材料和试剂

DNA提取
1. 过滤嘴（1,000μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.762.211; 200μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.760.211; 20μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.760.213）
2. 低结合力Eppendorf管（DNA LoBind Snap Cap PCR Tube，1.5 ml）（Eppendorf，货号：022431021）
3. PM1细胞（Lusso et al。，1995）
4. HIV-2感染者的全血标本，保存在-70°C的冰箱中。将样品收集在EDTA试管中（BD生命科学，Vacutainer喷涂K2EDTA试管，目录号：367841）
5. 未感染个体的全血标本，保存在-70°C的冰箱中。将样品收集在EDTA试管中（BD生命科学，Vacutainer喷涂K2EDTA试管，目录号：67841）
6. 载体RNA（poly A）（1350μg）（Qiagen，目录号：1017647）在使用前先在室温下保存，然后在-20°C下保存
7. Gibco TM RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11875093），在打开瓶之前应储存在4°C下
8. Gibco TM 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：26140079），在热灭活之前储存在-20°C的冰箱中，然后分装并储存在-20°C
9. Gibco TM 青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：15140122），储存在-20°C
10. QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，目录号：51304），在室温下保存
11. QIAamp Blood DNA Mini Kit（Qiagen，目录号：51104），在室温下保存
12. Gibco TM 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH = 7.4）（Thermo Scientific，Fisher Scientific目录号：10010023），在室温下保存
13. 完整的RPMI-1640培养基（请参见食谱）
制定标准
1. 过滤嘴（1,000μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.762.211; 200μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.760.211; 20μl过滤嘴：Sarstedt，货号：70.760.213）
2. 移液器吸头（1,000μl滤嘴：Sarstedt，货号：70.762.100; 200μl滤嘴：Sarstedt，货号：70.760.502; 10μl吸嘴：Sarstedt，货号：70.1130）
3. 低结合力Eppendorf管（DNA LoBind Snap Cap PCR Tube，1.5 ml）（Eppendorf，货号：022431021）
4. MicroAmp TM 光学8管试管，0.2毫升（Thermo Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4316567）
5. MicroAmp TM 光学8盖条（Thermo Scientific，Applied Biosystems TM ，货号：4323032）
6. HIV-2（NIH-Z株）纯化病毒和电子显微镜计数（Advanced Biotechnologies Inc，目录号：10-127-000），在-70°C的冰箱中储存
7. Qiagen miRNeasy微型试剂盒（Qiagen，目录号：217084），在4°C下储存
8. DNA寡核苷酸引物获自Invitrogen，并列于表1中，将寡核苷酸储存在-20°C下
9. 具有Platinum TM Taq DNA聚合酶的SuperScript TM III一步式RT-PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：12574018），储存在-20°C的冰箱中。 SuperScript TM III一步式RT-PCR系统随附以下内容：
  1. SuperScript ® III RT /铂® Taq 混合物（50μl）
  2. 2x反应混合物（每毫升dNTP含0.4 mM，MgSO 4 含3.2 mM）（1毫升）
  3. 5 mM硫酸镁（500μl）
10. Platinum TM Taq DNA高保真酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：11304011），存储在-20°C的冰箱中。 Platinum ® Taq DNA聚合酶高保真度（20μl，5 U /μl）具有以下附件：
  1. 10x高保真缓冲液[600 mM Tris-SO 4 （pH 8.9），180 mM（NH 4 ） 2 SO 4 ]（1.25毫升）
  2. 50 mM MgSO 4 （1毫升）
11. 琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：16500500），在室温下保存
12. Milli-Q优质水（RNase，不含DNase的水[dH 2 O]）（VWR，目录号：SH30538.02），在室温下存储
13. AccuGENE TM 50倍TAE缓冲液（Lonza，目录号：51216），在室温下保存
14. 凝胶红色（VWR International，目录号：41003），在室温下保存
15. QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28104），在室温下保存
  
  表1.用于HIV和 PBDG 标准制剂的引物
用于HIV-2 DNA检测的定量PCR
1. 移液器吸头（1,000μl滤嘴：Sarstedt，目录号：70.762.100; 200μl滤嘴：Sarstedt，目录号：70.760.502）
2. 96孔qPCR板（Applied Biosystems TM ，货号：4346906）
3. 光学胶膜（Applied Biosystems TM ，目录号：4360954）
4. HyClone TM 水，分子生物学等级（RNase，DNase，无蛋白酶）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，GE Healthcare HyClone SH30538.FS，目录号：10247783），在室温下保存
5. 被HIV-1感染的U937细胞（U1）（Folks et al。，1987年）
6. Maxima探针qPCR Master Mix（2x）（Thermo Scientific，目录号：K0231），储存在-20°C的冰箱中。 qPCR预混液包含以下内容：
  1. 2x含Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶和dNTP的Maxima Probe / ROX qPCR Master Mix（1.25 ml）
  2. 无核酸酶水（1.25毫升）
7. HIV-2的引物和探针序列可从Damond等（2002）（PMID：12354861）获得。储存在-20°C的冰箱中
8. 管家人类基因PBGD的引物和探针序列获自Mbisa et al。（2009）（PMID 19020818）。储存在-20°C的冰箱中
9. 琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：16500500），在室温下保存
10. Milli-Q优质水（RNase，不含DNase的水[dH 2 O]）（VWR，目录号：SH30538.02），在室温下存储
11. AccuGENE TM 50倍TAE缓冲液（Lonza，目录号：51216），在室温下保存
12. 凝胶红色（VWR International，目录号：41003），在室温下保存
13. 1 Kb Plus DNA梯子（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，货号：10787018），在-20°C的冰箱中储存

设备

EVE TM 自动细胞计数器，NanoEnTek（VWR，Avantor，目录号：10027-452）
带台盼蓝的EVE TM 细胞计数玻片（VWR，Avantor，目录号：10027-446）
Eppendorf微量离心机，型号：5415D，转子F 45-24-11，AC / DC输入230 V AC，50-60 Hz（Sigma-Aldrich，目录号：Z604062）
Life Eco热循环仪，96孔梯度，100-240V，50-60Hz，600W，（Bioer Technology Co.，目录号：BTC42096）
吉尔森单通道/可调体积移液器：0.1-2μl，2-20μl，20-200μl，100-1,000μl（Eppendorf，目录号：F167380）
Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统（Thermo Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4376600）
NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-2000C）
迷你ReadySub-Cell TM 电泳系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704467）
紫外线透明凝胶托盘（Bio-Rad实验室，目录号：1704435）
8孔梳子（Bio-Rad实验室，目录号：1704463）
Gel Doc TM XR +凝胶文档系统（Bio-Rad实验室，目录号：1708195）

软件

图像分析软件，Image Lab TM 软件（生命科学，Bio-Rad）
Excel 2016（Microsoft）
GraphPad Prism 7.0。

程序

制备HIV-2 qPCR的主要步骤：

如步骤A1和A2所述，从PM1细胞中提取DNA。
使用提取的PM1细胞DNA，按照程序B“制备 PBDG 标准”中的说明制备细胞对照 PBDG 。
从HIV-2分离物中提取病毒RNA以制备HIV-2标准品，如步骤B“ HIV-2标准品的制备”所述。
按照步骤A3的指示从全血中提取病毒DNA。
按照步骤C所述设置HIV-2 qPCR。

DNA提取
1. 在1.5 ml Eppendorf管中收集5 x 10 6 PM1细胞（Lusso et al。，1995），并以200 x g 离心5分钟。丢弃上清液，并在1 ml无菌PBS中洗涤沉淀两次。将干燥的沉淀物储存在-20°C直至DNA提取。
  注意：
  1. PM1细胞系是经过修饰的CD4 + T细胞克隆，表达诸如CCR5和CXCR4的共受体（Lusso et al。，1995）。
  2. 解冻后，将PM1细胞保持在完整的RPMI-1640（Invitrogen）（请参阅食谱）中，直到第3代。通过使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
  3. U1是U937慢性HIV-1感染细胞的亚克隆（Folks 等人。，1987）。这些细胞在其基因组中携带整合的HIV-1，因此提取的DNA可用作阴性对照并检测其特异性。
  4. 对于阴性对照，收集5 x 10 6 U1细胞（民谣等。
2. 要提取PM1细胞的细胞DNA，请按照制造商的说明使用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit。使用50μl缓冲液AE的单次洗脱。
  注意：
  1. DNA提取应在配有单独空气处理机制的细胞生物学级清洁通风橱中进行，或在无DNA通风橱中进行。洗脱前添加额外的离心步骤以减少EtOH污染：20,000 x g持续1分钟。要进行洗脱，请使用预热的AE Buffer（56°C），并在室温下孵育2分钟。
  2. 对于阴性对照，根据制造商的说明，使用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit从收集的U1细胞中提取DNA（Folks et al。，1987）。在50μl缓冲液AE中。
3. 根据制造商的说明，使用Qiagen QIAamp Blood DNA Mini Kit在5μg载体RNA存在下从200μl全血中提取病毒DNA。将DNA上样至离心柱并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。
  注释
  1. DNA提取应在生物安全柜中进行。
  2. 应将全血样品收集在EDTA试管中，并在-70°C下保存直至提取DNA。
  3. 要减少DNA的降解，请避免全血样品的冷冻/解冻。
  4. 应使用低结合力的Eppendorf管进行提取。
4. 将DNA提取物在-20°C下保存长达数周。
制定标准
HIV-2标准的制备
1. 根据制造商的说明，使用Qiagen miRNeasy micro Kit根据制造商的说明对电子显微镜计数的HIV-2颗粒从1.44 x 10 11 RNA拷贝/ ml中提取RNA，从而制备HIV-2标准品。
  注意：
  1. HIV-2对照原液的浓度为7.2 x 10 10 病毒颗粒/ ml。由于两个RNA基因组包装在每个病毒颗粒中，因此最终库存包含：1.44 x 10 11 RNA拷贝/ ml = 1.44 x 10 8 拷贝/μl（7.2 x 10 10 乘以2）。从储备液+ 95μlPBS中提取5μl样品（HIV-2）。提取的RNA应以30μl洗脱。在这种情况下，样品浓度为2.4 x 10 7 拷贝/μl（（1.44 x 10 8 x 5）/ 30）。使用10倍稀释系列以达到5,000拷贝/μlRNA浓度。
  2. 通过使用miRNeasy micro Kit纯化，可获得更高的收率，并允许以较小的体积洗脱。
  3. 要增加提取的RNA的产量：将qiazol试剂的量从700μl增加到1000μl。双重孵育时间（10分钟而不是5分钟）。提取时使用200μl的氯仿代替140μl。
  4. 为提高提取效率，在转移水相之前和之后添加5μl载体RNA（1μg/μl）。
  5. 使用350μlRWT缓冲液洗涤两次，在洗涤步骤之间添加DNase以减少DNA污染量。
  6. 在30μl无RNase的水中洗脱RNA。
2. 使用SuperScript III一步式RT-PCR系统和Platinum Taq DNA聚合酶提取RNA后，即可直接进行cDNA合成。在25μl反应体积中准备cDNA合成，其中包含2x逆转录缓冲液（每个dNTP为0.4 mM，3.2 mM MgSO 4 ），1μl洗脱的总RNA，100 ng正向和反向引物，SuperScript TM III一步法RT-PCR系统，带有Platinum TM Taq DNA聚合酶和无RNase / DNase的无菌水，直至最终体积（参见表） 2）。
  
  表2.通过逆转录和第一轮巢式PCR制备cDNA的合成
3. 使用以下程序定量RT-PCR的HIV-2 gag 片段（850个碱基对）：在50°C下30分钟进行cDNA初始合成，然后进行扩增：在94℃下进行2 min初始变性°C，在94°C下进行15 s的35个循环，在50°C下进行30 s，在68°C进行45 s的循环，最后延伸步骤在68°C进行5分钟。
  注意：通过使用引物对BEN_740F和BEN_1640R加上HIV-2链，可以扩增 gag 。扩增片段的估计大小为850个碱基对。
4. 在用Gel Red染色的1％琼脂糖凝胶上可视化PCR产物，在1x TAE缓冲液中以110 V运行45分钟。
  1. 根据制造商的说明，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。将DNA上样至离心柱并在50μl无菌水中洗脱。使用NanoDrop ND-1000分光光度计定量PCR产物的浓度，并在相同的运行条件下将其在1％琼脂糖凝胶上可视化（见图1）。
  2. 纯化的HIV-2 gag 应保存在-20°C直至需要。
    
    图1.检测纯化的HIV-2 PCR产物 gag PCR。成功进行PCR纯化的一个例子在1％凝胶红色染色的琼脂糖凝胶上可视化。 L = 1 KB DNA阶梯，1和2 = HIV-2 PCR产物，估计大小为850 bp。
PBDG 标准的制备
1. 分两个步骤进行宿主基因标准品（ PBDG 片段）扩增（外部，然后进行巢式PCR）。在25μl溶液中准备外部PCR，该溶液包含：10 ng PM1细胞洗脱DNA，Dream Taq DNA聚合酶，5 mM dNTP混合物和100 ng /μl引物（PBGD-CF1和PBGD-CR2）（请参见表3）。在用Gel Red染色的1％琼脂糖凝胶上可视化PCR产物，在1x TAE缓冲液中以110 V运行45分钟。
2. 巢式PCR溶液的反应应包含：1μl外部PCR产物，Dream Taq DNA聚合酶，5 mM dNTP混合物和100 ng /μl引物（PBGD-CF1和PBGD-CR1）。在与上述相同的条件下，在用Gel Red染色的1％琼脂糖凝胶上检测PCR产物。
  
  表3.通过两步PCR进行的宿主基因
3. 外部和嵌套PCR循环参数：在94°C下初始变性2分钟，然后在94°C下进行30 s的35个循环，在55°C下进行30 s，在72°C下进行45 s的最后35个循环72℃。
4. 根据制造商的说明，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。将DNA上样至旋转柱，在50μl无菌水中洗脱，并使用NanoDrop ND-1000分光光度计定量PCR产物的浓度，并在与上述相同的运行条件下在1％琼脂糖凝胶上检测产物。
  注意：
  1. 要进行RNA洗脱，请使用无RNase / DNase /蛋白酶的水。
  2. 在0.2 ml MicroAmp TM 光学8管中进行 cDNA合成和一步PCR反应。
  3. 解冻和混合后，必须将汤料和稀释液保存在冰上，不使用时应在-20°C下冷冻。移液器混合或轻弹混合样品和稀释液，请勿涡旋混合。
  4. RNA提取，RNA和DNA稀释，PCR设置必须在无扩增子的室内进行，并应使用过滤的移液器吸头进行。
  5. 改良的Damond 等人的PCR方案。（2002）用于HIV-2 qPCR。
用于HIV-2 DNA检测的定量PCR
qPCR的主要步骤（请参见图2作为实验布局的示例）：1）如步骤C1所述，用无菌水代替DNA从感染和未感染个体的提取DNA中制备HIV-2的实时PCR反应。，C2和C3。 2）如步骤C5所述，从对应于10 6 到1个DNA拷贝的HIV-2 gag 片段准备针对HIV-2标准的PCR反应。 3）用无菌水代替步骤C6中所述的DNA，从感染和未感染个体的提取DNA中制备 PBDG 的实时PCR反应。 4）按照步骤C7所述，从对应于10 6 到100个DNA拷贝的纯化持家基因片段，为 PBDG 标准制备PCR反应。 5）所有反应都需要使用96孔板进行。 6）在步骤C10中提到的条件下进行qPCR反应。 7）使用步骤C11中的公式计算样品浓度。

图2.实验布局示例。蓝色表示HIV-2 gag 的qPCR，黄色表示 PBDG的实时PCR 基因。标准曲线从8个（对于HIV-2）（10 6 到1个副本）和5个稀释度（对于 PBDG ）（10 6 至100份）稀释液。每个样品和对照均一式两份在96孔qPCR板上制备。 U1细胞的DNA代表阴性和特异性对照（因为这些细胞带有整合的HIV-1基因组，但没有HIV-2基因组）。
1. 在包含15μlThermo Fisher Maxima探针qPCR Master Mix，4μMTaqman探针，100 ng /μl每种引物和8μl模板的30μl溶液（每个样品的量）中，准备针对HIV-2的以下实时PCR反应DNA。
  注意：
  1. 引物和探针的序列来自Damond 等人。（2002）（PMID：12354861）。
  2. 如步骤A3所述，从200μl全血中提取样品DNA。为了提高提取效率，在病毒DNA提取过程中使用载体RNA。
  3. 由于在提取过程中使用了载体RNA，因此无法可靠地定量DNA，因为分光光度定量法可以检测溶液中的RNA和DNA。
2. 作为阴性对照，添加8μl无菌水代替DNA。
3. 通过使用未感染个体的DNA建立相同的反应，以确保引物对病毒DNA的检测具有特异性。
  注意：以与感染样本相同的方式从200μl未感染个体的全血中提取DNA（参见步骤A3）。
4. 另外，在存在1μgPM-1细胞DNA的情况下准备反应，以排除人类DNA污染是否对实时PCR的敏感性产生影响。
5. 为了定量，使用一系列的HIV-2 gag 片段的十倍稀释液，对应于标准品的10 6 到1 DNA拷贝，并将其包括在每个实验中为了生成外部标准曲线。每个样品和标准品应一式两份进行定量（见图3和4）。
  注意：HIV-2 qPCR的最关键步骤是标准液的制备。使用1.5 ml低结合性Eppendorf管制备稀释液。通过上下移液将每个试管混合，然后离心，然后准备下一个稀释液。
  
  图3. HIV-2标准品的系列稀释方案。通过从10 9 “储备液”中吸取5μl到10 ，在1.5 ml Eppendorf管中制备系列稀释液。每管8份拷贝，然后加入45微升水。上下移液以混合并短暂离心。使用新的吸头，从试管10 8 吸取5μl到试管10 7 。上下吸移以混合并离心几秒钟。对其他管重复相同的过程。黄色高亮显示用于执行HIV-2标准曲线的稀释液。
  
  图4. HIV-2的标准曲线 gag 片段。 A. TaqMan探针对以下基因的敏感性测试利益。扩增图显示了宿主基因10倍稀释系列（10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 ，每个反应一式两份，分别复制100、10和1个DNA）。 B.宿主基因数量（10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 之间的线性回归分析sup>，每个反应100、10和1个DNA副本，一式两份）和Ct值。回归方程的计算公式为y = -3.305 + 38.692，R 2 = 0.999。红色框代表Ct值。
6. 将HIV-2 DNA标准化以表达管家人类基因 PBGD 。准备以下反应：12.5μlThermo Fisher Maxima探针qPCR Master Mix，50 ng /μl引物，2μM探针和3μl模板DNA。
  注意：
  1. PBGD基因的引物和探针序列获自Mbisa 等人。（2009）（PMID 19020818）。
  2. 使用未感染和感染者的提取DNA作为模板DNA。有关DNA的制备，请参阅步骤A3。
7. 对于每次运行，应从纯化的 PBDG 片段（从10 6 到100个DNA拷贝）生成一条标准曲线（见图5）。
  注意：
  1. 按照步骤C6中所述为 PBDG 标准准备相同的反应。
  2. 类似于HIV-2标准制剂，应使用1.5 ml低结合试管稀释 PBDG 。通过上下移液进行混合，然后在每次稀释之前都必须进行离心。
8. 将反应混合物分配到96孔qPCR板的孔中，并避免气泡。图2提供了一个板布局示例。
9. 用粘性塑料薄膜覆盖qPCR板，短暂离心。
10. 进行qPCR，首先在95°C变性10分钟，然后在95°C变性40个循环15 s，在60°C退火30 s，最后延伸在72°C 30 s。
11. HIV-2 DNA浓度应首先报告为从qPCR反应中获得的HIV-2 DNA拷贝/微升。然后将HIV-2 DNA的拷贝数标准化为宿主基因。最终结果报告为拷贝数/ 10 5 个细胞。转换结果的公式为：（每细胞μlHIV-2 DNA拷贝数）/（每细胞每μl/ 2条染色体 PBDG 拷贝数）×10 5 细胞= HIV-每10 5 个细胞2个DNA拷贝。
  注意：使用Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统执行定量实时PCR（qPCR）。从U1细胞，HIV阴性和HIV-1感染者中提取的DNA可用作对照。
  
  图5. PBDG （宿主基因）的标准曲线。 A. TaemMan探针对 PBDG 宿主基因。扩增图显示了宿主基因10倍稀释系列（10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 ，每个反应一式两份地复制100个DNA）。 B.宿主基因数量（10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 之间的线性回归分析sup>和每个反应100个DNA副本，一式两份）和Ct值。回归方程的计算公式为y = -3.483 + 39.893，R 2 = 0.999。红色框代表Ct值。

数据分析

首先从AB StepOnePlus实时PCR系统导出获得的副本号。计算每个样本的重复测量副本数的平均值。
注意：要确定全血中的HIV-2 DNA含量，请使用对胆色素原脱氨酶（ PBDG ）基因拷贝的标准化表达每个细胞的HIV-2 DNA拷贝数字。
首先将DNA水平以PCR反应中获得的每微升拷贝数表示，然后将HIV-2 DNA的水平标准化为PCR反应中获得的每微升 PBDG 拷贝数。在每个实验中设置样品和标准品的副本。使用以下公式转换结果：（每μlHIV-2 DNA拷贝）/（每μl PBDG 拷贝）/每个细胞/ 2个染色体）×10 5 个细胞=每10 5 个细胞的HIV-2 DNA拷贝数。图6提供了一个计算示例。

图6.未知样品的HIV-2 DNA拷贝的计算。 A. HIV-2 gag 片段的标准曲线以及未知样品的拷贝数。红色框代表HIV-2 gag 片段的Ct值。 HIV-2 gag 基因10 6 ，10 5 ，10 4 ，10的数量之间的线性回归分析每个反应 3 ，100、10和5个DNA副本，一式两份）和Ct值。蓝色框代表未知样品的HIV-2 gag Ct值。 B. PBDG （管家基因）和未知样品的标准曲线。 PBDG 基因数量（10 6 ，10 5 ，10 4 ，10 3 ，每个反应100和1个DNA副本，一式两份）和Ct值。红色框代表未知样品的 PBDG 的Ct值，蓝色框代表未知样品的 PBDG 的Ct值。 C.用于将结果转换为每10 5 个细胞的HIV-2 DNA拷贝的公式。
为了定量分析，在存在或不存在1μgHIV-2阴性PM1细胞DNA（背景DNA）的情况下，分析稀释后的标准液（参见图3）。两条曲线显示其定量或PCR效率的线性范围无差异。此外，在存在1μg背景DNA的情况下，未检测到抑制作用（参见图7）。

图7. HIV-2标准 gag 片段在1μg人类DNA存在的情况下。要排除背景人类DNA具有抑制作用是否进行qPCR是在1μgPM1细胞DNA的存在下进行的。 HIV-2 gag 基因数量（10 6 ，10 5 ，10 4 ）之间的线性回归分析，PM1细胞DNA存在的情况下，每个反应应分别复制10， 3 ，100、10和5个DNA副本）和Ct值。回归方程的计算公式为y = -3.305 + 38.692，R 2 = 0.999。红色框代表不含人DNA的标准品的Ct值。蓝色框代表存在PM1细胞DNA时的Ct值。
该方法在五次复制/反应时的灵敏度为100％（在14/14次运行中检测到，在SD为0.44的情况下为0.69 log 10 ），而在一次复制/反应（11/14次运行）中为78％。检测极限为1个拷贝/反应（11/14次运行），中值相关系数为0.999（范围：0.998-1.000），定量极限为5个拷贝/反应（CT 33）（SD：0.9）。中位数斜率为-3.15（范围：-3.00--3.37），中位数效率为97.0％（范围：98.4％至98.5％）。
通过使用Schwarz等人（2004）描述的公式计算LOD和LOQ。原病毒DNA的检出限为0.5拷贝/ 10 5 白细胞。
为排除该方法仅对HIV-2特异，对提取的U1（U937的亚克隆，已长期感染HIV-1）细胞进行qPCR（Folks et al。，1987）。）和阴性对照，例如从HIV阴性个体的全血中提取DNA和从HIV-1感染患者中提取DNA。由于没有HIV阴性样品，也没有HIV-1感染的样品都给出阳性结果，因此特异性为100％。

菜谱

完整的RPMI-1640培养基（使用前在37°C下预热）
RPMI-1640中号
2.0 mM L-谷氨酰胺
10％FBS（在56±2°C的水浴中加热失活30±2分钟，并在50 ml /离心管中分装，并在-20°C储存直至使用）
1％青霉素/链霉素溶液

致谢

这项工作得到瑞典医师反对艾滋病研究基金会和瑞典瑞典研究委员会的支持（PM编号321-2012-3274，MJ编号2016-02285），Crafoord基金会，Österlund基金会和EFOP-3.6的支持。 .3-VEKOP-16-2017-00009适用于ZsSz。
＆nbsp;我们感谢瑞典几内亚比绍队列研究（SWEGUB CORE）组的成员，其中包括：巴贝达·恩布纳，安东尼奥·比格，安苏·比埃，西迪亚·卡马拉，乔基姆·埃斯比约恩森，玛丽安·詹森，萨拉·卡尔森，雅各布·洛帕特科·林德曼，帕特里克·梅德斯特兰德， FredrikMånsson，Hans Norrgren，Angelica A.Palm，GülsenÖzkayaSahin和Zacarias Jose da Silva。
＆nbsp;通过NIHID，NIAID，NIH，AIDS司的NIH AIDS试剂计划获得了以下试剂：Marvin Reitz博士的PM1和Thomas Folks博士的HIV-1感染的U937细胞（U1）。

利益争夺

资助者在研究设计，数据收集和分析，发表决定或手稿准备中没有任何作用。作者没有利益冲突。

伦理

该研究得到了几内亚比绍国家健康伦理委员会的伦理委员会（Ref 038 / CNES / INASA / 2016）和瑞典隆德大学区域伦理审查委员会（Dnr 2016/426）的批准。所有参与者入选前均已收到有关该研究的信息，并提供了口头和书面知情同意。为确保机密性，所有研究数据均通过代码进行管理。

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