材料和试剂

50 ml无缘玻璃培养管（Borosil，目录号：9820U08）
手术刀10号刀片（Himedia，货号：LA76808）
油漆刷（Faber-Castell，尺寸2）
载玻片（Himedia，目录号：LA76808）和盖玻片（Himedia，目录号：GW064）
针（Himedia）
Kimwipes ®＆nbsp;
湿滤纸
牛油纸袋
小麦种子
双蒸馏水
2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物（cPTIO，Sigma-Aldrich，200 µM，目录号：C221）
二氨基荧光素-FM（DAF-FM，西格玛奥德里奇，目录号：D1821）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：RDD002）
硝酸钾（KNO 3 ）（Fischer Scientific，目录号：13655）
N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME，Sigma-Aldrich，目录号：N5751）
磷酸盐缓冲液200 mM pH 7.5
硝普钠（SNP，Sigma-Aldrich，目录号：BP453）
钨酸钠（钠钨酸盐，西格玛奥德里奇，目录号：14304）
NEDD（Sisco Research Laboratories Pvt。Ltd，目录号：61166）
正丙醇
磺酸铵（Sisco Research Laboratories Pvt。Ltd，目录号：62419）
HgCl 2 （Sisco Research Laboratories Pvt。Ltd，目录号：25699）
磺胺（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：19689）
铁-EDTA（Sisco研究实验室私人有限公司，目录号59389）
分析缓冲液（磷酸盐缓冲液，100 mM，pH 7.0）
L-精氨酸（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：66637）
MgCl 2 （Sisco Research Laboratories Pvt。Ltd，目录号：69396）
CaCl 2 （Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：70650）
BH 4 （（6R）-5,6,7,8-四氢生物蝶呤二盐酸盐，Sigma-Aldrich，100 µM，目录号：14304）
FAD（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：87939）
FMN（Sisco Research Laboratories Pvt。Ltd，目录号：57443）
DTT（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：84834）
PMSF（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：87606）
NADPH（Sisco Research Laboratories Pvt.Ltd，目录号：77268）
布拉德福德试剂（Genetix Biotech Asia Pvt。Ltd，目录号：E530-1L）
在0.1 N HCl中的0.25％HgCl 2
1 N HCl中的7％磺胺盐
100 µM硝普钠（在双蒸馏水中制备）
100 µM钨酸钠）（在双蒸馏水中制备）
0.1％NEDD（在双蒸馏水中制备）
0.5％磺酸铵（在双蒸馏水中制备）
0.2 mM NADPH（在双蒸馏水中制备）
无氮Hoagland解决方案（请参阅食谱）
NOS提取缓冲液（请参见配方）
S-亚硝基硫醇提取缓冲液（请参见配方）
pH 7.5的HEPES-KOH（请参见食谱）

设备

生长室（加拿大温尼伯，康维尔，型号：PGW 36，）
表玻璃（Himedia，货号：LA025）
研钵和研杵
荧光显微镜（Zeiss AXIOSKOP 2）
紫外线可见分光光度计（Analytik Jena，德国，型号：Specord Bio-200）
冷藏离心机（Sigma 3K30）
曝气泵
水浴

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
微软Excel
SPSS 10.0

程序

植物生长
1. 将小麦种子预先浸泡在衬有湿滤纸的陪替氏培养皿中，直至发芽5天。
2. 将制服的幼苗转移到50 ml的不含氮的Hoagland溶液的培养管中（配方1）。每3天补充一次Hoagland解决方案（图1）。整个实验在新德里的印度农业研究所（IARI）的国家植物保护区设施中的生长室中进行（型号PGW 36，加拿大温尼伯的Conviron）。
  生长状况：
  温度：25°C / 18°C（白天/晚上）
  光照时间：14小时N / 10小时D
  光子通量密度：500 µmol m -2 s -1 （PAR）
  相对湿度（RH）：90％
  CO 2 浓度：（i）作为环境CO 2 （AC）的400±50 µl / l
  ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp;（ii）750±50 µl / l，因为CO 2 （EC）升高
治疗方法
1. 转移10天后，按照表1中的说明为培养管补充不同的处理方法。每次处理应保持3次重复。
2. 用铝箔纸盖住试管的口，以免挥发性化学物质对附近的植物造成影响（图1）。硝普钠（SNP），NO的来源； cPTIO（一种有效的NO清除剂-NO，一氧化氮合酶的抑制剂）和Na-钨酸盐（一种NR的抑制剂）可用于了解No对调节NR活性的影响。 Adavi和Sathee（2019）中讨论了EC对SNP和抑制剂与NO定位和NR活性的影响的详细说明。
  
  表1.治疗细节
  
  图1.在50 ml培养管中生长的植物的代表性图像。每种处理均由三个试管组成，每个试管2个植物。
使用荧光显微镜可视化NO
1. 处理4小时后，收获植物。使用手术刀片将根尖切成约2毫米的小块。然后将根切片浸入表面玻璃中的Diaminofluorescein-FM染料（在20 mM HEPES-KOH中，pH 7.5的5 µM DAF-FM）中浸泡30分钟。 30分钟后，小心地取出根部，并用不含染料的HEPES-KOH缓冲液洗涤2-3次，直到去除多余的染料。
2. 借助油漆刷将根部小心地转移到载玻片中，并盖上玻璃盖。在Kim Wipes的帮助下，排干多余的缓冲液。
3. 在荧光显微镜（Zeiss AXIOSKOP 2）下以495 nm激发波长和515 nm发射波长可视化载玻片，并获取图像（图2）。
4. 使用基于Java的图像处理程序“ Image J”分析图像并计算相对荧光。
5. 使用“图像J”在图像上设置比例尺。
  
  图2.荧光显微镜下小麦根中一氧化氮的代表性图像
硝酸还原酶（NR）活性的估算
1. 遵循上述与植物生长和处理相同的步骤（过程A和B）。处理4小时后收获植物。
2. 通过估算细胞中存在的酶形成的亚硝酸盐来估算体内硝酸盐还原酶的活性，然后使用磺胺在酸性介质中重氮化亚硝酸盐，然后使用Klepper等人所述的方法将NEDD重氮化。 em>（1971），并由Nair和Abrol（1973）修改。使用Evans和Nason方法（1953）估算亚硝酸盐的量。
3. 收割植物并保存在贴有标签的黄油纸袋中，并放在冰上直至称重。将样品（叶和根）切成2毫米的小块，充分混合，重0.3克，加到冰冷的培养培养基中，该培养基分别含3毫升磷酸盐缓冲液（0.2 M，pH 7.5）和硝酸钾溶液（0.4 M）。为此，加入0.2毫升正丙醇。
4. 使用泵将样品真空渗透2分钟（80-85KPa），然后在黑暗条件下于30°C的水浴中孵育30分钟。
5. 孵育后，将试管置于水浴（70-80°C）中3-4分钟，以终止酶的活性并将亚硝酸盐完全浸出到培养基中。
6. 通过在试管中摄取适量的等分试样（0.2毫升）来估算产生的亚硝酸盐的量；向其中加入1 ml磺胺（1％HCl中的1％）。混合后，加入1 ml NEDD（0.02％），然后再次充分混合。立即形成粉红色，并在20分钟后用两次蒸馏水使总体积增加到3 ml。
7. 使用紫外可见分光光度计（Specord Bio-200型）在540 nm下测量吸光度。
8. 使用标准亚硝酸钾溶液准备校准曲线。
9. 以微摩尔亚硝酸盐g -1 DW h -1 表示酶活性。
一氧化氮合酶（NOS）活性的估计
1. 遵循上述与植物生长和处理相同的步骤（过程A和B）。处理4小时后收获植物。
2. 在预冷研钵和研杵的5 ml冷提取缓冲液中均质0.5 g组织（叶和根）样品。将匀浆液在4°C下以10,000 x g 离心15分钟（Hageman and Hucklesby，1971）。收集上清液以进行酶测定。按照Bradford方法（1976）确定上清液中的蛋白质含量。
3. 确定反应混合物中的NOS活性（Gonzalez等，2012），其中含有测定缓冲液（100 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0），1 mM L-精氨酸，2 mM MgCl 2 、0.3 mM CaCl 2 ，4μMBH 4 ，1μMFAD，1μMFMN，0.2 mM DTT，0.2 mM NADPH和100μl组织提取物。＆nbsp;
4. 观察由于在340 nm处使用NADPH而引起的吸光度变化1分钟。使用含有蒸馏水而不是酶提取物的反应混合物作为参考。在每种处理中，还保持了阳性对照与不含L-精氨酸的反应混合物的三份重复。使用NADPH的消光系数（ε= 6.22 mM -1 cm -1 ）计算NOS活性。
S-亚硝基硫醇的估计
1. S-亚硝基硫醇的形成是根据叶和根组织估计的（Arc et al。，2013）。所有步骤都需要在黑暗条件下执行。遵循上述与植物生长和处理相同的步骤（过程A和B）。
2. 在预冷研钵和研杵中的5 ml冷S-亚硝基硫醇提取缓冲液（配方3）中匀化0.5 g组织（叶和根）样品。将提取物在4°C下以13,800 x g 离心25分钟。
3. 将上清液与50 µl磺酸铵混合，并在室温下孵育2分钟。然后向反应混合物中分别加入0.3 ml磺胺，HgCl 2 和NEDD。将反应混合物在黑暗条件下于30°C保持20分钟。
4. 使用紫外可见分光光度计（Specord Bio-200型）在540 nm下测量吸光度。

数据分析

MS Excel用于计算以及绘制图形。最小显着差异（LSD为0.05％）和使用Duncan多范围测试的平均分离度由SPSS 10.0计算。暴露于EC条件下的植物以NOS依赖的方式表现出更高的NO积累，进一步的细节在Adavi和Sathee（2019）中进行了描述。

笔记

应注意避免DAF-FM染料暴露在光线下，因为该染料对光敏感，并可能导致自氧化和假荧光。
培养管口应适当地用棉和铝箔覆盖，以避免挥发性化学物质对附近植物的影响。
清洗或转移到载玻片上时，应小心避免损坏根部。
在测量NR时，应正确清洁玻璃器皿，用蒸馏水冲洗并风干，以免出现假色。

菜谱

无氮Hoagland解决方案
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：600px;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”> <身体>宏营养素
摩尔（M）
数量（溶液的毫升/升）
K 2 SO 4
0.5
3.5
MgSO 4 ·7H 2 O
1.0
2
CaCl 2
1.0
2
KH 2 PO 4
1
1
微量营养素
数量（溶液的g / L）

H 3 BO 3
2.86

MnCl 2 ·4H 2 O
1.81

ZnSO 4 ·7H 2 O
0.22

CuSO 4 ·5H 2 O
0.08

Na 2 MoO 4 ·2H 2 O
0.02

在微量营养素溶液中加入微量营养素溶液和0.5％的铁-EDTA溶液（各1毫升），并在使用前将pH值调节至6.5。
NOS提取缓冲液
Tris-HCl缓冲液，50 mM pH 7.5
10毫米MgCl 2
1毫米DTT
1毫米PMSF
S-亚硝基硫醇提取缓冲液
25 mM HEPES-NaOH
1 mM EDTA，pH 7.8
pH 7.5的HEPES-KOH
在双蒸馏水中制备20 mM HEPES，并用KOH将pH调节至7.5

致谢

该方案改编自Adavi和Sathee（2019）和我们的其他研究（未发表）。这项研究得到了ICAR印度农业研究所的支持（研究所项目-CRSCIARISIL20144047279）。 SAB和BKP感谢在研究过程中获得ICAR初级研究金的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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