：填充的红血球的下部暗层和富含血小板的血浆（PRP）的上部黄色层。 PRP量约为全血量的50％。
3. 小心地除去上层PRP层，然后转移到新的圆底离心管中。
4. PRP可直接用于凝集法实验。需要进一步处理以提供血清或产生洗涤后的血小板悬浮液。
  注意：与全血相比，血小板在PRP中的浓度更高。如果需要PRP中的血小板计数来裂解或激活血小板，则可以使用“通过流式细胞术计数全血中的血小板”方案，在步骤C3中使用10 µl PRP代替全血。
由富血小板血浆生产贫血小板血浆
1. 为了产生贫血小板血浆（PPP），将PRP在2,000 x g 室温下离心10分钟。
2. PRP将分为浅黄色上层（PPP）和血小板沉淀。小心除去上层PPP层，避免干扰血小板沉淀。
3. PPP可以用作凝集测定的对照（参见F节），并调节PRP浓度。它也可用于制备PPP衍生的血清，该血清缺乏从活化血小板释放的因子。
凝集法评估血小板功能
1. 将250 µl PPP分装到装有搅拌棒的玻璃凝集比色皿中。
2. 将比色杯插入凝集计中并读取读数。这会将凝集计校准为100％聚集。移开试管。
3. 将250 µl PRP或洗涤后的血小板悬浮液等分到装有搅拌棒的新鲜凝集比色皿中。在不含钙的Tyrode缓冲液中，应将洗涤后的血小板悬浮液中的血小板浓度调整至标准水平，建议浓度为2 x 108 / ml。对于使用PRP的实验，可以使用贫血小板血浆（PPP）调整血小板浓度。
4. 将比色杯插入聚集仪中，并开始记录透光率的变化。
5. 30秒后，添加激动剂（请参见下表1）。持续记录透光率变化15分钟。应调整激动剂的浓度，以确保激动剂的体积不超过血小板体积的1/100。改变激动剂浓度可以揭示有关血小板对不同激动剂敏感性的信息。图3中显示了一个示例聚集度描记线。
  注意：建议的体积可能会因凝集计型号而异，请根据制造商的建议使用体积。
  
  图3.代表性的凝集曲线。上面的凝集曲线显示，经过洗涤的血小板悬液在1 µg / ml CRP-XL的作用下聚集，从而增加了透光率。
从柠檬酸钠抗凝的血液中产生血清
1. 为了从PRP产生血清，将22 µl 1 M CaCl 2 加入1 ml PRP中，并在玻璃管中于37°C孵育，直到形成凝块并从管的侧面缩回。。这大约需要30-45分钟。将液相（血清）转移到干净的微量离心管中，并储存在-20°C下。
2. 为了从PPP中产生血清，将22 µl 1 M CaCl 2 加入1 ml PPP中，并在37°C下孵育直至凝固。凝结的PPP会形成不凝结的疏松凝块。在10,000 x g 下将凝结的PPP离心1分钟，然后将上层液体（血清）转移到干净的微量离心管中。储存在-20°C。
血小板洗涤
1. 用5体积的无钙HBSS稀释PRP（参见步骤D），并补充4 mM EDTA，pH 6.4，以洗涤血小板（参见配方）。
2. 在室温下以350 x g 离心20分钟。
3. 洗涤后的血小板可以直接重悬到适合实验的培养基中。
  注意：清洗后的血小板中将存在少量白细胞。反复进行清洗步骤将减少白细胞污染。
血小板活化测定：制备血小板用于流式细胞仪或裂解物生产
1. 为了产生与血小板凝集法可比的结果，请在搅拌条件下在凝集法比色杯中进行这些实验。
2. 离心血小板后（请参见H部分），将血小板沉淀轻轻重悬至无钙，无EDTA的HBSS，pH 6.4（请参见食谱）。将血小板稀释至4 x 10 8 / ml（以20μl的工作体积提供8 x 10 6 血小板），根据条件数调整体积并重复。＆nbsp;
3. 通过添加血小板激动剂激活血小板（示例请参见表1）。确保您包括车辆控件。
4. 将血小板染色以进行流式细胞术，或为Westerns，等制备裂解物。
  
  表1.血小板激动剂的例子和激活血小板的浓度
用于ELISA的血小板裂解液的产生
1. 血小板活化后，将8 x 10 8 血小板重悬于400μl无血清DMEM中。根据血小板数调整体积。如果需要，使用蛋白酶，磷酸酶，等和抑制剂。
2. 使用液氮将管冻融3次。将试管浸入液氮中使其完全冻结，然后取出并在室温下完全除霜。
3. 在冰上超声处理3次，持续30 s。
4. 在室温下以13,000 x g 离心3分钟，沉淀出碎片。将上清液转移到干净的微量离心管中。
5. 储存在-20°C直到使用。
制备用于Western Blot的血小板裂解液
1. 血小板活化后，将3 x 10 8 血小板直接重悬于100μl1x Laemmli缓冲液中。
2. 在95°C下加热5分钟，然后在冰上冷却。
3. 在SDS-PAGE迷你凝胶的每泳道中装入10μl的3 x 10 7 血小板。
血小板染色用于流式细胞仪
1. 使用任何用于流式细胞术的标准染色方案对感兴趣的表面蛋白染色血小板悬浮液。始终将血小板保持在室温下。从小体积处理血小板沉淀是困难的，因此避免洗涤步骤的方案是优选的，以避免在上清液抽吸期间丢失血小板。
2. 将10 µl对照或活化血小板与血小板表面标记物和感兴趣的血小板活化标记物共染色（例如，参见表2和3）。
3. 用FAC缓冲液将血小板悬浮液稀释至120 µl（请参见食谱）。
4. 通过流式细胞仪分析血小板，确保FSC采集阈值足够低，以识别整个血小板群体，同时排除噪音（请参见注释）。
  
  表2.血小板标记染色抗体的例子
  
  表3.用于定量血小板活化标记物的抗体示例
小鼠血小板耗竭
注意：体内抗血小板中的抗CD42b可能会耗尽血小板。
1. 通过从踏板静脉收集血液（约20 µl）（参见B节），并通过流式细胞仪进行血小板计数（参见C节），确定小鼠的基线血小板计数。
2. 使用体重秤称量小鼠。
3. 准备抗CD42b，以便每只小鼠在100-200 µl无菌PBS中接受1.8 µg / g体重。例如，对于一只25 g的小鼠，将75 µl的PBS添加到125 µl的0.5 mg / ml抗CD42b储备液中，以获得0.31 mg / ml的工作溶液并给药147 µl。仅将无菌PBS用作载体对照。
4. 将小鼠放入37℃的啮齿动物加热箱中15分钟，以促进静脉扩张。
5. 将鼠标置于限制器中，并通过27 G针静脉内尾静脉注射进行抗CD42b或媒介物对照。使注射部位保持压力，直到出血消退。
6. 以所需的频率重复踏板静脉血液采样和血小板计数。
  注意：血小板计数低时，采样点的出血时间会延长，因此请施加至少10分钟的压力并仔细监测止血情况。

数据分析

使用FSC-A和SSC-A参数收集图上的事件（图4）。
以对数刻度绘制PE荧光强度（血小板标记+ ve事件）相对于FITC荧光强度（血小板激活标记+ ve事件）。
在对照样品上使用象限选通，以将CD41阳性对照血小板数量限制在左上象限。
在任何情况下，PE + / FITC +种群都会出现在右上象限，从而导致双阳性染色。
计算左上象限和右上象限的中值荧光强度（MFI）。要删除背景，请从染色的细胞中减去未染色细胞的MFI。
从每个条件的重复项计算平均MFI。
数据也可以分析为占细胞总数的百分比。为此，将PE + / FITC +事件（右上门）除以PE +事件（左上门和右上门）并乘以100，即可计算出感兴趣的人口百分比。

图4.用胶原蛋白刺激后血小板活化状态变化的例子。按上述方法制备血小板，并用胶原蛋白刺激，然后再用PE偶联的血小板标记物（在这种情况下为CD41）进行共标记。，以及与FITC结合的血小板活化标记物/目标蛋白质（在这种情况下为细胞表面IL-1α）。用胶原蛋白治疗可导致FITC阳性血小板向右移动。

笔记

血小板很敏感，应轻轻处理以避免活化。除非另有说明（即，37°C），否则应将全血，富含血小板的血浆和洗涤过的血小板始终保持在室温下。
柠檬酸钠是这些方案的推荐抗凝剂，因为其二价阳离子的螯合可通过添加CaCl 2 来逆转，从而易于产生血清。如果需要，也可以使用其他不可逆的抗凝剂进行这些操作。如果需要血清，则添加最终浓度为750 ng / ml的Atroxin（Bothrops atrox毒液）将使纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，并将其从血浆中清除（Wentzensen等人，2011年； Karapetian），2013）。
通过流式细胞仪（包括血小板）检测小颗粒取决于将它们与碎片和电子噪声准确区分开。对于Accuri C6，FSC-H阈值为10,000，中等流速适合检测血小板数量。

菜谱

柠檬酸钠用于血液抗凝
1. 通过将380 mg柠檬酸钠溶于7 ml水中来制备3.8％柠檬酸钠溶液
2. 用浓盐酸调节pH至7
3. 加水至最终体积为10毫升
4. 将溶液在2-8°C下保存6个月。使用前让溶液达到室温
5. 要以0.38％的柠檬酸钠终浓度抗凝，可在9 ml的全血中加入1 ml的3.8％柠檬酸钠溶液。根据最终血量调节柠檬酸钠的量
汉克的EDTA平衡盐溶液（HBSS）
1. 将250 µl 1 M EDTA加入50 ml HBSS中并充分混合
2. 用浓盐酸调节pH至6.4
3. 将溶液在2-8°C下保存2周。使用前让溶液达到室温
FAC缓冲区
1. 将0.5 g BSA溶于50 ml PBS
2. 加入250 µl 10％叠氮化钠溶液（0.5 g叠氮化钠溶于5 ml去离子水中）
3. 使用前通过0.22μm注射器过滤器过滤
4. 将溶液在-20°C下保存6个月。使用前让溶液达到室温
1个Laemmli缓冲器
在15毫升试管中，添加：
0.8 ml Tris 1 M，pH调节至6.8
去离子水中1毫升20％SDS
1毫升甘油
0.53毫升β-巯基乙醇
5毫克溴酚蓝
用去离子水调整至10毫升
将溶液在2-8°C下保存3个月

致谢

这项工作由英国心脏基金会授予MCHC，FS / 18/19/33371和RG / 16/8/32388授予MCHC，PG / 18/64/33922授予NP，BHF剑桥研究中心资助研究卓越RE / 13/6/30180，以及剑桥NIHR生物医学研究中心。这里描述的协议改编自以前的工作（Burzynski等，2019）。

利益争夺

作者声明，他们没有利益冲突，无论是经济利益还是其他利益。

参考文献

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Wentzensen，N.，Rodriguez，AC，Viscidi，R.，Herrero，R.，Hildesheim，A.，Ghosh，A.，Morales，J.，Wacholder，S.，Guillen，D.，Alfaro，M.，Safaeian ，M.，Burk，RD和Schiffman，M.（2011年）。竞争性血清学分析表明，在瓜纳卡德（guanacaste）自然史研究中，自然获得的对人乳头瘤病毒感染的免疫力。 a> J传染病 204（1）：94-102。
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