材料和试剂

1.8毫升冷冻瓶管（赛默飞世尔科学公司，赛默科学公司TM，目录号：343958）
3.5毫升冷冻瓶管（赛默飞世尔科学公司，赛默科学公司TM，目录号：343958）
15ml锥形管（康宁，目录号：430790）
400-600微升锂肝素管（bd.microtainer？产品目录号：365985）
1毫升无菌注射器（NIPro医疗公司，产品目录号：JD+01D2238）
10 cc bd luer loktm一次性注射器（Thermo Fisher Scientific，目录号：bd 309604）
15毫升FalconTM锥形离心管（赛默飞世尔科学公司，目录号：14-959-53A）
10毫升和25毫升FisherbrandTM无菌聚苯乙烯一次性血清学吸管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-676-10F和13-676-10M）
22号针（bdtm针1，bd，目录号：305155）
26号x 3/4“小鼠和大鼠尾静脉单项目IV导管（帕特森兽医，目录号：07-836-8403）
副膜tmm pm996通用实验室膜
200微升和1000微升Tipone无菌过滤吸管头（美国科学，目录号：1120-8810和1122-1830）
0.2μm Nalgene？瓶顶无菌过滤装置（Sigma-Aldrich，目录号：Z370576-12EA）
4-8周龄雄性脾切除术nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl>/szj（nsgtm）免疫缺陷小鼠（杰克逊实验室，库存编号：005557）
第二天装运的标准ACD抗凝剂溶液中的10毫升人类全血（Zen Bio，Inc，SER-WB10毫升-SDS）
1毫升2-脱氧-2-（18f）氟-d-葡萄糖（18f-fdg），细胞标记时比活性至少校准为20毫居里/毫升（美国药典（USP）级，基本健康核药房）
0.9%氯化钠注射液USP，100毫升，加入150毫升PAB？（B.Braun，NDC编号：00264-1800-32）
250毫升一瓶等速（异氟醚）溶液（Henry Schein动物健康，目录号：029405）
无菌去离子水
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-1kg）
KCL（Sigma-Aldrich，产品编号：P9333-1kg）
K2EDTA二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：03660-1kg）
肝素钠（Sigma-Aldrich，目录号：375095-100KU）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液，pH值7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
过滤灭菌100毫升5x EDTA溶液（见配方）
100ml 1x EDTA溶液（见配方）
1单位/ml肝素PBS溶液（见配方）

设备

Inveon PET/CT（西门子医疗公司，Inven，目录号：138757）
离心机5810R（Eppendorf，产品目录号：108308）
离心机5810 R（Eppendorf，目录号：119548）
200微升单通道手动移液器
1000微升单通道手动移液器
AtomLabTM500剂量校准器（Biodex医疗系统公司）
组织培养箱（三洋科技，目录号：133060）
生物安全柜（Baker公司，消毒池，目录号：101951）
旋转平台（Labnet International，Inc Gyromini）
血糖测试条（TrueTrack来自@Nitro Diagnostics TM（SN 7688648），代码4698，批号RS4698）
Biovet？（M2M成像）生理监测和加热系统（M2M成像公司，美国）http://www.m2m imaging.com/“target=”blank“>http://www.m2mimaging.com/）

软件

Microsoft Excel程序（Microsoft Excel 2010）
Inveon PET/CT小动物成像平台（西门子医疗公司，田纳西州诺克斯维尔）
Inveon工作站软件（西门子医疗公司，田纳西州诺克斯维尔）
Biovet？（M2M Imaging）生理监测和加热系统（M2M Imaging Corp.USA.www.m2mimaging.com）

程序

人红细胞制剂
1. 用10毫升无菌一次性移液管将10毫升全血用标准抗凝血枸橼酸葡萄糖（ACD）溶液（从Zen Bio，Inc.公司运输过夜）轻轻移液至15毫升无菌锥形离心管中。原始血样应具有图1所示的良好质量。血液应缓慢地输送，以减少对红细胞的机械损伤/剪切损伤。
  < BR>
  图1。原抗凝血样。原抗凝血样应无凝块，流动性好。
  < BR>
2. 在室温下，在台式离心机（无制动器）中以1000x g（rcf）离心血液10分钟。
3. 用10毫升无菌移液管缓慢移走红细胞（rbc）部分几乎所有的血浆。等离子体应该接近稻草色或有一点微红的色调，如图2所示。有明显浑浊或明显红色的血浆意味着离心不当或原始血液样本存在明显溶血，可能使样本不适合放射性示踪剂标记。用10毫升无菌移液管将2毫升颗粒红细胞缓慢移入15毫升锥形离心管。红细胞抽吸时应避免血浆残留和皮肤发黄。向红细胞中加入8毫升1X EDTA溶液。关闭试管盖，轻轻翻转试管几次，清洗试管。
  < BR>
  图2。离心第一步后的原始血液。理想情况下，血浆应接近稻草色或略带红色。
  < BR>
4. 在室温下以1000x g离心10分钟，然后用10毫升无菌移液管缓慢吸出图3所示的上清液。快速吸取上清液会干扰上清液/红细胞界面，导致红细胞吸取。
  < BR>
  图3。用4x体积的1X EDTA溶液清洗后的红细胞 < BR>
5. 用1000微升移液管将250微升红细胞移入1.8毫升冷冻瓶中（标记为“1”和“2”）。应注意避免用移液管移取任何残留上清液。
6. 在每个红细胞冷冻瓶中，通过手动移液管加入100微升5x EDTA溶液和50微升无菌去离子水（总体积=400微升）。
  
  < BR>
人红细胞f-fdg标记
1. 为了最大限度地提高人红细胞的放射性标记效率，在NSG TM免疫缺陷小鼠的血管中，用E/Em> PET显像，在细胞标记开始时，USP级 18 F-FDG的特异性活性应被校准到至少每毫升20毫居里（MCI）。< BR> 注：（杰克逊实验室，库存编号：005557）已被使用，因为其严重的免疫缺陷。其他免疫缺陷小鼠菌株尚未进行测试，但也可能是可行的。>
2. 在适当的放射性屏蔽后，将100μl18f-fdg溶液添加到每个红细胞冷冻瓶（f.v.=500μl）中。本议定书中放射性物质的处理方法应遵循贵机构辐射安全官员制定的方法。用AtomLab试剂盒直接测定放射性活度，记录时间。每个小瓶中的活性量应至少为1 mci的fdg。确保盖子拧紧在冷冻瓶上。当选择适当的小瓶用于FDG RBC标记时，应小心，因为一些低温小孔由某些塑料组成，当暴露在较高温度下时，它们不能保持帽的良好密封，并且可能导致局部放射性泄漏/污染。一个薄条的PARFLAM TM可以被包裹在盖子的边缘，以确保从管中没有放射性泄漏，并减少冷冻管腔的水损失。
3. 轻轻地用手指恢复红细胞。如图4所示，将小瓶垂直放置在与旋转器平台捆绑/捆绑的管架上。在37°C的垂直位置孵育旋转样品，在小于60转/分的转速下孵育30分钟。避免在旋转过程中倒置管子，因为这可能会增加粘附在管壁上的干细胞的数量。 < BR>
  图4。RBC用100 L L 18F-FDG溶液在旋转平台上标记，在37°C培养箱中放置直立位置<强> >强> <强> BR/> < BR>
4. 在4℃下离心分离RBC样品1000℃＞EX×G＞10分钟（无制动）。本样品如图5所示。 < BR>
  图5。自由< > > 18个>上半部分（上半透明溶液）和沉淀红细胞组分（溶液的红下半部）>强>强> >强> > > > > < BR>
5. 将样品放置在通风的实验室罩中，在适当的辐射屏蔽之后，将上清液（约250升）轻轻转移到标示“Supe 1和2”的3.5毫升冰冻瓶中。
6. 在1毫升1X EDTA溶液中，用手动移液器轻轻地将每250 L的红细胞颗粒重新沉淀。应注意缓慢地重新培养细胞，以尽量减少移液管对细胞造成的机械损伤/剪切损伤。
7. 在4℃下重复离心1000次<×g > 10分钟（无制动）。离心样品如图6所示。
  < BR>
  图6。用1 mL 1X EDTA溶液洗涤18F FDG标记的红细胞样品<<强> <强> <强> Br/> < BR>
8. 将2nd上清液转移到适当的“supe”管中。
9. 如上所述，在1 mL 1X EDTA溶液中，再次将250μL的红细胞细胞小球重新悬浮。
10. 在4°C下重复离心RBC样品1000X G＞10分钟（无制动）。
11. 将上清液转移到适当的“SUPE”管中。小心地从与细胞颗粒的界面上吸管残余的上清液，只留下一个微小的弯月面覆盖在球团上。
12. 使用原子探测器通过剂量校准器（居里）直接计数SUPE和RBC球团冷冻池，并记录时间。细胞内放射性示踪物的典型量受细胞溶液（250μL颗粒化红细胞）的总允许体积的限制，可以按照我们的机构IACUC指南每天注射到小鼠体内，但通常范围从150到300个居里，在细胞标记开始时，根据所选择的 18 F-FDG特异性的活性可以更高。在1X EDTA溶液中250μL温和地重新沉淀球团。两个红细胞样品的标记允许根据需要滴定更大体积的标记的红细胞。
13. 用22号针头将红细胞悬液转移到1毫升注射器中。不应吸入任何残留的细胞团，因为这些细胞团可能代表受损/凝固的细胞。细胞应缓慢吸入注射器腔，以尽量减少对细胞的机械损伤/剪切损伤。注射前和注射后应测量注射器内的放射性，以确定体内注射的净放射性，因为注射后注射器内会残留放射性。
  
  < BR>
小动物pet/ct成像
1. 制备4～6周龄雄性脾切除术后nodscidgamma（nsgtm）免疫缺陷小鼠进行实验。
2. 在pet/ct显像前一天晚上，可以禁食小鼠，以促进小鼠代谢活动从葡萄糖转移到脂肪酸，从而使标记细胞制剂中任何游离fdg的心肌摄取量降至最低。根据需要，也可以将小鼠置于非常低碳水化合物的饮食中。如图7所示，通过眶后静脉丛穿刺抽取500微升小鼠血，或在您的机构抽取其他经批准的静脉血。血液应收集到肝素化的血液收集管中。如果采血太慢，有发生明显凝血的风险，使血液样本不适合作fdg标记。使用血糖监测仪测量血糖水平，以便进行PET校准。
  < BR>
  图7。大鼠腿部静脉采血例 < BR>
3. 在吸入2-4%异氟醚的情况下，通过鼻锥歧管麻醉小鼠。建议尽可能低水平吸入异氟醚，因为异氟醚可能导致小鼠血管舒张。记录每只小鼠吸入异氟醚的水平。
4. 用一条浸过水的毛巾加热鼠尾，刺激鼠尾静脉扩张。将尾静脉微导管插入扩张的小鼠尾静脉中。用1u/ml肝素pbs溶液冲洗尾静脉导管。参见视频1中的示例。
5. 在2-4%异氟醚吸入麻醉下，通过鼻锥管将小鼠固定在微型PET/CT扫描床上，如图8所示。通过用气泡包装轻轻地将动物包裹在微型PET/CT扫描仪床上，可以将动物固定在床上，从而最大限度地减少动物的活动，保持身体的温暖。包装动物时必须小心，因为紧密的包装可能会妨碍动物的呼吸运动。
  < BR> 视频1。标准微导管插入小鼠/鼠尾（此视频由南佛罗里达大学制作，根据南佛罗里达大学动物护理指南和南佛罗里达大学动物研究伦理委员会根据协议IS00004376批准。）
  
  图8。动物在micropet/ct扫描床上进行全身血管f-fdg-rbc显像 < BR>
6. 通过尾静脉微导管将500微升FDG标记的人红细胞悬液缓慢注入小鼠体内，持续1分钟，以减少通过微导管腔对细胞的剪切损伤。参见图9所示的示例。
  
  图9。经尾静脉微导管注射fdg标记红细胞的例子 < BR>
7. 采集小鼠心电门控全身图像，然后采集ct定标图像。PET/CT图像采集参数将取决于特定机构的特定实验适应症和独特的成像平台设置；因此，以下是我们机构使用的协议说明。
  1. 将心电图（ECG）导联放置在小鼠的两个前肢和一个后肢（后肢接地导联）上，用于ECG门控PET成像。这些电极检测到的信号在10分钟的时间内由biovet？（m2m成像）生理监测和加热系统记录。
  2. 在R波峰值上升模式下设置TTL心脏门控信号的阈值。
  3. 用3D-OSEM迭代算法重建PET列表模式数据，四次迭代，八个子集，最终图像体积为256 x 256 x 256体素。将有效体素有效尺寸设置为1.4 x 1.4 x 1.4 mm。
  4. 每只动物都有三个数据集：标准三维（3D）PET重建，生成运动时间平均的3D PET图像；30帧动态3D PET重建；基于相位的四维（常规三维加时间，4D）PET心脏重建，有四个心脏门。请参见图10和图11。在所有情况下，CT衰减校正应用于PET图像（Choi等，2019年）。
    图10。微型PET采集设置示例 < BR>
    图11。使用西门子Inveon平台设置微型CT采集的示例
< BR>

数据分析

微型pet/ct分析
pet/ct图像处理/分析参数将取决于特定机构的特定实验适应症和独特的成像平台设置；因此，以下是对我们机构使用的协议的描述。
1. 使用Inveon工作站软件（西门子医疗公司，田纳西州诺克斯维尔）分析鼠标的全身PET图像。
2. 选择供应商软件提供的用于动力学建模的Patlak隔间图选项。
3. 对于3d pet和4d pet数据集，根据以下器官（如需要）的相应ct图像，手动选择多个感兴趣的体积（voi）：心脏、腿部肌肉、肝脏、肾脏和大脑。体素活动以标准化摄取值（suv）表示。使用每只动物的动态3d pet数据集绘制vois的动态活动曲线。4d pet数据用于定义心功能。首先，根据解剖特征在CT图像上分割心脏，然后转移分割的体积（心脏PET VOI）进行图像配准，如图12所示。图像表示为源数据的最大强度投影（mip）重建。心电引导下pet-mip图像的二值化可以获得小鼠心脏收缩力的伪动态图像，如视频2所示。
  < BR>
  图12。西门子Vieon工作站微PET/CT重建基本参数设置实例<强> >强> /强> BR/> < BR> < BR> 视频2。用2.2μq（250μl）FDG标记的人红细胞对NSG小鼠ECG门控全身微PET图像进行心脏电影成像（此视频是在南佛罗里达州大学制作的）根据南佛罗里达州大学动物护理学的指导方针，由南佛罗里达州大学动物研究伦理委员会通过ISO 044366认证。
< BR>
标记效率计算< BR> 标记效率=（RBC颗粒的放射性剂量）/（红细胞颗粒的SuPE+放射性剂量的放射性剂量）。

食谱

过滤灭菌100毫升5X EDTA溶液< BR> 700毫米氯化钠
20毫米kcl
12.5毫米k2edta二水合物
加入无菌去离子水至最终体积100毫升
通过0.2微米（nm）Nalgin瓶顶无菌过滤装置进行最终的解决方案；
100毫升1x EDTA溶液
20毫升过滤消毒的5X EDTA溶液< BR> 80毫升无菌去离子水
通过0.2微米（nm）Nalgin瓶顶无菌过滤装置进行最终的解决方案；
1单位/ml肝素PBS溶液
肝素钠溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，pH值7.4

致谢

我们非常感谢Moffitt癌症中心的Mikalai Budzevich博士对这项工作的建议和评论。该协议适用于Choi 等>。（2019）。

竞争利益

H.Lee Moffitt癌症中心和研究所提交了一份临时国际专利申请，描述了手稿中概述的成像技术（WO申请号：WO2017123666A2；PCT/US2017/013063，申请日期：2017-01-11）。没有额外的声明或潜在的竞争利益，关于专利申请的作者的手稿。这并没有改变我们对plos-one共享数据和材料政策的坚持。

伦理学

所有实验程序均经南佛罗里达大学（USF）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有实验均按照联邦法规和USF IACUC原则（协议IS00004376）和程序进行。

工具书类

Choi，J.W.，Budzevich，M.，Wang，S.，Gage，K.，Estrella，V.和Gillies，R.J.（2019年）。使用18F-氟脱氧葡萄糖标记的人红细胞在免疫缺陷小鼠模型中进行体内正电子发射断层血池成像。plos-one>14（1）：e021012。
Cysouw，M.C.F.，Kramer，G.M.，Frings，V.，De Langen，A.J.，Wondergem，M.J.，Kenny，L.M.，Aboagye，E.O.，Kobe，C.，Wolf，J.，Hoekstra，O.S.和Boellaard，R.（2017年）。nucl-med-biol>51:18-24。

Dong，H.，Zhang，Z.，Guo，Y.，Zhang，H.和Xu，W.（2017）。锝-99m-红细胞闪烁显像在眼眶海绵状血管瘤诊断中的应用。nucl-med common>38（9）：744-747。

Hacker，M.，Hoyer，X.，Kupzyk，S.，La Fougere，C.，Kois，J.，Stempfle，H.U.，Tiling，R.，Hahn，K.和Stork，S.（2006年）。充血性心力衰竭患者门控血池spect-qbs处理软件的临床验证：与muga的相关性，首次通过RNV和二维超声心动图。Int J心血管成像>22（3-4）：407-416。< BR>

Herrero，P.，Kim，J.，Sharp，T.L.，Engelbach，J.A.，Lewis，J.S.，Gropler，R.J.和Welch，M.J.（2006年）。使用15o-水和1-11c-醋酸盐评估小动物宠物大鼠的心肌血流量。j nucl-med>47（3）：477-485；

Lee，B.C.，Moody，J.B.，Weinberg，R.L.，Corbett，J.R.，Ficaro，E.P.和Murthy，V.L.（2017年）。优化82铷pet心肌血流定量的时间采样。j nucl cardiol>24（5）：1517-1529。

Liu，M.，Zhao，Z.Q.，Fang，W.和Liu，S.（2017）。红细胞标记的新方法：99mtc-4saboroxime作为血池显像剂的评价。bioconjug chem>28（12）：2998-3006。

Mohseni，S.，Kamali Asl，A.，Bitarafan Rajabi，A.，Entezarmahdi，S.M.，Shahpouri，Z.和Yaghoobi，N.（2015年）。门控血池spect对右心室功能的滤过作用。ann-nucl-med>29（4）：384-390。

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