材料和试剂

48个透明TC处理的多孔板，单独包装，无菌（康宁公司，Costar？，目录号：3548）
Falcon，50 mi锥形离心管（Isolab，无菌，目录号：078.02.008）
Falcon，15 mi锥形离心管（Isolab，无菌，目录号：078.02.007）
硼硅酸盐实验室瓶，250英里，GL-45（因特拉布，目录号：061.01.250）
硼硅酸盐实验室瓶，500英里，GL-45（因特拉布，目录号：061.01.500）
不锈钢金属锅，直径250 mm，深度85 mm
手术刀，长度25 mm（Interlab，目录号：048.51.010）
手术刀刀架，长度130 mm（Interlab，目录号：048.50.001）
玻璃培养皿，直径60 mm；高度15 mm（Interlab，目录号：081.01.060）
副膜M（Sigma-Aldrich，目录号：P7543）
磁力搅拌棒；长度10 mm；直径6 mm（Interlab，目录号：057.01.010）
芬尼吸管tmf2固定体积单通道吸管；100至1000μl（Thermo Scientific，目录号：4642090）
芬尼吸管tmf2固定体积单通道吸管；10至100μl（Thermo Scientific，目录号：4642070）
玻璃锥形烧瓶；容量50 mi（因特拉布，目录号：027.01.050）
锥形瓶盖，NS 12/21（因特拉布，目录号：051.08.012）
螺钉帽GL-45，蓝色（Interlab，目录号：051.09.45B）
实验室钳，长度115 mm，304不锈钢（Interlab，目录号：048.08.115）
匙形抹刀，长度150 mm，304不锈钢（因特拉布，目录号：047.01.150）
硼硅酸盐量筒，250 mi（因特拉布，目录号：015.01.250）
硼硅酸盐量筒，500 mi（因特拉布，目录号：015.01.500）
μdropTM板（Thermo Scientific，MultiscanTM和MDropTM板）
bsc，来自荷斯坦-弗里西亚牛的牛脊髓（bsc）[胸部区域（t2–t11）]4-6小时内，在土耳其巴里克塞尔当地屠宰场屠宰健康动物（16个月大）后获得。
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA-Na2）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
trizma？盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
过氧乙酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：433241）
乙醇99%（Sigma-Aldrich，目录号：32221）
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
牛胰腺脱氧核糖核酸酶I，DNA酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
牛胰腺核糖核酸酶a，rnase a（sigma-aldrich，目录号：r5503）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：06203）
盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：07102）
2-（N-吗啉）乙磺酸（mes）（Sigma-Aldrich，目录号：M3885）
N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（Sigma-Aldrich，目录号：8.04518）
N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）（Sigma Aldrich，目录号：8.00907）
Milli-Q水（Merck Millipore，I-III型，目录号：ZRQSVP3WW）
0.1 N NaOH溶液（见配方）
1 M NaOH溶液（见配方）
1 M HCl溶液（见配方）
70%乙醇溶液（见配方）
0.05 m 2-（n-吗啉）乙磺酸（mes）缓冲液（ph值5.5）（见配方）
交联（EDC/NHS）溶液（见配方）
高渗溶液（见配方）
rnase a和dnase i酶溶液（见配方）
去污溶液（4%乙醇/0.1%过氧乙酸）（见配方）

设备

超声波浴（Elma，Elmasonic S30H）
冻干机-55°C（Telstar，Lyoquest）
Milli-Q？超纯水整体净水系统（默克微孔，I型，Direct-Q？3紫外线）
冷冻干燥机（Telstar，Lyoquest-55）
涡流（IKA Genious 4，V4B）
分析天平（岛津，型号：ATX224）
pH计（梅特勒-托莱多，型号：FiveeasyTMFe20）
磁力搅拌器（多位置）（Jeiotech，MS-12BB，目录号：AAH330115BK）
机械均质机（IKA，T18碱性超turrax）
自动单通道移液管，10-100和100-1000微升（Gilson兼容，Diamond？Eco-packTM）
冰箱（西门子，型号：KG57NPW24N）
超低温冷冻柜（松下，型号：MDF-U5386S-PE）
轨道振动筛培养箱温度受控（基准，型号：incu-shakertmmini）

程序

平衡计分卡解剖
注意：在卫生条件下，在通风柜安全柜内进行解剖过程，以尽量减少交叉污染。>
1. 从荷斯坦-弗里斯坦牛胸区（t2-t11）采集bsc。
2. 用手术刀从脊髓切下肌肉、脂肪和其他脑膜组织。
3. 用200毫升Milli-Q水冲洗组织3次，以减少结缔组织和血液污染。
4. 取出软组织后，在玻璃培养皿上将脊髓切成几块（见图1，步骤1）。
  
  < BR>
BSC粘度凝胶的生产策略< BR> 注意：>
1. 在室温（RT）的冰浴（在金属罐中制备）中进行组织均匀化处理，以防止混合物过热和生物分子降解。>
2. 均匀化步骤（步骤b4）应至少重复三次。>
1. 将BSC组织（从外部污染物中清除）切成大约2 x 2厘米大小的小块。
2. 使用外科设备，如镀镍钢制成的实验室镊子和不锈钢微勺抹刀，将BSC组织放入玻璃锥形烧瓶中。
3. 用分析天平称取小片BSC（约5 g，湿态），然后放入20毫升0.1 M NaOH溶液中。
4. 用均质机在20毫升0.1 M NaOH溶液中以10000转/分的速度将BSC组织块均匀化5分钟。
5. 用玻璃刻度量筒将凝胶溶液的最终体积调整到30 mL，用0.1 mM NaOH溶液（参见图1，步骤2）。
  < BR>
3D-CBS的制造（图1）
< BR>
图1。三维DCBS制造工艺<强> Br/> < BR>
1. 将200μL的凝胶溶液移到48孔板的每个孔中，制备三维（3D）牛脊髓细胞外基质支架（称为3D-CBS）。
2. 在4℃下孵育4小时，使凝胶溶液成熟。
3. 然后，将48孔板在-80℃的超低温冰箱中冷冻过夜。
4. 最后，冷冻干燥均质BSC基质过夜使用-55°C冻干机（见图1，步骤3和4）。
  < BR>
3DCBS交联工艺（图1）
1. 称重25 mg冻干3D-CBS，制备交联支架。
2. 将每个3DCBS放入15毫升的猎鹰管中，其中6毫升乙醇99.9%在RT中15分钟，用摇动培养箱轻轻摇动120转。
3. 小心地滗出乙醇溶液，并用轨道摇动培养箱将每25毫克3DCBs与5.37毫升交联（EDC/NHS）溶液在室温下交联10分钟。
4. 之后，在250毫升硼硅酸盐实验室瓶中用螺旋帽冲洗200毫升MIL-Q水的支架2小时。
5. 最后，在80℃的48孔板中冷冻交联3D-CBS，并用-55°C冻干器冷冻干燥过夜（见图1，步骤5）。注意：>
  1. 非交联3D-CBS的尺寸为H＝3 mm，Oy＝8，交联的H＝1.2 mm，Oy＝6。
  2. 当非交联的3D-CBS质量约为25 mg时，交联的约为15 mg。
< BR>
3DCBS脱细胞过程（图1）
注：在R.T/EEM轨道摇动培养箱中进行过程。
1. 在200 mL高渗溶液中浸泡交联的3D- CBS [ 50毫米Trima[SUP>®< /SUP>盐酸盐，5毫米EDTA Na<＞2＜/Sub >（pH 8）]，在RT中含有1%个SDS 72 h。
2. 在用高渗溶液治疗后，在250毫升硼硅酸盐实验室瓶中用螺钉帽冲洗支架8次，每250毫升MIL-Q水24小时。
3. 洗涤步骤后，用50毫升含有脱氧核糖核酸酶I（DNaseⅠ）和核糖核酸酶A（RNase A）的酶溶液在37.5°C处理24小时，在120 rpm下摇瓶。
4. 将3DCBS漂洗3次，每次250毫升MIL-Q水，用200毫升4%乙醇和0.1%过氧乙酸（去污液）酸洗脱5小时。
5. 重复清洗步骤（步骤e4）。
6. 最后，在80°C超低温冷冻器上冷冻支架并再次冷冻干燥，以实现三维脱细胞BSC ECM支架（3D DCBS）（参见图1，步骤6）。注：3D DCB的质量约为2.5 mg.>

笔记

用分析天平对所有材料（即 >、化学试剂、组织样品、等< ）进行仔细称重。
使用已在所需pH范围内校准的台式pH计检查pH值。用1 M HCl或1 M NaOH调节配制溶液的pH值。
制备溶液的储存温度在4°C和RT之间变化。
在猎鹰管或玻璃瓶上涂上副膜M实验室膜，以防干燥。
用螺旋帽在250米硼硅酸盐实验室瓶内进行清洗和冲洗。
图1显示了3D-CBS的制备和脱细胞过程。

食谱

0.1 N NaOH溶液
1. 在MIL-LQ水中溶解0.4 g NaOH颗粒，使最终体积为100密
2. 在超声波浴中完全溶解球团；
3. 储存：RT；保质期：3个月
1 M NaOH溶液
1. 在MIL-LQ水中溶解2 g NaOH颗粒，使最终体积为50密
2. 在超声波浴中完全溶解球团；
3. 储存：RT；保质期：3个月
1 M HCl溶液
1. 将4.10毫升浓HCl（12.18米）小心地加入到45.9毫升的水中
2. 轻轻地旋涡
3. 储存：RT；保质期：3个月
注意：使用浓缩HCI溶液时应小心。>
70%乙醇溶液
1. 将350 mi乙醇（99.9%）与150 mi milli-q水混合
2. 一定要得到均匀的混合物
3. 储存：室温，保质期：3个月
0.05 m 2-（n-吗啉）乙磺酸（mes）缓冲液（ph 5.5）
1. 在70%乙醇（v/v）中溶解0.54 g mes，使最终体积为50 mi
2. 轻轻涡流1分钟，在280 W下超声10分钟
3. 使用1 M HCl溶液将pH值调整到5.5
4. 储存温度：4°C；保质期：1个月。
交联（EDC/NHS）溶液
1. 对于每25 mg的3- CBS，在57.5 ME缓冲液中溶解57.5毫克N-（3-二甲氨基丙基）N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和14毫克N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。
2. 在280 W下轻轻超声2分钟
3. 储存温度：4°C；保质期：新鲜制备
  注意：>
  1. 混合EDC（2.30 g/g样品）和NHS（0.56 g/g样品）（EDC/NHS＝2.5的摩尔比）。
  2. <> Buttafoco（2006）对以前描述的交联工艺进行了改进和应用（215），对每1 g 3DCBs进行了含有EDC/NHS的MES缓冲液的Mi缓冲。
高渗溶液
1. 溶解1.58克Trima[SUP>®< /SUP>盐酸盐，3.72 g乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA Na＜2＜/Sub＞）和2克十二烷基硫酸钠（SDS）在MIL-LQ水中。
2. 在40℃下孵育10分钟，然后超声处理，直到获得均匀溶液（约15分钟）
3. 在使用1 M NaOH调节pH 8之后，将最终体积完成至200 MI（称为高渗溶液）。
4. 储存：RT；保质期：1周
rnase a和dnase i酶溶液
1. 用旋涡溶解0.19毫克氯化镁（MgCl＜2＞2分）和3克MILQ水中的TIZMA ®< /SUP>盐酸盐
2. 在使用1 M NaOH调节pH 7.5之后，将最终体积完成到200 MI（称为缓冲溶液）。
3. 在缓冲溶液中加入40毫克的DNaseⅠ和10 mg RNase A，然后用温和的涡旋溶解（称为酶溶液）
  注意：应新鲜准备并立即使用。>
去污液（4%乙醇/ 0.1%过氧乙酸）
1. 将过氧乙酸溶液（360%）、200乙醇（99.9%）和191.8毫升MIL－Q水混合，得到200毫升去污液。
2. 一定要得到均匀的混合物
3. 储存：RT，保质期：1个月