材料和试剂

薄纸
实验小鼠（例如，C57BL / 6J和CD1雄性小鼠，年龄12-16周，查尔斯河实验室）
陌生小鼠（STR小鼠）（例如，3-4周龄的未成年雄性（出生后第21至28天），雄性C57BL / 6J小鼠，查尔斯河实验室（Charles River Laboratory）
30％乙醇（v / v）

设备

Vsoc-迷宫
我们使用了V型迷宫的改良版（Busquets-Garcia等，2011）（Vsoc-迷宫，图1）。它由两种结构组成：由黑色有机玻璃制成的迷宫壁（高150毫米）（宽度为6毫米）和由透明有机玻璃制成的迷宫盖。 Vsoc迷宫中的走廊长300毫米，宽45毫米（内部措施）。将盖子插入Vsoc迷宫时，在走廊的末端创建了两个小室（长82毫米）。这些小室用于分配少年陌生小鼠。该设计刻意简单，可以增强分析中的实验小鼠的探索性活动，并便于动物的处理和会话之间的清洁。
三室仪器
它由一个由有机玻璃制成的矩形盒子（宽405毫米x长600毫米x高150毫米）分成三个相同的腔室（宽405毫米x长200毫米x 150毫米高），由两个带有小开口的有机玻璃墙分开，尺寸为100毫米宽x 50毫米高，可让鼠标进入各腔室之间，如先前所述（Kaidanovich-Beilin等人，2011年）。将少年陌生小鼠封闭在侧室的圆形铁丝笼中。线笼的高度为110毫米x直径为105毫米，并具有间隔为10毫米的垂直杆，可以进行嗅探和探查。铁笼上有一个加重的杯子，以防止实验动物攀爬。
摄像机（例如，Sony Handycam便携式摄像机，HDR-CX240）
秒表（x2）（例如，Sper Scientific，810029）

图1. Vsoc迷宫的设计。 Vsoc迷宫的顶视图（A和C）和侧视图（B和D）以及有机玻璃透明盖，显示了其使用的尺寸（以毫米为单位）在Martínez-Navarro等人。（2019）。照片显示了带有透明盖的Vsoc迷宫（C），以及盖的细节，其中包括有机玻璃棒，可与小鼠互动（D）。

视频1.测试中的Vsoc迷宫设置和鼠标处理

软件

STATISTICA（StatSoft）软件，用于执行统计分析
GraphPad Prism软件（美国GraphPad Software）用于艺术品

程序

迷宫（Vsoc迷宫和三室仪器）用于声音衰减为4-7 lux的隔音房间。迷宫顶部的数码相机用于记录会话。观察者可以通过位于迷宫顶部的闭路摄像机获得连续房间中的在线图像。社会测试的所有三个阶段（习惯性，社交性和对社会新颖性的偏好）均连续进行（图2）。 Vsoc-迷宫阶段持续了5分钟，因为据描述，在互动的前五分钟中，大多数社交行为都发生了（Nadler等人，2004）。在三室仪器中的训练通常持续10分钟（Kaidanovich-Beilin等，2011）。为了进行比较，在三腔仪器中的探索行为是在5分钟（图3）和10分钟（图4）时计算的。
所有小鼠每笼饲养四只，并在温度（21°C±1°C）和湿度（55％±10％）的标准环境条件下自由进食和饮水。所有实验都是在暗/亮周期的亮相期间进行的（上午8点开灯，晚上8点关灯）。在开始实验之前，将小鼠在实验室中习性并处理1周。

图2.社会新颖性测验的社交性和偏好方案（Martínez-Navarro等人，2019年）。有三个不同的阶段：第一阶段（习惯化），第二阶段（社交性）和第三阶段（偏好社会新颖性）。每个阶段持续5分钟。在这段时间中，在三个阶段记录了对实验小鼠对走廊尽头的实验室的探索：两个腔室都是空的（第一阶段），陌生人-1（STR 1）与空腔（第二阶段）和陌生人-1（STR 1）与陌生人2（STR 2）（阶段III）。

居住课程（第一阶段）
习惯性训练使小鼠可以自由探索和熟悉Vsoc迷宫。
1. 要记录整个实验，请打开视频记录系统。
2. 通过将Vsoc迷宫提起以放置实验鼠标，使腔室在起点（两个手臂之间的交叉点）为空。
3. 让实验老鼠探索迷宫5分钟。
4. 在这段时间内，使用两个秒表并分配每个秒表来计数每个腔室的探测时间。然后，通过闭路摄像机获得的图像测量每个腔室的探测时间。
5. 在会议结束时，记录探索每个空房间的时间。
注意：
1. 不必关闭视频记录和/或数据采集系统。无需将实验鼠标从Vsoc迷宫中移出。
2. 尽管根据我们的经验，这不是必需的，但可以包括一个试验期，在试验期中，习惯性将实验小鼠从Vsoc迷宫中取出。在审判间隔期间，将陌生人1（STR 1）放置在密室中（请参见社交阶段II）。执行此试用期可能会避免实验老鼠在Vsoc迷宫内部时对迷宫的操纵。此外，它还可以清洁Vsoc迷宫中的任何尿液或排便物，这可能会在该程序的下一个阶段影响实验小鼠的探索行为。
社交会议（第二阶段）
社交会话是在习惯会话之后进行的。
1. 将指定为（STR 1）的幼鼠放在一个走廊的尽头的一个小房间中（在实验过程中两个走廊都是交替的）。在放置小室的盖子之前，将鼠标从迷宫的顶部放入小室中。
2. 社交活动持续5分钟。
3. 使用秒表来计算实验鼠标在每个小室中花费的时间。与空的腔室相比，花费更多时间探索带有STR 1的腔室的偏好应该是显而易见的。在所有实验中，将此幼年小鼠用作STR 1。
4. 在社交会议结束时，记录两个房间的勘探时间。将实验鼠标和STR 1保持在Vsoc迷宫中，然后开始测试的最后阶段。
注意：
1. 可以包括第二阶段和第三阶段之间的试用期，在此期间，将实验小鼠从Vsoc-迷宫中移出。
2. 或者，在将STR 2引入之前由STR 1占据的腔室之前，可以将STR 1更改为先前为空的腔室。下一个阶段归因于社会新颖性偏好而不是空间新颖性（先前空房间中的新STR 2）。
3. 另外，在可以研究社会习惯-不习惯行为的情况下，第二阶段可以延长5分钟以上。实验小鼠可能会随着II期的进行而减少探索STR 1的兴趣，如其他地方所示（Hitti和Siegelbaum，2014）。通过延长第二阶段的运行时间，可以揭示探索时间与会话时间的关系。
偏好社会新颖性会议（第三阶段）
对社交新颖性会话的偏好是在社交会话之后立即执行的。
1. 测试时间为5分钟。
2. 第二只被指定为陌生人2（STR 2）的新颖鼠标从上一个先前的空房间内放到顶部，而STR 1则留在同一房间内。在测试期间，允许实验鼠标探索所有设备。在所有实验中，将此幼年小鼠用作STR 2。
3. 使用秒表来计算实验鼠标在每个小室中花费的时间。与STR 1相比，与STR 1相比，更喜欢花更多的时间使用STR 2（这是一种新颖的鼠标）探索小室。
测试后清洁
1. 抬起整个迷宫，从设备中取出实验小鼠和陌生小鼠，然后将它们放回自己的笼子里。
2. 用30％（体积/体积）的乙醇清洁迷宫，以免产生嗅觉提示。
3. 如有必要，请与另一只动物进行测试（返回到“习性”阶段[步骤1]的步骤2）。
4. 整个实验的数据采集完成后，导出实验数据并分析结果（请参阅数据分析）。

注：我们比较了使用近交和近交小鼠品系（分别为C57BL / 6J和CD1小鼠）在Vsoc-迷宫和三腔室装置中的探索时间。为了比较迷宫之间的时间效率，在Vsoc迷宫（图3）中分析了两种菌株，在三腔迷宫中分析了5分钟（图3）和10分钟（图4）。 Vsoc迷宫设置在两种菌株的适应化阶段（第一阶段）中提供了非常相似的结果（图3A和3B）。对于三腔迷宫中的CD1小鼠，这些结果是可变的（图3B）。在社交阶段（阶段II），与空腔相比，两种小鼠品系均显示出对包含幼年STR 1的腔的明显偏爱（P ＜0.001）。在迷宫中，在5分钟内（图3C和3D），对于三腔室装置，在10分钟内，这种偏好就很明显（图4）。最后，在5分钟的评估社会新颖性偏好的会议上（第三阶段），只有在Vsoc迷宫中分析的小鼠（与它们的品系无关）显示出显着的偏爱（P <0.001），以探索新的不熟悉的幼年小鼠（STR 2）与现在熟悉的鼠标（STR 1）相比（图3E和3F以及图4）。 C57BL / 6J小鼠花了更长的时间才能在三腔迷宫中表现出对社交新颖性的明显偏好，因为这种偏好仅在10分钟后才显现出来（图3E和图4A）。另外，结果也可以使用社交指标来表示（图5）。

图3.使用三室仪器和Vsoc-迷宫比较两条小鼠品系的社会行为。 C57BL / 6J（AC）和CD1（DF）小鼠在三个阶段的探索时间本实验。在第一阶段（A和D）中，探索空舱的时间。在第二阶段（B和E）期间探索空房间或STR 1所花费的时间。在阶段III（C和F）中花费时间探索STR 1或STR 2。三腔C57BL / 6J，n = 6; CD1，n = 7； Vsoc迷宫C57BL / 6J，n = 8; CD1，n = 8）。数据表示为平均值±s.e.m.统计显着性是通过学生的 t 检验计算的。 * P ＆lt; 0.05； * P ＆lt; 0.01; *** P ＆lt; 0.001（腔室比较）。

图4.执行三室社交测试10分钟的总探索时间。在十室三室社交测试中，C57BL / 6J小鼠（A）和CD1小鼠（B）的探索行为每个阶段的分钟数。数据表示为平均值±S.E.M.统计显着性是通过学生的 t 检验计算的。 ** P ＆lt; 0.01; *** P ＆lt; 0.001（腔室比较）。

图5.在实验的三个阶段中，C57BL / 6J和CD1小鼠的鉴别指数。在第一阶段（A和D）中，空室的鉴别指数。在阶段II（B和E）中，空腔室或STR 1之间的区分指数。第二阶段（C和F）期间STR1或STR 2之间的区分指数。三腔C57BL / 6J，n = 6; CD1，n = 7； Vsoc迷宫C57BL / 6J，n = 8; CD1，n = 8）。区分指数的计算方法是：探索新刺激所花费的时间减去探索熟悉刺激所花费的时间除以总探索时间所得到的差。数据表示为平均值±s.e.m.

数据分析

当实验老鼠的四只爪子全部放在地板上，将鼻子靠近走廊尽头的竖线（Yang et al ）时，便考虑了探索时间。 2011）。爬山时的嗅探不算作探索时间。
在每个阶段中，都要计算探索两个房间的时间（无论它们是空的还是抱着一只幼小的陌生老鼠）。
探索密室或陌生老鼠的动物＆lt;在任何5分钟的会话中3 s排除在后续分析之外。
探索两个会议厅所花费的平均时间用于执行学生的 t 测试分析。所有结果均表示为平均值±S.E.M.当显着性水平小于0.05时，比较被认为具有统计学意义。使用STATISTICA（StatSoft）软件执行统计分析。

笔记

动物不会探索具有非常低的总探索时间（＜3 s）的腔室或陌生小鼠。可能有不同的原因：
1. 动物在习惯化过程中不会探索迷宫：从分析中排除这只老鼠。
2. 陌生鼠标不足以进行测试，例如，因为它表现出过度活跃的行为。在这种情况下，实验不考虑使用陌生鼠标，而是将其替换为其他鼠标。
3. 经过药物治疗或基因操作后，小鼠无法探索迷宫。治疗或遗传背景可能会改变运动活动。您可以更改治疗时间或使用其他测试。
对照动物没有表现出良好的社交行为，并且喜欢探索一只陌生的老鼠。解决方案可以是考虑更换陌生鼠标是否方便。
结果不可重现。这可能是由于实验室内存在气味提示或任何其他类型的压力源。在每次接触动物之间必须正确清洁迷宫，并且必须控制测试过程中的实验条件。

致谢

这项工作得到了西班牙经济与竞争部长（MINECO）的支持[A.O.的＃BFU2015-68568-P，R.M。的＃SAF2017-84060-R-AEI / FEDER-UE]；欧洲委员会[NeuroPain，R.M。的＃FP7-HEALTH-F2-2013-602891]；西班牙萨洛德卡洛斯三世研究所[R.M.＃RD16 / 0017/0020]；西班牙部长萨洛德[＃PNSD-2017I068 to R.M.]的西班牙语“ Nasoional Sobre Drogas计划”；加泰罗尼亚将军[2017SGR-669授予R.M.，ICREAAcadèmia2015至R.M.，ICREAAcadèmia2016至A.O.];由MINECO资助的“玛丽亚·德·马埃斯图大学”（＃MDM-2014-0370）； PLAN E（西班牙经济计划和经济发展计划西班牙计划）； FEDER的资金也得到认可。
＆nbsp; S.M-T。是西班牙加泰罗尼亚大将军的博士前研究金的获得者[FI-B00531 2016]。 M.G.G.得到了FRAXA研究基金会的博士前研究金的支持。 A.N-R得到了博士前研究金的支持（西班牙部长教育和文化部长）。
＆nbsp;我们感谢FranciscoPorrón和Dulce Real提供的专家技术支持，以及神经药理学实验室-NeuroPhar的有益讨论。
＆nbsp; Martínez-Navarro等人以前曾使用过所描述的方法。（2019）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均遵循ARRIVE（研究中的动物：体内实验报告）（Kilkenny等人，2010年）准则和标准的道德准则（欧洲共同体指令2010/63 / EU）并得到批准当地的道德委员会（ComitèÈticd'ExperimentacióAnimal-Parc de RecercaBiomèdicade Barcelona，CEEA-PRBB）。

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