材料和试剂

生物危害废物容器（塔森，目录号：583254）
细胞培养皿，100 x 20 mm（Eppendorf，目录号：0030702115）
T25烧瓶（Eppendorf，货号：0030710118）
FACS管（康宁，目录号：352063）
带刻度的离心管，15 ml（Tarsons，目录号：546021）
带刻度的离心管50 ml（Tarsons，目录号：546041）
刻度0.2-10μl微尖端（Tarsons，目录号：521000）
2-200μl刻度微尖（Tarsons，目录号：521010）
刻度200-1000μl微型吸头（Tarsons，目录号：521020）
血清玻璃移液器，10 ml（Himedia，目录号：CG316-1x10NO）
无菌过滤单元（0.22μm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：450-0020）
储存小瓶，5毫升（Tarsons，货号：523070）
MDA-MB-231乳腺癌细胞系（NCCS，Pune）
10x胰蛋白酶（2.5％）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15090-046）
抗Smad1（pS463 / pS465）/ Smad8（pS465 / pS467）PE共轭抗体（BD Biosciences，目录号：562509）
牛血清白蛋白（BSA）（Himedia，目录号：MB083-5G）
去离子水（dH 2 O）（Merck，Elix 2型纯净水）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Merck，目录号：61755005001046）
具有L-谷氨酰胺培养基（DMEM-HG）的DMEM高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D5648-1L）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10270）
甲醛溶液37-41％（w / v）（默克，目录号：61780805001730）
盐酸35％（HCl）（默克，目录号：61762505001730）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-250ML）
LDN193189盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：SML0559-5MG）
甲醇（默克，目录号：82228305031730）
氯化钾（KCl）（默克（Merck），目录号：61779205001730）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Merck，目录号：60487305001730）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钠（NaCl）（默克，目录号：1.93206.0521）
氢氧化钠（Merck，目录号：61843805001730）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
100x青霉素（10,000单位/毫升）-链霉素（10,000单位/毫升）抗生素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122）
DMEM介质（请参阅食谱）
PBS（请参阅食谱）
1x胰蛋白酶（请参阅食谱）
热灭活的FBS（请参阅食谱）
0.4％的台盼蓝（请参阅食谱）
4％甲醛溶液（请参阅食谱）
染色缓冲液（请参见配方）
LDN193189盐酸盐库存（请参阅食谱）

设备

血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629-1EA）
分析天平（Sartorius，Quintix分析天平60，120 g x 0.01，0.1 mg）
高压灭菌器*
II级生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，型号：1300系列A2）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Sorvall Legend X1R离心机，目录号：75004260）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，Hera Cell 150i）
流式细胞仪（Becton Dickinson，FACS calibur和BD细胞搜寻软件）
倒置显微镜带相机（Zeiss，Axio Vert A1）
涡旋混合器（IKA，型号：MS-3D）
微量移液器（Thermo Fisher Scientific，Finnpipette F2–10μl，100μl和1,000μl）
移液器控制器（Socorex，Profiller 446）
磁力搅拌器（Tarsons，目录号：6090）
4°C冰箱*
-20°C冰箱*
*注意：这些物品可以从任何合格的公司订购。
-80°C冰箱（Thermo Fisher Scientific，FORMA 88000系列）
水浴（Thermo Fisher Scientific，Labline水浴）

软件

FlowJo软件（FlowJo，LLC）

程序

对于本研究，MDA-MB-231乳腺癌细胞系购自国家细胞科学中心（NCCS，印度浦那）。将细胞在维持在5％CO 2 和37°C的CO 2 培养箱中的细胞生长培养基（配方1）中进行培养。
注意：请从公认的电池中心购买电池，并按照供应商提供的说明进行维护。

电池维护
注意：以下步骤应按照无菌培养技术在II级生物安全柜内进行。
一旦细胞达到80％-90％的融合度，请按以下步骤传代培养：
1. 吸出用过的培养基，并将其收集在无菌的15 ml离心管中。
2. 用1x PBS洗涤两次（配方2）。
3. 向细胞中加入500μl1x胰蛋白酶（配方3），并在37°C下孵育2-3分钟。
  1. 从4°C取出后，胰蛋白酶在室温下保持5-10分钟，然后再使用。
  2. 推荐的胰蛋白酶量适用于60毫米培养皿或T25烧瓶。对于较大的表面积，请相应地调整胰蛋白酶的使用量。
4. 沿碟子的侧面轻轻拍打以移出细胞。不要将细胞留在胰蛋白酶中超过5分钟。
5. 加入1-2 ml用过的培养基以中和胰蛋白酶的作用，并将细胞收集在标记的15 ml离心管中。
6. 在4°C下以300 x g 离心细胞5分钟，以获得细胞沉淀。丢弃上清液，然后将沉淀重悬于1 ml新鲜生长培养基中。
7. 适当地重悬细胞，取出少量细胞（50μl）进行计数。
8. 加入等体积的0.4％锥虫蓝（配方5），使用血球计数器混合并计数活细胞。
9. 在10毫升生长培养基中以5,000个细胞/ cm 2 的密度在100毫米培养皿中接种细胞。让细胞贴壁过夜。
  注意：建议将接种密度用于MDA-MB-231细胞系。根据所用细胞的生长速度，种子细胞的密度应至少为收集实验细胞时的1 x 106个细胞。
10. 24小时后，在显微镜下检查细胞是否存在污染，添加刺激剂/药物/分子以达到所需的浓度进行处理，然后将细胞在CO 2 培养箱中于200℃下培养所需的时间。 37℃。
  注：为进行当前分析，将细胞用1μMLDN193189次氯酸盐（配方8）处理24小时。
细胞收获
注意：
1. 在开始实验之前，请仔细阅读整个操作流程，并确保所有必需材料的可用性以及水浴温度已达到37°C。
2. 在37°C下预热PBS 30分钟，在37°C前预热胰蛋白酶不超过2-3分钟。
3. 细胞的温度应保持在37°C，直到固定步骤完成为止，因为温度波动会导致磷酸蛋白的去磷酸化。
4. 请在37°C水浴中执行以下步骤，但不要在恒温箱中执行以下步骤，以确保在此过程中保持均匀的温度。
5. 小心处理碟子，以免碟子被水浴中的水污染。
1. 从CO 2 培养箱中取出细胞，直接倒入有生物危害性的废物容器中，立即丢弃培养基，然后将培养皿置于37°C水浴中。
2. 沿培养皿壁添加10 ml预热的1x PBS，轻轻摇动培养皿以完全洗去生长培养基。
3. 丢弃PBS，并轻轻擦拭纸巾在3-4秒钟，以除去所有剩余的PBS。
4. 立即将培养皿放入水浴中，然后加入900μl预热的1x胰蛋白酶（请参阅食谱）。轻轻旋转培养皿，以确保胰蛋白酶均匀分布。根据细胞类型孵育1-3分钟。
  注意：此步骤中推荐的胰蛋白酶量适用于100毫米培养皿。根据用于实验的培养皿的大小调整音量。
5. 轻轻拍打侧面的盘子，以确保细胞正确分离。胰蛋白酶消化后可观察到轻微的浑浊。
6. 直接向培养皿中加入100μl预热的FBS，以中和胰蛋白酶的作用，并通过移液进行混合。
注意：步骤B2-B6应该在水浴中执行。
细胞固定
注意：
1. 在室温下执行步骤C2-C4。
2. 某些磷蛋白和/或抗体可能需要不同的固定缓冲液，用户应在继续进行细胞固定之前与制造商联系。
1. 将1 ml 4％甲醛（配方6）直接添加到细胞中，通过移液3-4次使其充分混合，然后将细胞悬浮液转移到FACS管中。
  注意：按照上述相同的步骤，也可以使用4％的低聚甲醛代替4％的甲醛进行固定。
2. 在2500 rpm下涡旋细胞悬液约10-15 s，并在室温下孵育10分钟。
3. 向细胞悬液中加入2 ml染色缓冲液（配方7），并在4°C下以500 x g 离心5分钟。丢弃上清液，不要干扰沉淀。
4. 通过将沉淀重悬于2 ml冰冷的1x PBS中来洗涤细胞。在4°C下以500 x g 离心5分钟，并弃去上清液。
细胞通透性
1. 在以2500 rpm的速度涡旋的同时，向细胞沉淀滴加冰冷的100％甲醇（1 ml用于1 x 10 6 细胞）。
  注意：在开始实验之前，将100％甲醇在冰上放置2小时，或者在-20°C下过夜。
2. 加入甲醇后，盖上盖子以防止甲醇流失，并在4°C下孵育至少1 h（图1）。
注意：
1. 加入甲醇后，细胞可以在-20°C下保存一周。
2. 尽管大多数磷蛋白和抗体都可以与甲醇介导的通透性很好地协同工作，但某些磷蛋白和/或抗体可能需要不同的通透性缓冲液，但用户应在进一步操作之前与制造商联系。
图1.描述用于磷酸化蛋白染色的样品处理的程序
磷酸蛋白染色和流式细胞仪分析
1. 在甲醇中向细胞中加入4 ml染色缓冲液，在4°C下以500 x g 离心5分钟，并轻轻弃去上清液，而不会干扰细胞沉淀。
2. 将细胞沉淀重悬于2 ml染色缓冲液中。在4°C下以500 x g 离心5分钟，弃去上清液。
3. 将沉淀重悬于100μl染色缓冲液中，并在每个FACS管中分配50μl细胞悬液以进一步染色。
  注意：确保每管至少有5 x 10 5 细胞用于磷酸蛋白的进一步染色。
4. 根据生产商的说明，向其中一个管中添加磷酸特异性的初级未结合或荧光结合的抗体至细胞，并向另一管中添加同种型对照。
5. 轻轻将悬浮液涡旋10秒钟，然后在黑暗中于室温下孵育1小时。
6. 加入2 ml染色缓冲液，在4°C下以500 x g 离心5分钟，并小心弃去上清液。
7. 如果在步骤E4中使用了荧光偶联抗体，则直接进行步骤E9。如果使用未偶联的一抗，则将细胞沉淀重悬于50μl染色缓冲液中。加入荧光染料偶联的二抗，在室温下于黑暗中孵育1小时。
8. 加入2 ml染色缓冲液，在4°C下以500 x g 离心5分钟，并小心弃去上清液。
9. 将沉淀重悬于300μl染色缓冲液中，并置于冰上。
10. 使用适当的荧光检测通道设置，在流式细胞仪中分析样品（图2）。
  注意：确保荧光团偶联抗体的激发和发射波长与所使用的流式细胞仪兼容。
  
  图2。磷酸-SMAD1 / 8的流式细胞仪分析。用PE偶联的抗Smad1（pS463 / pS465）/ Smad8（pS465 / pS467）抗体（Phospho- SMAD1 / 8）。细胞未经处理（对照）或用BMP抑制剂LDN193189（抑制剂处理）处理。橙色线是对照细胞的未染色对照，浅蓝色线是抑制剂处理的细胞的未染色对照。

数据分析

使用FlowJo软件分析磷蛋白染色的流式细胞仪数据。通过在FSC对SSC图中选通以去除细胞碎片来选择细胞群。绘制直方图以显示同种型/未染色对照与染色样品之间以及处理与未处理条件之间的差异。该协议显示了一种磷酸蛋白的代表性数据，不包括任何统计分析。

笔记

重要的是使用经过流式细胞仪检测的抗体，并且仅检测目标蛋白的磷酸形式。

菜谱

DMEM介质
DMEM-HG（高葡萄糖）基础培养基：
10克DMEM-HG培养基粉末
3.7克碳酸氢钠
10毫升100x青霉素-链霉素抗生素溶液
用高压灭菌的去离子水将体积补足至1 L
用5 M HCl将pH调整至〜7.0，因为过滤后pH趋于增加
使用无菌过滤单元（0.22μm）过滤灭菌
可以在4°C下保存长达2个月的时间
细胞生长培养基：
DMEM-HG基础培养基中的10％FBS
使用无菌过滤单元（0.22μm）过滤灭菌
储存在4°C并在两周内使用
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
10倍PBS：
80克NaCl
2克KCl
14.4克Na 2 HPO 4
2.4克KH 2 PO 4
将所有盐加入800毫升高压灭菌的去离子dH 2 O中，并在室温下使用磁力搅拌器搅拌1小时
用去离子水补足至1 L
使用无菌过滤单元（0.22μm）过滤灭菌
室温保存
1x PBS：
在H 2 O
中将10x PBS稀释十倍（每10毫升中1毫升）用5 M NaOH将pH调节至7.4，并在121°C高压灭菌20分钟
1x胰蛋白酶（0.25％）
1毫升10x胰蛋白酶
9毫升无菌PBS
准备5毫升等分试样以供使用
将等分试样存储在-20°C以便长期存储
在室温下解冻，并在4°C下储存，可短期使用长达1周\
热灭活的FBS
通过在水浴中于56°C孵育1 h来热灭活FBS，然后以50 ml等分试样的形式储存在-20°C下
0.4％台盼蓝
0.04克的锥虫蓝（染料组成40％）
10毫升1x PBS
使用无菌过滤装置（0.22μm）过滤
将等分试样存储在4°C以便长期存储
4％甲醛溶液
在1x PBS中将37％-41％甲醛溶液稀释10次
1毫升的37％-41％甲醛溶液
9毫升1x PBS
颠倒4-5次使其充分混合
使用前立即准备
保持室温
染色缓冲液
0.5克BSA
100毫升1x PBS
搅拌溶解
储存于4°C长达1周
LDN193189盐酸盐原液
将5 mg溶于1.23 ml的DMSO中以获得10 mM的储备液
分别以20μl的等分试样形式储存在-20°C下
使用前在冰上解冻

致谢

这项工作得到了印度政府医学研究理事会（ICMR）的资助。印度政府和科学技术部（DST）。印度。 RS和AS由政府人力资源与发展部（MHRD）的研究金支持。印度。该协议改编自Kumar et al。（2017和2018）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Alonso，A.，Sasin，J.，Bottini，N.，Friedberg，I.，Friedberg，I.，Osterman，A.，Godzik，A.，Hunter，T.，Dixon，J.和Mustelin，T.（ 2004）。人类基因组中的蛋白质酪氨酸磷酸酶。细胞 117 （6）：699-711。
Ardito，F.，Giuliani，M.，Perrone，D.，Troiano，G.和Muzio，L.L.（2017）。蛋白质磷酸化在细胞信号传导中的关键作用及其作为靶向治疗的作用。国际分子医学杂志 40（2）：271-280。
Davies，R.，Vogelsang，P.，Jonsson，R.和Appel，S.（2016年）。一种优化的多重流式细胞术方案，用于分析外周血单个核细胞中的细胞内信号传导。 J Immunol Methods 436：58-63。
Delom，F.和Chevet，E.（2006）。磷酸蛋白分析：从蛋白质到蛋白质组。 Proteome Sci 4：15。
Guy，G. R.，Philip，R.和Tan，Y.H.（1994）。通过二维凝胶电泳分析细胞磷蛋白：在正常细胞和癌细胞中用于细胞信号转导的应用。电泳 15（3-4）：417-440。
Hunter，T。（1995）。蛋白激酶和磷酸酶：蛋白质磷酸化和信号传导的阴阳。 Cell 80（2）：225-236。
Junger，M.A. and Aebersold，R.（2014年）。质谱驱动的磷酸化蛋白质组学：图案化系统生物学镶嵌图。 Wiley Interdiscip Rev Biol 3（1）：83-112。
Krutzik，P.O。，爱尔兰人，J.M.，Nolan，G.P。和Perez，O.D。（2004）。通过流式细胞术分析蛋白质磷酸化和细胞信号转导事件：技术和临床应用。 Clin Immunol 110（3）：206-221。
Krutzik，P.O.和Nolan，G.P.（2003）。用于流式细胞术的细胞内磷酸化蛋白染色技术：监测单细胞信号事件。 Cytometry A 55（2）：61-70。
Kumar，A.，Anand，T.，Bhattacharyya，J.，Sharma，A.和Jaganathan，B.G.（2018）。 K562慢性髓细胞白血病细胞可改变骨髓基质细胞的成骨分化和基因表达。 J细胞通信信号 12（2）：441-450。
Kumar，A.，Bhattacharyya，J.和Jaganathan，B.G.（2017）。对基质细胞的粘附通过ERK和BMP信号通路介导了慢性粒细胞白血病的伊马替尼耐药性 Sci Rep。 7：9535。
Manning，G.，Whyte，D. B.，Martinez，R.，Hunter，T. and Sudarsanam，S.（2002）。人类基因组的蛋白激酶补体。科学 298（5600）：1912-1934。
Pan，L.，Wang，L.，Hsu，C.C.，Zhang，J.，Iliuk，A. and Tao，W.A.（2015）。复杂蛋白质样品中总蛋白质磷酸化水平的灵敏测量。 Analyst 140（10）：3390-3396。
Roskoski，R.（2015年）。蛋白激酶及其靶向小分子抑制剂的历史概述。 Pharmacol Res。 100：1-23。
Sonowal，H.，Kumar，A.，Bhattacharyya，J.，Gogoi，P.K.和Jaganathan，B.G.（2013）。肌动蛋白聚合的抑制作用通过p38 MAPK途径降低了间充质干细胞的成骨分化。 J Biomed Sci 20：71。
Steen，H.，Jebanathirajah，J.A.，Rush，J.，Morrice，N.和Kirschner，M.W.（2006）。通过质谱进行磷酸化分析：神话，事实以及定性和定量测量的后果。分子细胞蛋白质组学 5（1）：172-181。
Venter，J.C。（2001）。人类基因组序列（第292卷，第1304页，2001年）。科学 292（5523）：1838-1838。