< BR>
图1。western blot（左）和电镜（右）显示线粒体组分的纯度。a.qproteometm线粒体分离试剂盒。差速离心。用细胞器/细胞间隔特异性标记蛋白的特异性抗体探测亚细胞制剂的western blot：细胞溶胶（gapdh）、细胞核（组蛋白3）、线粒体（coxiv-ab16056，abcam）和微粒体/er/pm（kdel-ab1223，abcam，grp78）（gapdh，grp78，组蛋白3 ab139415，abcam）分数（左）。oxphos抗体混合物-ab110413，abcam图2）。

< BR>
图2。线粒体呼吸链复合物的western blot。除复合物iii外，糖尿病tgrs中呼吸链的所有复合物相对于其非糖尿病对照组和糖尿病wt大鼠均增加。抗体是针对每个复合物的一个亚单位（ci:ndufb8，cii:sdhb，ciii:uqcrc2，civ:mtc01，cv:atpva），当其复合物未组装时，该亚单位是不稳定的。结果用平均值±标准差表示。*与对照组相比，p><0.05；与野生型相比，p><0.0，3-4只/组。野生型大鼠，转基因大鼠。链脲佐菌素糖尿病。

材料和试剂

材料
1. 移液管尖端
2. 带进出口插座的玻璃瓶
3. 牛头钳
4. 塑料托盘
5. 胶带
6. 剪刀
7. 一次性手术刀（斯旺·莫顿，一次性手术刀，目录号：0086）
8. 刀片（德国H_berle Labortechnik GmbH，目录号：6800353）
9. 蝶形-19量规（外径-1.1 mm；内径-0.8 mm）
10. 牛头夹，约翰霍普金斯牛头夹，直形，3.8厘米（费希尔科学，目录号：12-460-556）
11. Einmal-Küvetten Aus PS（Neolab Migge GmbH，Ecolab，目录号：E-1642）
12. Eppendorf安全锁管2毫升，1.5毫升（Eppendorf AG，Eppendorf管？）
13. 滤纸（默克KGAA，Whatman？纤维素色谱纸，目录号：WHA33030917）
14. 带玻璃杵的均质波特-猫王，23（17毫升）（Otto E.Kobe KG，目录号：9.651 677）
15. Wheaton Mikro Gewebe手用均质冲剂1毫升，配松而紧的玻璃杵（Neolab，目录号：9-0972）
16. 带玻璃杵的均质机，3毫升（Neolab，目录号：9-0936）
17. 注射针（Becton，Dickinson，型号：BD Microlance 27G Ref300635）
18. NUNCTM15毫升和50毫升锥形无菌聚丙烯离心管（Thermo Fisher Scientific，NUNCTM离心管）
19. NupageTM4-12%双三联体蛋白质凝胶（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：NP0321box）
20. 培养皿100 mm（Thermo Fisher Scientific，NUNC，目录号：4031）
21. 培养皿35 mm（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC200284）
22. 吸管头（Starlab International GmbH，Tipone？）
23. 聚偏氟乙烯膜（默克KGAA，Immobilon？，产品编号：IPVH00010）
24. 刀片（德国H_berle Labortechnik GmbH，目录号：6800353）
25. Tuberkulin Luer-Lok注射器，1毫升Omnifix-F，单向无菌（FA.B.布朗，目录号：9161406V）
26. Xcell IITM印迹模块（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：EI9051）
27. XCell SureLock ®< /SUP>微型细胞凝胶运行槽（THEMOFISHER SCORE，INVITRONSUP< TM ，目录号：EI001）
  < BR>
试剂
1. 抗体
  1. 抗Cox IV抗体，兔多克隆COX IV（ABCAM，目录号：AB16056），贮存于-80℃，稀释1:1000
  2. 抗kdel抗体，小鼠单克隆抗体[10c3]至kdel（abcam，目录号：ab12223），在-80℃下保存，稀释度1:1000
  3. 抗vdac1/porin抗体，小鼠单克隆抗体[20b12af2]至vdac1/porin（abcam，目录号：ab14734），4℃保存，稀释度1:800
  4. 抗β-肌动蛋白抗体，小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A2228），在-20℃下保存，稀释度1:2000
  5. 内质网部分western blot混合物（gapdh，grp78，组蛋白3）（abcam，目录号：ab139415），在-20℃下保存，稀释度1:500
    注：鸡尾酒中含有辣根过氧化物酶结合的二级抗体鸡尾酒。 >
  6. 山羊抗鼠IgG（H+L）二级抗体，HRP（THEMOFISHER科学，目录号：32430），4℃储存，稀释1:2000
  7. 羊抗兔IgG二级抗体，辣根过氧化物酶（圣克鲁斯生物技术，目录号：4），贮存于C°C，稀释液
  8. 总氧磷鼠类WB抗体混合物（ABCAM，目录号：AB110413），4℃保存，稀释度1:750
    注：鸡尾酒中含有5种小鼠M型抗体，每种抗体分别与每种复合物的亚基（CI：NDUFB8，CII:SDHB，CII:UQCRC2，CIV:MTC01，CV:ATPVA），BiO-RAD蛋白测定染料试剂浓缩物（BIO RAD实验室，目录号：500～-00 06），4℃下储存< >
2. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3311-50g）
3. 甘露醇，M=182.17 g/mol（Sigma-Aldrich，目录号：M9546）
4. edta·2h2o，m=372.24 g/mol（applichem，目录号：a3553）
5. Egta，m=380.4 g/mol（西格玛-奥尔德里奇，目录号：E3889）
6. 肝素钠（Sigma-Aldrich，目录号：H0200000）
7. igepal？ca-630（sigma-aldrich，目录号：9036195）
8. 氯化镁，6-水合物，Crystal，U.S.P.（MgCl＜2＜/Sub＞6H＜2＜/Sub＞O），M= 203.3G/MOL（J.T. Baker，目录号：77 91-18-6）
9. 吗啉丙烷磺酸（MOPS），m=209.3 g/mol（SERVA，目录号：29836）
10. NupageTMLDS样品缓冲液（4x）（赛默飞世尔科学公司，invitrogenTM，目录号：NP0007），4°C下储存
11. NUPAGEtmmes sds运行缓冲液（20x）（赛默飞世尔科学公司，invitrogentm，目录号：NP0002），4°C下储存
12. NupageTM样品还原剂（10x）（赛默飞世尔科学公司，invitrogenTM，目录号：NP0004），4°C下储存
13. NUPAGETM传输缓冲区（20X）（赛默飞世尔科技公司，InvitrogenTM，目录号：NP0006）
14. 苯甲磺酰氟（PMSF），m=174.19 g/mol（Gibco BRL，目录号：15521-016）
15. 磷酸二氢钾（K2HPO4·3H2O），m=228.22g/mol（Sigma-Aldrich，目录号：P966）
16. 完整的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11836145001），在4℃下储存
17. Qproteome线粒体分离试剂盒（Qiagen，目录号：37612）
18. 见Blue Plus2预拉伸标准（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：LC5925），4°C下储存
19. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
20. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
21. 蔗糖，m=342.3 g/mol（Sigma-Aldrich，目录号：s0383）
22. trizma？碱，m=121.14 g/mol（西格玛-奥尔德里奇，目录号：T6066）
23. 吐温-20（J.T.贝克，目录号：7374）
24. western blotting luminol试剂（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-2048），4°C保存
25. 奶粉（Carl Roth，目录号：T145-1）
26. EDTA二钠盐（J.T.Baker，目录号：6381-92-6）
27. SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
28. 甲醇（Carl Roth，目录号：4627.4）
29. HCL（Carl Roth，目录号：4625.1）
30. 二甲苯嗪20 mg/ml（Serumwerke Bernburg AG，目录号：CH.B:01117）
31. 氯胺酮10%（WDT，ch.B:J3218-03）
32. 液体n2
33. 酒
34. 丙酮
35. 均质缓冲液（见配方）
36. 隔离缓冲区（见配方）
37. RIPA缓冲区（见配方）
38. 1X TBS（见配方）
39. TBST（见配方）
40. 阻塞缓冲区（见配方）
41. 1米蔗糖（见配方）
42. 1 M Tris HCl（见配方）
43. 0.5 M EDTA（见配方）
44. 1 M甘露醇（见配方）
45. 1 m mgcl2（见配方）
46. 0.5米拖把（见配方）
47. 100 mm egta（见配方）
48. 1 m k2hpo4（见配方）
49. 50毫米PMSF（见配方）

设备

微量加样器
解剖器械
离心机（Eppendorf AG，型号：5415R）
Sorvall Superspeed离心机（Herolab GmbH实验室设备，型号：Sorvall RC5PLUS）
化学发光成像系统（Vilber，型号：Fusion Solo S）
多样本渗透压计（先进仪器，型号：2020）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，生命技术公司，型号：2000C）
高架振动筛gfl 3025（慕尼黑实验室设备）
Mini-blot-Schuttler，3-D（VHR，实验室服务有限公司）
分光光度计（哈佛生物科学，GeneQuant，目录号：80-2109-02）
JUN空气压缩机87R-15B，带压力计（-1至+0.6bar）（JUN-美国AIR GAST制造有限公司）

软件

excel（微软合作公司，美国雷蒙德）
机器Fusion SL，Vilber Lourmat软件：FusionCapt Advance SL4 16.08a

程序

大鼠组织采集
准备：提前准备所有试剂和仪器。您需要：解剖器械、冰块、小烧杯、液体n2、1台带压力计的空气压缩机、1个带进出口插座的玻璃瓶+连接管和每只大鼠：15毫升0.9%NaCl冰镇、300毫升灌流液（含50 IU/ml肝素的生理盐水、H 7.2-7.4，温度25-35/c），二甲苯嗪/氯胺酮，2 x 2 ml Eppendorf管，1 x 1 ml注射器，1个注射针30 g，1个蝶形19号，2个小型牛头钳。准备灌注系统（图3A）：将灌注液注入瓶中，控制压力（大鼠220毫巴，大鼠180毫巴，体重200克）。把蝶形针固定在管子上。< BR> 注意：清除所有管道中的空气。动物血管中的气泡会损伤组织！；>
< BR>
1. 麻醉
  用30号针头的1毫升注射器腹腔注射二甲苯嗪/氯胺酮混合物（5毫克/千克/100毫克/千克）麻醉大鼠。开始手术前，用踏板退缩反射测试麻醉深度！在开始手术前，根据需要补充麻醉剂以维持手术麻醉平面。
2. 灌注
  1. 用胶带将麻醉大鼠固定在软木桌上，将软木塞放入塑料托盘中，防止液体灌流到工作台和地板上。
  2. 用70%的酒精拭毛以湿润毛发，否则毛发会进入手术部位。
  3. 腹部皮肤和腹壁被一个纵向切口（肩胛骨切开术）和两个切口切割到两侧，这样就可以自由进入腹部；将肠道放在左侧。
  4. 将腹主动脉和腔静脉从结缔组织和脂肪（从髂动静脉到aa）中分离出来。在棉花芽的帮助下。确保血管完全没有结缔组织，否则您无法正确放置针头（图3b）。
  5. 将针头插入主动脉第三个血流，距主动脉起始处约1厘米。老鼠的髂骨。用小牛头钳将针头固定在血管内，稍后仔细观察针头（图3c）！！BR/> 注意：针孔应该向下，否则可以将针头穿过血管的两面。>
  6. 用小而锋利的剪刀打开1.5厘米长的腔静脉（大鼠）！开口应足够大，以便快速排出灌注液。拆下AA附近的卡箍。雷诺如果有一个（图3d）！！
  7. 根据大鼠体重，用220或180毫巴的输液（含50iu/ml肝素的生理盐水，pH7.2-7.4，温度25-35）灌流3分钟。输注后，肾脏的外观应该改变为淡红色，这意味着它们没有红细胞。如果出现斑片状，则输液不完全。 < BR>
    图3。灌流系统。a.灌流系统与jun空压机组装，b-d.方案针在大鼠体内设置。< BR> < BR>
3. 采集肾皮质
  1. 取出肾脏，立即用手取出肾包膜（图4a）。将肾脏放入装有5毫升0.9%氯化钠的小烧杯中。在新鲜的0.9%NaCl中漂洗3次。
  2. 冲洗后，沿着冠状轴（图4b-4d）对肾，用细剪刀去除髓质并丢弃（图4e-4f）。< BR> 注意：对于western blotting，将肾皮质切成小块，放入2ml的eppendorf试管中，直接冷冻在液体n2中，并储存在-80-c中；对于线粒体，新组织立即分离。
  注：对于western blotting，将肾皮质切成小块，放入2毫升的eppendorf试管中，直接冷冻在液体n中，并保存在-80 C中；对于mitochondisolation，继续处理新组织。>br < BR> < BR>
纯线粒体部分的分离为从实验大鼠肾皮质中分离出纯线粒体和结构完整的线粒体，建立了两个具有高度可重复性的实验方案。两种方案都提供了高质量完整的线粒体。方案1描述了使用qproteometm线粒体分离试剂盒分离线粒体。它提供高纯度的线粒体部分，完全不受其他细胞室的污染，但代价是产量较低，成本较高。方案2描述了用差速离心法分离线粒体的方法，这种方法可以获得更高的线粒体产量，但会降低纯度（纯度>；90%）。
1. 使用qproteometm线粒体分离试剂盒分离纯线粒体部分（图5）
  注：裂解缓冲液、破坏缓冲液、蛋白酶抑制剂溶液（100x）、线粒体储存缓冲液和线粒体纯化缓冲液均在线粒体分离试剂盒内提供。制备：预先将所有缓冲液、离心机和其他设备冷却至4°C，均质机冷却至-20°C（过夜）。您需要冰块、培养皿、剃须刀片、1.5毫升和2毫升试管、1毫升和2毫升玻璃均质机（带玻璃杵）、80%和100%丙酮预冷至20°C。使用前，用1:100体积的蛋白酶抑制剂溶液（100x）补充裂解缓冲液和裂解缓冲液（即），如果使用2 ml裂解缓冲液，则添加20μl蛋白酶抑制剂溶液[100x]）。
  < BR>
  图5。方案说明了用qproteome分离线粒体的工作流程。 < BR> 注：所有步骤应在4°C或冰上进行。分离的蛋白质组分应在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C下。>
  1. 收获后，立即称取60毫克肾皮质，放入30毫米的冰培养皿中，用2毫升冰冷藏缓冲液覆盖，用刀片将其切成小块（糊状）。
    注意：组织收获和切割之间的间隔不超过5分钟。>
  2. 将糊状物放入15ml试管中，在200x g、4°C下离心1分钟。
    < BR>
  对组织进行裂解，得到_1（溶酶体蛋白）和p1（包含线粒体）
  1. 弃去上清液，将切碎的肾颗粒悬浮在0.5ml冰冷裂解缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂溶液。
  2. 将悬浮液转移到预先冷却的1毫升玻璃浸液均质机中，用手在冰上使组织均匀化。用手轻轻地上下操作玻璃杵，在移动过程中旋转。反复上下移动5-10次，直到得到均匀的溶液，在冰上休息30秒，加入1.5毫升冰冷裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂溶液，然后再重复5次。< BR> 注意：均质过程中避免产生气泡。>
  3. 将匀浆移入2毫升试管中，在4°C的摇瓶上孵育10分钟。
  4. 在1000x g下离心匀浆10分钟，温度为4°C。
  5. 小心地除去上清液（s1）。这部分主要含有胞浆蛋白。放在冰上（参见步骤b1bb-b1ee）。
    注意：小心地从颗粒和试管中取出所有剩余的液体，以避免颗粒被胞浆蛋白污染。>
  < BR>破坏细胞，得到线粒体S2和细胞核、细胞碎片和未破碎细胞P2
  1. 用1毫升移液管尖上下吸管，将颗粒p1重新注入1.5毫升冰冷破坏缓冲液中，并添加蛋白酶抑制剂溶液。< BR> 注：颗粒致密。为了更容易地再次使用，切下1毫升吸管尖端并用力吸管。然后取一个新的尖端，继续上下吸管，直到颗粒完全悬浮。>
  2. 将悬浮液移入2 ml玻璃玻璃均质机中，并按步骤b1d所述用手将其均质。
  3. 将悬浮液移入2毫升试管中，在1000x g下离心10分钟，温度为4°C。
  4. 小心地将含有线粒体的上清液（s2a）转移到一个新的2ml试管中，并保持在冰上，直到步骤b1i。
    注意：要吸取上清液，请将吸管尖端指向管侧壁，并在颗粒上留下一些剩余的液体，以避免污染含有细胞核、细胞碎片和未破碎细胞的颗粒！保持冰冻状态。>
  5. 在0.5毫升添加蛋白酶抑制剂溶液的冰冷破坏缓冲液中清洗颗粒P2。按照步骤b1h所述重新使用，并在1000x g>下将悬浮液在4℃下离心10分钟。
  6. 小心地取上清液s2b加入s2a，放在冰上直到下一步。颗粒p2包含细胞核、细胞碎片和未破碎的细胞。再放入150μl线粒体储存缓冲液中，分两小瓶，保留10μl用于蛋白质测定，立即冷冻在液体n2中，并在-80°C下储存，直到进一步分析。
    注意：小心地清除所有剩余的液体，以免污染。< BR> < BR>
  将线粒体部分颗粒化
  1. 将步骤k和m中的上清液s2a+b在6000x g下离心10分钟（4°C）。
  2. 上述步骤（s3）产生的上清液构成微粒体部分。小心地将其拆下并放在冰上，直到步骤ff。
  3. 颗粒p3含有粗线粒体部分。< BR> 注意：清除颗粒和管中的所有剩余液体，以避免污染！< BR> > < BR>
  纯化粗线粒体部分
  1. 在750μl线粒体纯化缓冲液中用1毫升移液管小心地上下移取颗粒p3。
  2. 设置渐变（图6）：
    1. 用移液管将750微升线粒体纯化缓冲液移到2毫升试管中。
    2. 将移液管尖端放在试管底部，在线粒体纯化缓冲液下缓慢移取500微升破坏缓冲液。由于它们的粘度不同，缓冲液不易混合，将形成两层（图6a）。
  3. 小心地用移液管将750微升的线粒体悬浮液（从步骤q开始）移到线粒体纯化缓冲层的顶部，方法是将移液管尖端指向试管的侧壁，使液滴在管壁处缓慢向下流动（图6b）。
  4. 在14000x g下，在4°C下离心15分钟。
  5. 底部会形成一个含有纯线粒体的软颗粒。小心地取出1.5毫升上清液S4，不要从试管底部取出线粒体颗粒（图6c）。
  6. 然后，从试管底部小心地吸出剩余的500微升含有颗粒的溶液，并使用顶部切割的1毫升吸管尖端（图6d）转移到新的2毫升试管中。
  7. 添加1.5毫升线粒体储存缓冲液，并使用1毫升移液管尖端重新培养线粒体颗粒。
  8. 在8000x g下离心10分钟至4 oC。
  9. 重复步骤b1w和b1x清洗线粒体颗粒两次。
  10. 小球应该是褐色的。
  11. 弃去上清液，在50米线粒体储存缓冲液中重新培养颗粒，在n2中休克冷冻，并在-80 < BR>
  可选1:
  1. 要从步骤b1g中获得的部分中提取胞浆蛋白，向上清液中添加4体积的冰-冷丙酮，并在冰上孵育15分钟。
  2. 在12000x g下离心10分钟至4 oC。
  3. 丢弃上清液，用1毫升80%丙酮清洗颗粒。
  4. 风干小球，再将其放入50米的线粒体缓冲液中。在-80℃下保存，直到进行进一步分析。
    < BR>
  可选2:
  1. 为了从含有步骤b1o获得的细胞膜的微粒体部分中提取蛋白质，上清液在45000x g>下在sorvall离心机中于4oc离心s3 30分钟。 < BR>
    图6。方案说明了用qproteome制备梯度分离纯线粒体的工作流程。 < BR>
2. 用差速离心分离线粒体（图7）
  <强>制备：< /强>制备均匀化缓冲液10 ml /大鼠肾脏，并根据处方进行分离缓冲液（500 mIL/大鼠肾脏）。在使用前，用0.1 mM苯基甲磺酰氯（PMSF）补充隔离缓冲液（即 >，如果使用50毫升均质缓冲液，加入100 mL 50 mPmSF）。通过0.2m过滤器过滤。此外，您还需要冰和每只老鼠：1个10毫米培养皿、1个剃须刀刀片、1 x 1.5毫升和4 x 15毫升试管和1 x 15毫升玻璃水均质机。
  < BR> 注：所有步骤应在4.C.下进行。在开始操作前，对所有缓冲液、离心机和其他设备进行预冷却。将均质机放置一夜至-20>
  1. 收获后，立即称出1g肾皮质，将其放在一个10毫米的培养皿中，用刀片将其冷冻成小块（糊状）。
  2. 将肾糊移入17毫升的玻璃陶罐均质机中，加入10毫升均质缓冲液（比例：肾重/均质缓冲液=1 g/10毫升）。
    注意：在使用之前，请始终记住用0.1 mm PMSF补充均质缓冲液。>
  3. 用一个松散的玻璃杵在4摄氏度时用手使组织均匀化。缓慢地上下操作杵，在移动过程中旋转杵。重复上下运动五个十小时。用紧的玻璃杵重复上述步骤。
    注意：均质过程中避免产生气泡。
  4. 在冰上均匀放置2分钟。
  5. 将匀浆移入15ml蓝色杯形管中，在100x g下离心10分钟至4 oC。
  6. 将上清液移入新的15ml试管中，并在300x g下离心10分钟至4 oC。
  7. 将上清液移入新的15毫升试管中，在500x g下离心10分钟，温度为4°C。
  注意：在吸入液体时，将吸管尖端对准管侧壁，并在颗粒上留下一些剩余液体，以避免颗粒受到任何污染。>
  1. 将上清液移入新的15毫升试管中，并在1000x g>下在4℃下离心10分钟。
  2. 丢弃上清液，并在5毫升冰冷隔离缓冲液中清洗小球。在1000x g>下，在4°C下离心10分钟。
  3. 丢弃上清液。含有纯线粒体部分的棕色颗粒应溶解在200-400微升的冰冷隔离缓冲液中，转移到1.5毫升的Eppendorf试管中，在液体N2中休克冷冻，并在-80°C下保存，直到进行进一步分析。
    < BR>
    图7。方案说明了差速离心分离线粒体的工作流程 < BR>
从肾皮质分离蛋白质
制备：根据配方制备RIPA缓冲液。使用前，立即用1片蛋白酶抑制剂/50毫升缓冲液补充RIPA缓冲液。此外，您还需要冰块、玻璃均质机、玻璃杵、1.5毫升和0.5毫升试管。
注意：>
1. 在冰上工作。开始操作前，将所有缓冲液、离心机和其他设备预冷却至4°C，并将均质机在-20°C中过夜。>
2. 在均质化过程中一旦发生水解，就开始去磷酸化和变性。如果样品始终保存在冰上或4°C下，并且适当的抑制剂新鲜添加到裂解缓冲液中，则这些事件可以显著减缓。>
< BR>
1. 取约100毫克纸巾，用刀片切碎成细糊状，放入1毫升手动均质机中。
2. 向均质机中加入500微升RIPA缓冲液。
3. 通过同时扭转和上下运动使组织均匀化。在冰上工作。
4. 将匀浆移入新的1.5毫升试管中。
5. 用500微升RIPA缓冲液清洗均质机，并将缓冲液转移到同一管和涡流管中。
  注：用自来水清洗均质机3次，用样品之间的双蒸馏水（DDH>2>o）清洗均质机3次。>
6. 让样品在冰上放置5分钟。
7. 在12000x g>下离心匀浆20分钟，在4°C下。这将从细胞碎片（颗粒）中分离出总蛋白（上清液）。
8. 轻轻地从离心机上取下试管并将其放在冰上，小心地吸出上清液，使尖端指向试管侧壁。
9. 将上清液移入1.5毫升冰管中，并将样品在液体n2中休克冷冻，如不需要立即保存在-80°C下。
  注：在额外的0.5毫升试管中加入约200微升的小份样品，以测量蛋白质浓度。
  > < BR>
测量蛋白质浓度
<强>制备：< /强>预先准备1毫升1 mg/ml Bovine Serum Albumin（BSA）为标准品。用4份去离子ddh2o稀释1份bio-rad蛋白质测定染料试剂浓缩物。通过whatman 1过滤器（或等效过滤器）过滤以去除微粒。此外，你还需要冰块，几个反应杯和副膜。< BR> 注意：在开始操作前，将所有缓冲液预冷却至4°C。>
< BR>
1. 为标准曲线准备14个反应杯，为每个样品准备3个反应杯（始终测量三倍），向每个样品添加1毫升稀释的Bio-Rad蛋白质测定染料试剂。
2. 要执行标准曲线，每5、10、20、30、50微克牛血清白蛋白（标准曲线样品）需要1个带有0微克牛血清白蛋白的比色皿（参考）和2个比色皿。
  注：>即，>制备含5μg BSA的比色皿时，向1 ml试剂中加入5μl 1 mg/ml BSA。>
3. 用副膜覆盖顶部，并通过倒置小心混合。室温下孵育10分钟。
4. 在595nm处测量蛋白质吸收，并将数据传输到excel文件中。用r2和等式创建曲线和趋势线。
  注意：如果您对标准曲线和R2满意，请继续。否则，重复步骤d1-d4。>
5. 如果标准曲线是好的，继续你的样品。为每个样品准备三个反应杯，每个反应杯使用1毫升Bio-Rad蛋白质测定染料试剂，依次向反应杯中添加1微升样品，试图获得标准曲线样品线性范围内的颜色。（将测量值增加三倍以获得更好的精度。）
  注意：记下添加的总体积，并始终添加每个样本的相同体积。>
6. 用副膜覆盖顶部，并通过倒置小心混合。室温下孵育10分钟。
7. 在595nm处测量蛋白质吸收，并将数据传输到excel文件中。
8. 计算每个样品的平均吸收率，并使用标准曲线方程计算每个样品中的蛋白质浓度。标准曲线的形式如下：
  y=m∙x+b
  式中，y=吸收，m=斜率，x=蛋白质浓度，b=截距。< BR> 要计算蛋白质浓度（取决于添加的样本量），请将公式更改为：
  < BR>
蛋白印迹
为了验证分离的线粒体的纯度和结构完整性，我们在下面详细描述了对从整个肾皮质分离的亚细胞组分或蛋白质进行western blot的方法。我们使用表1中列出的抗体来识别各个组分的特异性标记蛋白。< BR> < BR> 表1。抗体，靶向特异性细胞器标记
< BR>
1. 样品制备
  准备：根据使用的抗体，将加热块预热至97°C或50°C。您还需要LDS样品缓冲液，NUPGAGE TS/SUP>样品还原剂（10X），1X MES SDS运行缓冲液，NIPAGE TM 转移缓冲液，XCell SureLock ®迷你细胞凝胶运行槽和NuPaGe> SUP> TM NOVEX ®< /SUP> 4-12%BIS TIS蛋白凝胶，请参见Blue Plus 2标记。
  注意：使用0.5毫升（或更小）的试管。>
  1. 取样品蛋白20μg，以ddh2o稀释至总体积13μl。
  2. 加入5微升NupageTMLDS样品缓冲液（4x）和2微升NupageTM样品还原剂（10x）。
  3. 根据使用的抗体，在97°C或50°C下加热样品10分钟，使蛋白质变性。
    注意：>
    1. 抗体通常识别感兴趣蛋白质的一个小表位。为了使抗体能够进入这一部分，必须展开蛋白质，即使其变性。
    2. 使用oxphos鸡尾酒时的特殊处理。抗体civ:mtc01是一种高度疏水的蛋白质，对加热非常敏感。这就是为什么用这种抗体混合物进行蛋白质印迹的蛋白质只在50℃下加热！！！！
2. 凝胶电泳
  1. 建立XCELL锁SUP>®< /SUP>迷你细胞凝胶运行槽和NuPaa TM NOVEX ®< /SUP> 4-12%BIS TIS蛋白凝胶。用冰冷1x mes sds运行缓冲液填充腔室。
    注：先用1X MES SDS缓冲液洗涤威尔斯3次，除去凝胶残留物。
  2. 在一口井内装载8微升Seeblue Plus 2标记。
  3. 将20微升样品装入剩余的井中。
  4. 在190 V处电泳45分钟，或者直到染料到达凝胶的末端为止。
3. 蛋白质转移
  准备：将Whatman-滤纸和PVDF膜切割到适合转移室的尺寸。将衬垫和滤纸浸泡在NUPAGETM传输缓冲液中，直至饱和。< BR> 注：使用后立即使用凝胶。不要在转移缓冲液中浸泡凝胶。 >
  1. 在电泳过程中，将PVDF膜置于甲醇中30 s，然后用DDH2O短暂冲洗，并将膜置于浅盘中，并用冰冷NupageTM转移缓冲液冲洗至少一分钟。
  2. 电泳后，立即按照制造商的说明组装Xcell IITM印迹模块。如图8所示，该结构应建在用于电印迹的室中。
    < BR>
    图8。电印迹结构< BR>
  3. 将构建物放置在小室中，并用冰-冷NupageTM传输缓冲液填充电印迹构建物。用ddh2o填充腔室。
  4. 在30 V下执行吸墨纸程序90分钟。
4. 免疫检测
  准备：准备TBST缓冲区和阻塞缓冲区促销。只能用塑料镊子来处理薄膜。
  1. 为防止抗体的非特异性结合，用封闭缓冲液封闭膜。在火箭摇床上温和搅拌，在室温下孵育90分钟。< BR> 注意：你也可以在4.C.搅拌过夜。
  2. 将阻断缓冲液中的主要抗体稀释至推荐的稀释度（见材料和试剂）
  3. 用适当稀释的一级抗体在4.oC的封闭缓冲液中搅拌培养一整夜。
  4. 在室温下，在TBST缓冲液中清洗膜三次，每次5分钟。
  5. 在室温下，用适当的辣根过氧化物酶（hrp）结合的二级抗体在封闭缓冲液中搅拌培养膜1h（见材料和试剂）。
  6. 在室温下，在TBST缓冲液中清洗膜三次，每次5分钟。
  7. 洗涤后，通过毛细作用轻轻地将多余的液体通过接触过滤器去除到块的边缘，将膜放置在塑料箔上，并添加1毫升的Western印迹鲁米诺试剂溶液凝胶（根据使用说明书准备前的工作溶液）。确保用试剂充分覆盖膜，并将膜培养1分钟。
    注：与二级抗体结合的辣根过氧化物酶（hrp）在过氧化氢存在下催化鲁米诺氧化为3-氨基邻苯二甲酸盐，并在428 nm处伴随发光。>
  8. 使用合适的成像系统检测信号。< BR> 注意：尝试三次曝光：30秒、2分钟和5分钟。>

食谱

均质缓冲液，pH 7.4（100 ml）
注意：缓冲液应在4-oC下保存最多一周，并使用冰镇。>
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最后一句话我的天啊！	【中文解释】：库存卷【Strong】	我的天，我的天！
250毫米Succrose，250毫米	我不吸烟！	一个月前
10 mm tris-hcl 。	一个月前	1 m tris-hcl pH 7.4 。
2 mm edta 。	0.4毫升（BR）	0.5 m Edta pH 8.0 。
这就是我的生活，我的生活就是这样，我的生活就是这样，我的生活就是这样。	【中文解释】：以100毫升为单位（Add up to 100毫升	他是耶稣。
0.1毫米PMSF*	他是耶稣。	他是耶稣。

notes：；

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最后一句：最后一句：结语	【中文解释】：库存卷【Strong】	我的天，我的天！
210 mm mannitol 。	我不吸烟！	1米曼纽尔@BR@
70毫米Succrose＜BR＞	我不吸烟！	一个月前
10毫米Mgcl22	一个月前	1 m mgcl22
5 mm K2hpo4 。	0.5毫升（BR）	1 m k2hpo4 。
10 mm mops 。	我不吸烟！	0.5 m mops 。
一毫米爱琴，一毫米	一个月前	100毫米EGTA 。
这就是我的生活，我的生活就是这样，我的生活就是这样，我的生活就是这样。	【中文解释】：以100毫升为单位（Add up to 100毫升	他是耶稣。

Adjust the ph to 7.4 with 10 m Koh
。他是耶稣。（李）李，李 Ripa Buffer，pH 7.2（100毫升）
。 Note:Aliquot in 50毫升tubes and store at-20°C.Shortly before using，Add 1 table of protase inhibitor/50 ml.

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最后一句话我的天啊！	【中文解释】：库存卷【Strong】	我的天，我的天！
50 mm tris-hcl 。	我不吸烟！	1 m tris-hcl pH 7.4 。
2.5毫米Edta 。	0.5毫升（BR）	0.5 m Edta pH 8.0 。
2%的Igepal CA-630 。	我不吸烟！	伊盖帕拉足球俱乐部
0.1%SDS 。	一个月前	百分之十的SDS
250 mm nacl 。	我不吸烟！	五米长的房子
0.5%的钠酸性钠	我不吸烟！	10%的钠，6/00
这就是我的生活，我的生活就是这样，我的生活就是这样，我的生活就是这样。	【中文解释】：以100毫升为单位（Add up to 100毫升	他是耶稣。

Adjust the ph to 7.2 with 1 m HCL
。他是耶稣。（李）李，李 1x TBS，pH 7.4（1000毫升）

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最后一句：最后一句：结语	【中文解释】：库存卷【Strong】	我的天，我的天！
20 mm tris-hcl 。	20毫升，20毫升	1 m tris-hcl pH 7.4 。
150毫米NACL 。	我不吸烟！	五米长的房子
这就是我的生活，我的生活就是这样，我的生活就是这样，我的生活就是这样。	Add up to 1000毫升BR/>.	他是耶稣。

Adjust the ph to 7.4 with 1 m HCL
。他是耶稣。（李）李，李 TBST（1000毫升）
。 0.1%Tween-20/TBST&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；1毫升Tween-20/1000毫升TBS （李）李，李 Blocking Buffer（100毫升）
。 5%Milk Powder/TBST&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBS；&NBSP；5 G Milk Powder/100 ML TBST
。他是耶稣。（思壮）有担保债权人的解决办法（李）李，李一个月前 Sucrosse 171.5 g in 500微克/升的DDH220，过滤（李）李，李 1 m tris-hcl
。 Trizma Base 12.114 g in 100毫升DDH22或
。 Adjust the ph to 7.4 with HCL，autlave （李）李，李 0.5米的Edta
。 2 h2或18 612 g in 100毫升DDH2或
。 Adjust the PH to 8，autlave ；（李）李，李 1米曼纽尔@BR@ Mannitol 91.085 g in 500微克/千克/小时220，过滤（李）李，李 1 m mgcl22 就是这样，就是这样，就是这样，就是这样了。（李）李，李 0.5 m mops
。 MOPS 10.465 g in 100毫升DDH220 （李）李，李 100毫米EGTA
。 EGTA 3.804 G in 100毫升DDH220 （李）李，李 1 m k2hpo4 。（k）2hpo43h2或22 822 g in 100毫升DDH20 （李）李，李 50 mm PMSF
。 PMSF 0.087 g in 10毫升ABS.ETOH，store at 4°C，light protected
。（李）的翻译是。 Acknowledgments （p）（P级=“Pzz”） The research was funded by grants from Deutsche Forschungsgemeinschaft（SFB 1118）and the grant of the NIH（5RO1DK100482）. （p）。竞争利益（p）（P级=“Pzz”） The authors have declared that no conflict of financial and non-financial competiting interests exists. （p）。伦理（p）（P级=“Pzz”） All animal studies were conducted in accordance with Federal and Local Laws and were approved by the Regionerungspräsidium Karlsruhe，Land Baden-Württemberg（G21/13，I-15/09，I-15/10）.

工具书类

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