< BR>
图1。骨骼肌的复杂性。a.构成骨骼肌结构的不同组织和细胞的结构。图像修改自（Biga等人，2019年）。琥珀酸脱氢酶染色（sdh）显示横切面肌纤维类型不同。比例尺用于100μm.c.从edl和比目鱼肌中分离的单个肌纤维的图像。比例尺为250μm。从每一个肌纤维上可以分析长和短rna的表达。

材料和试剂

200升小费
DNA Lobind试管（Eppendorf，目录号：0030108051或Serstedt，目录号：72.706.700）
Spin-X离心管（康宁Costar，目录号：CLS8160-96EA）
无rnase/dnase的eppendorf微离心管
0.2毫升PCR管
杂交垫圈片，8微阵列/片（安捷伦，目录号：G2534-60014）
细胞培养板：24孔板和6孔板
塑料巴斯德吸管
玻片染色皿
成年野生型小鼠，体重：33-35g
注：我们使用了CD1小鼠株。>
高糖杜贝克改良鹰培养基（DMEM）（微孔西格玛，目录号：D5796）
2,3-丁二酮单肟（BDM）（Sigma-Aldrich，目录号：b0753）
阿根科特安瓿xp珠子（贝克曼库尔特，目录号：A63881）
胶原酶来自I型组织溶解梭菌（Millipore Sigma，目录号：C0130）
胎牛血清（FBS）（MiLiple Sigma，目录号：F2442）
磷酸盐缓冲盐（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：20012019）
Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596026）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977035）
无核酸酶水（Ambion，目录号：AM9937）
氯仿（panreac applichem，目录号：121252）
70%V/V乙醇（在无核酸酶水中稀释乙醇）
75%V/V乙醇（在无核酸酶水中稀释乙醇）
80%V/V乙醇（在无核酸酶水中稀释乙醇）
无水乙醇
Mirneasy试剂盒（Qiagen，目录号：217004）
Rneasy微型试剂盒（Qiagen，目录号：74004）
完整的全转录体扩增试剂盒（密理波西格玛，目录号：wta2）
Genelote PCR清理试剂盒（密理波西格玛，目录号：NA1020）
Suretag DNA标记试剂盒（安捷伦，目录号：5190-3400）
基因表达杂交试剂盒（安捷伦，目录号：5190-0404）
基因表达洗涤缓冲试剂盒（安捷伦，目录号：5188-5327）
SurePrint G3鼠标GE 8x60K微阵列套件（安捷伦，目录号：G4852A）
聚（A）拖尾试剂盒（赛默飞世尔科学公司，目录号：AM1350）
3 M醋酸钠（pH 5.5）（赛默飞世尔科学公司，产品目录号：AM9740）
上标II逆转录酶（赛默飞世尔科技，目录号：18064014）
寡离子P1适配器底漆（5'-cctctatgggcagtcggtgatccgc[dt]20vn-3'）
智能底漆（5'-cacacatacctcataaaggg-3'）
Ion Xpress Plus GDNA库（Thermo Fisher Scientific，目录号：4471269）
PGM HI-Q OT2试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：A27739）
白金TAQ DNA聚合酶高保真度（Thermo Fisher Scientific，目录号：11304011）
E-凝胶尺寸选择凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：G661012）
DNA梯50 bp（Thermo Fisher Scientific，目录号：10416014）
高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）
离子OneTouch模板套件（Thermo Fisher Scientific，目录号：A29900）
1x低TE缓冲区（见配方）

设备

微量吸管（p10，p20）
-80°C冷冻柜
-20°C冷冻柜
显微解剖用镊子和剪刀
37°C培养箱
立体显微镜
冷冻式微型离心机
SpeedVac集中器
热循环器
纳米滴分光光度计
热传导阻滞
离心机
安捷伦Surehyb室（安捷伦，目录号：G2534A）
杂交箱（安捷伦，型号：G2545A）
杂交炉旋转器（安捷伦，型号：G2530-60029）
安捷伦扫描仪系统（安捷伦，型号：G2505C）
发电机（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
离子激流或离子s5系统（Thermo Fisher Scientific）
电泳设备（Thermo Fisher Scientific）
安捷伦2100生物分析仪（安捷伦）
离子触控仪（Thermo Fisher Scientific）
离子PGM测序仪（Thermo Fisher Scientific）

软件

生物分析软件（安捷伦，https://www.agilent.com/en/product/automated-electrose/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument/2100-bioanalyzer-laptop-228251公司或开发/提供商/供应商，网址）
特征提取软件（安捷伦，https://www.agilent.com/en/product/mirna微阵列平台/mirna微阵列software/feature-extraction-software-228496）
R统计软件（https://www.r-project.org/“target=”\u blank“>https://www.r-project.org/）
多实验查看器（https://sourceforge.net/projects/mev-tm4/“target=”\u blank“>https://sourceforge.net/projects/mev-tm4/）
mirdeep软件（https://sourceforge.net/projects/mirdeepstar/）

程序

有关分析单个肌纤维转录谱的主要步骤的摘要，请参见图2。
< BR>
图2。单肌纤维转录组分析的工作流程。该方案总结了单肌纤维转录组分析的主要步骤。在每个框的一侧，报告协议的相应部分。
< BR> 第一部分：从单个分离的肌纤维中纯化长rna（mrnas和lncrnas）和短rna（mirnas）

< BR>

肌纤维分离
注意：在这里我们将描述3个月大的小鼠，从肌细胞分离、肌纤维束、肌纤维、趾长伸肌的分离，但同样的程序也可以用于其他类型骨骼肌的胶原酶分离时间的优化。原则上，年轻的小鼠肌肉较小，我们建议减少胶原酶孵育时间和重复与年轻小鼠肌肉的摩擦过程，以避免损伤肌纤维。相反，老年小鼠的肌肉有更多的结缔组织，可能需要增加胶原酶孵育时间和重复的研磨过程，以获得足够数量的单个分离的肌纤维以进行以下分析。在任何情况下，重要的是限制这一步以避免基因表达的改变，从而避免细胞途径。根据当地动物福利法牺牲老鼠。>
1. 从后肢小鼠身上采集比目鱼肌或edl肌肉，注意仅用肌腱处理，以尽量减少肌纤维的机械损伤（图3）。我们用了3个月大的cd1小鼠。将其储存在1毫升冷DMEM 3毫米BDM中。肌肉采集时间不超过半小时。以下，逐步收集EME>比目鱼肌>和EDL肌肉。
2. 剥去腿部皮肤，露出后肢肌肉。
3. 轻轻地移除后肢肌肉的筋膜。
4. 将小鼠仰卧位，暴露胫骨前肌腱（ta）和edl。
5. 切断远端的TA肌腱，用它在近端连接处切除TA肌肉。
6. 切断远端EDL肌腱并通过切除近端EDL肌腱除去。
7. 将肌肉放在含有1毫升DMEM 3毫米BDM的管子中。
8. 重复步骤A5-A7收集另一条腿的EDL。
9. 将鼠标置于俯卧位置。
10. 切断腓肠肌肌腱，用其剥离肌肉，直至暴露于比目鱼肌肌腱。
11. 切断比目鱼肌>肌腱，并用它移除切断另一端的比目鱼肌>。
12. 将肌肉放在含有1毫升DMEM 3毫米BDM的管子中。
13. 重复收集另一条腿的比目鱼肌。 < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190927／2099217021358Y336.JPG”宽度＝“309”高度＝“100”ALT=“//> BR/> 图3。肌肉收集。从小鼠后肢肌肉中分离出的a.edl肌肉。b.在1毫升DMEM 3毫米BDM中收集一块肌肉。c.比目鱼肌>分离自小鼠后肢肌肉的肌肉。
  < BR>
14. 在37℃下，在1毫升高葡萄糖DMEM 3毫米BDM中消化肌肉45分钟，其中10毫克I型胶原酶在24孔板的一口中。
15. 依次在3毫升DMEM和3 mm BDM、3毫升DMEM和3 mm BDM中冲洗肌肉2分钟，在10%孔板（图4A、4B和4C）的不同的威尔斯中添加10% FBS和3毫升DMEM和3毫米BDM。在显微镜下小心和控制处理肌肉，以避免在清洗过程中失去肌纤维。
16. 将肌肉转移到6孔板的孔中，用3毫升DMEM和10% FBS在约25℃下灭活胶原酶（图4D）。
17. 用宽口塑料巴斯德吸管（直径约4毫米）轻轻物理研磨（上下吸管）释放肌纤维，用FBS冲洗以防止粘连。
18. 重复多次研磨过程，最终在新的威尔斯中转移非解离的肌肉，直到获得约100完整的纤维。每次物理研磨后，将肌肉转移到一个新的井中，去掉胶原纤维和超收缩纤维（图4E、4F和4G）。
19. 使用立体显微镜和微量移液管（200微升尖端），逐个挑选完整且隔离良好的纤维，首先用DMEM 3 mm BDM 10%FBS在井中清洗，然后用PBS在井中清洗（图4h）。
20. 如果研究人员选择通过MYHC蛋白表达来避免肌纤维的表征（可能在肌纤维片上[ Cimele等， >，2011），洗涤后，将单个肌纤维转移到RNASase／DNase游离的EpBRORTF微离心管中。特异基因[肌球蛋白重链4（myh4）、肌球蛋白轻链3（myl3）、肌球蛋白重链7（myh7）、原肌球蛋白3（tpm3）、肌动蛋白α3（actn3）、肌球蛋白重链2（myh2）的表达]将有助于肌纤维特性的鉴定（Chemello等人，2019）。请参阅图5，为每个步骤的流程图和时序规范。 < BR>
  图4。单根肌纤维分离和分离的步骤。a.用胶原酶孵育45分钟后，肌肉从24孔板（在图片左侧）转移到含有3 ml dmem 3 mm bdm的6孔板的孔中。在孵育2分钟后，整个肌肉被转移到第二个孔中，然后在第三个孔中，在每个孔中等待孵育2分钟。第三次肌肉转移的表现。c.胶原酶消化后用于肌肉冲洗的板的方案（L：形成左后肢的肌肉；R：来自右后肢的肌肉；1、2、3：第一、二、三次冲洗）。d.胶原酶失活和肌肉解离板方案（1，2，3：从肌肉中释放单个肌纤维的步骤）。e.在胶原酶失活过程中使用6孔板填充D解离肌。f.转移第二口井中未分离的肌肉，在第一口井中留下游离肌纤维。g.转移第三口井中未分离的肌肉，在第二口井中留下游离肌纤维，并最终释放其他肌纤维。从所有孔中回收游离肌纤维，并将其转移到一个新的24孔板中，如H.H.板的方案所述，该板用于清洗单个肌纤维（I:第一次清洗；II:第二次清洗；1，2，3:多个孔清洗不同的肌纤维。不必为每根肌纤维使用一口井）。第二次洗涤后，单个肌纤维可以在不同的eppendorf管中单独收集，也可以被切割成两段；一段用于myhc蛋白的鉴定，另一段用于rna提取和转录分析。
  < BR>
  图5。从后肢小鼠肌肉中分离单个肌纤维的工作流程。每个框描述工作步骤和时间，并与协议点相关。
  注意：在分离单个肌纤维的过程中，处理来自不同小鼠的相同肌肉类型时，必须遵循完全相同的程序和时间点，以避免由于组织处理而引入错误。此外，重要的是避免恢复收缩纤维，以避免有不同的基因表达，因为他们的特殊条件。在肌纤维收集过程中没有停止点。只有当肌纤维在Trizol中溶解用于RNA分析，在Laemmli缓冲液（Tris pH 6.8 62.5 mm，甘油10%，SDS 2%，β-巯基乙醇5%）中溶解用于MYHC分析（Chemello>等人，2011），在氮气中速冻，然后管才能在-80°C下储存。在图1C中，它代表了分离的肌纤维在显微镜下的表现。>
  
  < BR>
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离长rna和短rna
要进行rna纯化，最好避免使用过多的肌纤维。我们建议使用4-6个肌纤维样本。
1. 在250微升Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific）中溶解每根肌纤维，用移液管上下移动溶液。
2. 加入50微升氯仿，倒置试管充分混合，在冰上孵育15分钟。
3. 在12000x g下，在4°C下离心样品15分钟。
4. 收集水上相（约130微升）并将其转移到新管中。
5. 加入1体积70%乙醇并混合。
6. 将溶液转移到Mirneasy柱（Qiagen）上。
7. 在12000x g下旋转15秒
8. 长rna被柱保留，而短rna被洗脱液收集。保留洗脱液如果您对mirna成分感兴趣，请按照第一部分D节所述进行处理。
  
  < BR>
长rna纯化
1. 将700微升rwt缓冲液（qiagen）添加到含有长rnas的柱中（第一部分B节）。
2. 在≥8000x g下旋转15s并丢弃洗脱液。
3. 向柱中加入500微升RPE缓冲液（Qiagen）。
4. 在≥8000x g下旋转15s并丢弃洗脱液。
5. 再次向柱中加入500微升RPE缓冲液（Qiagen）。
6. 在≥8000x g下旋转15s并丢弃洗脱液。
7. 将柱放置在新的收集管中。
8. 向柱中心加入50微升无核酸酶水，在室温下孵育2分钟。
9. 在≥8000x g下旋转1分钟以洗脱长rna。最后，将洗脱液储存在-80°C的洗脱体积中。
10. 使用SpeedVac浓缩器将体积减少到14微升。在减少过程中最好控制体积以避免样品干燥。
11. 使用前，请在-80°C下储存。为了避免rna与塑料管结合，强烈建议使用lobind管。
  
  < BR>
mirneasy试剂盒纯化mirna（桥根）
1. 将0.65体积的无水乙醇（约165微升）添加到将三唑萃取液的水相装入Mirneasy柱（第一部分B节）后产生的洗脱液中，并充分混合。
2. 将溶液转移到Rneasy微柱（Qiagen）上。
3. 在≥8000x g下旋转15s并丢弃洗脱液。
4. 向柱中加入500微升RPE缓冲液（Qiagen）。
5. 在≥8000x g下旋转15s并丢弃洗脱液。
6. 向柱中加入500微升80%乙醇。
7. 在≥8000x g下旋转2分钟，并丢弃洗脱液。
8. 在盖子打开的情况下，在≥8000x g下再次旋转5分钟。
9. 将柱转移到新的收集管。
10. 向柱中心加入14微升无核酸酶水，在室温下培养2分钟。
11. 在≥8000x g下旋转1分钟以洗脱mirnas。最后，将洗脱液储存在-80°C的洗脱体积中。
12. 使用SpeedVac浓缩器将体积减小到6.5微升。如果您干燥溶液，请在无核酸酶的水中重新使用miRNAs，最好使用Lobind管进行SpeedVac步骤。
13. 使用前，请在-80°C下储存。
< BR>

第二部分：用微阵列技术分析单个分离肌纤维中的长rna < BR>

利用全转录体扩增试剂盒（sigma）制备用于微阵列杂交的长rna cdna文库
1. 将2.5微升文库合成溶液添加到第一部分C节中制备的14微升长RNA溶液中。
2. 在70°C下孵育5分钟，然后将eppendorf放在冰上（~4°C）冷却5分钟。
3. 将下面所示的混合物添加到先前制备的溶液中（第二部分中的步骤A1和A2）（表1）。
  < BR> 表1。库合成酶混合物
  < BR>
4. 使用（表2）中所示的参数在热循环器中培养。
  < BR> 表2。库综合的参数
  < BR>
5. 从热循环器上取下管子并短暂旋转。
6. 将所示混合物加入溶液中（表3）。
  < BR> 表3。库放大解决方案
  < BR>
7. 将先前制备的混合物分成五份eppendorf，每一份含有75微升溶液（对于最后一份，反应体积为<；75微升）。
8. 使用以下参数在热循环器中培养（表4）。
  < BR> 表4。库放大参数
  
  < BR>
9. 将wta dna保存在-20℃下，直至使用。
  
  < BR>
用基因叶酸聚合酶链反应净化试剂盒（sigma）纯化wta-dna
1. 分别纯化每种混合物（每种eppendorf含有75微升按第二部分A节所述制备的溶液）。
2. 加入375微升的结合液，转移到结合柱中。
3. 在12000x g下旋转1分钟并丢弃洗脱液。
4. 向柱中加入500微升洗涤液。
5. 在12000x g下旋转1分钟并丢弃洗脱液。
6. 以最大速度旋转2分钟，无需额外清洗。
7. 将柱转移到新的收集管。
8. 向柱中心加入50微升无核酸酶水，室温孵育2分钟
9. 在12000x g下旋转1分钟。
10. 用纳米滴分光光度计定量DNA。
11. 将纯化后的wta dna保存在-20℃下，直至使用。
12. wta-dna可标记用于微阵列杂交（第二部分c节）或用于ngs文库制备（第二部分f节）。
  
  < BR>
用SureTag DNA标记试剂盒（Agilent）标记用于微阵列杂交的WTA DNA
1. 在13微升无核酸酶水中制备2微克wta dna。
2. 加入2.5微升随机引物。
3. 在98°C下培养5分钟。
4. 移到冰上孵育5分钟。
5. 在12000x g下旋转1分钟。
6. 将所示混合物添加到溶液中（表5）。
  < BR> 表5。DNA标记溶液<强> Br/> < IMG类＝“DoOtStWh”SRC=“/Apple / IMAI//20/2099220322889257.JPG”宽度＝“350”ALT=“//> BR/> < BR>
7. 使用表6所示的参数在热循环器中孵育。 < BR> 表6。DNA标记的参数<强> Br/> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“/Apple / IMAI//20/2099217031616339.JPG”宽度＝“350”ALT=“//> BR/> < BR>
8. 在10000x g下旋转1分钟。
9. 添加430微升1x Te（pH 8.0）。
10. 将溶液转移到具有SuReTAG DNA标记试剂盒（AgLeNT）的纯化柱上。
11. 在14000x g下旋转10分钟，并丢弃洗脱液。
12. 向柱中加入480微升1x Te（pH 8.0）。
13. 在14000x g下旋转10分钟，并丢弃洗脱液。
14. 将柱反转为新的管。
15. 在1000℃下旋转1 min，x×g/e>收集纯化样品。每个样品的体积将近似为20～32μL。
16. 用纳米滴分光光度计测量DNA含量和标记。每微克cdna的dna产量约为4微克，比活力为30pmol。
17. 将标记的DNA存储在-20°C直到使用。
  < BR>
安捷伦微阵列杂交< BR/> 注意：如果您对测量LNCRNAs的表达感兴趣，请确保您使用的微阵列平台包含这类转录物的探针。>
1. 在20αL核酸酶中制备800 ng标记的DNA。
2. 加入5微升10X阻滞剂。
3. 在95℃下孵育2分钟。
4. 加入25微升2x Gex杂交缓冲液HI-RPM。
5. 将40微升溶液分配到杂交垫圈滑块上。
6. 将8x60K微阵列平台滑块朝下放置在杂交垫圈滑块上。
7. 将微阵列三明治加载到安捷伦SuReHyb室中。
8. 将组装好的腔室装入烤箱旋转架。
9. 在65°C下以10转/分混合17小时。
  
  < BR>
微阵列玻片扫描
1. 拆开杂交室。
2. 在充满冲洗缓冲液1的玻片染色皿中拆卸微阵列三明治。
3. 在清洗缓冲液1中清洗微阵列玻片1分钟。
4. 在37°C预热的冲洗缓冲液2中冲洗微阵列玻片1分钟。
5. 慢慢取出微阵列玻片，以尽量减少玻片上的液滴。
6. 将微阵列玻片放入玻片固定器中。
7. 使用G2505C扫描仪以3μm分辨率扫描玻片，获得单个肌纤维mRNA和LNCRNA表达谱。
  
  < BR>
从单个肌纤维中提取的rna
1. seqplex扩增产物（wta-dna）的大小在200-400碱基对之间，因此其测序不需要dna片段。在这里我们将描述使用离子流或质子测序器的测序协议，但改变适配器，扩增rna（wta-dna）也可以用illumina测序器测序。
2. 每个扩增子的末端都有一个5′-磷酸和2-碱基3′-悬置。
  < BR>
序列库准备
1. 在0.2毫升PCR管中，按下表所示制备适配器混合物（非条形码），并通过上下吸管混合。试剂在Ion Xpress Plus GDNA库制剂中（Thermo Fisher Scientific）（表7）。
  < BR> 表7。适配器混合
  < BR>
2. 准备以下混合物（表8）。
  < BR> 表8。DNA修复和适配器连接组合
  < BR>
3. 按照以下程序（表9）在热循环器中培养。
  < BR> 表9。DNA修复和适配器连接的参数
  < BR>
4. 使用Agencourt Ampure xp珠纯化适配器连接的DNA。
  根据所需的读取长度，将使用不同数量的Agencourt Ampure xp珠子：将100微升Agencourt Ampure xp珠子添加到第二部分步骤G3的100微升反应中，用于400-600 bp读取长度，将120微升Agencourt Ampure xp珠子添加到第三部分步骤G3的100微升反应中ii读数长度为200-300 bp。
5. 通过上下吸管充分混合，避免形成气泡。然后将试管放入磁架（例如>，dynamag）中3分钟，等待溶液变清。
6. 丢弃上清液，避免干扰颗粒。
7. 加入500微升新制备的70%乙醇，将试管留在磁铁上。
8. 孵育30秒，将试管绕垂直轴旋转3次，并将试管保持在磁铁上，以搅动珠子，避免珠子进入溶液。溶液澄清后，去除上清液，避免干扰颗粒。
9. 如前一步所示，用70%乙醇再次清洗珠子。
10. 用离心管除去残留的乙醇，将其放在磁铁上，用p10微量吸管的尖端吸出上清液。
11. 将盖子打开的管子放在磁铁上5分钟，以风干珠子（避免过度干燥）。
12. 从磁铁上取下试管，在磁珠上添加20微升低碲，并通过上下吸管将溶液混合。使样品涡流10秒。
13. 将溶液旋转几秒钟，然后将试管放在磁铁上至少1分钟。
14. 将上清液转移到一个新的无颗粒的龙虾中。
15. 储存于-30°C至-10°C。
16. 在进行乳液PCR之前，可以根据DNA大小在凝胶中选择或不能选择扩增文库。如果选择的范围与agencourt安瓿xp珠子，它是罚款的ngs研究员去整个empcr。有关尺寸选择的方法，请参见第三部分F节。有关乳化PCR，请参见第三部分H节。
  
  < BR>

第三部分：ngs对单个肌纤维mirnas的转录组学分析 < BR>

从单个肌纤维中纯化mirnas（见第一部分d节）
< BR>
用聚（a）拖尾试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对miRNAs进行聚腺苷酸化
1. 将表10中所示的混合物加入第一部分D节中纯化的miRNA溶液（6.5微升miRNA溶液）。
  < BR> 表10。聚（A）尾矿混合料
  < BR>
2. 37℃孵育1h。
3. 添加1微升NaOAC 3 M（pH 5.5）。
4. 加入44微升无水乙醇并充分混合。
5. 在-20℃下沉淀过夜。
6. 以最大速度旋转20分钟，小心地去除上清液，不要干扰颗粒。
7. 用50微升75%乙醇清洗。
8. 以最大速度旋转10分钟，小心地去除上清液，不要干扰颗粒。
9. 在3.2微升无核酸酶水中再悬浮。
  
  < BR>
聚腺苷酸mirnas第一链cdna的合成（第三部分b节）
1. 如表11所示，在0.2毫升试管中制备混合物A。
  < BR> 表11。逆转录混合物a
  < BR>
2. 按如下所示在0.2毫升试管中制备混合物B（表12）。
  < BR> 表12。逆转录混合物b
  
  < BR>
3. 将混合物B在65℃下在无加热盖的热电偶或热循环器中培养5分钟。
4. 旋转混合物B并在冰上孵育5分钟。
5. 将混合物A和B混合。最终体积应为10微升。通过上下吸管将溶液充分混合。
6. 使用不带加热盖的热循环器在42°C下培养60分钟。
7. 在70℃下使酶失活15分钟。
  
  < BR>
第二链cdna的合成第二链cdna通过pcr步骤合成，避免到达平台期。事实上，保持mirnas的原始比率是很重要的。这一步骤可以产生双链dna，在纯化后，可以在离子激流平台的5′端和3′端测序引物上进行测序。使用高保真taq dna聚合酶是避免pcr扩增过程中引入错误的重要方法。有关智能协议的方案，请参见图6。
1. 制备以下混合物，以对每个样品进行两次PCR反应（每个50微升）（表13）。
  < BR> 表13。poly（a）标记mirnas的pcr扩增
  < BR>
2. 按照以下循环（表14）在热循环器中培养。
  < BR> 表14。poly（a）标记mirnas的pcr扩增参数
  < BR>
  图6。mirna扩增方案。从单个肌纤维中提取的mirna使用pap酶（第三部分第1节和第B节）进行聚腺苷化。之后，使用smart技术（welleneuther等，2004）对mirnas进行转录。用于逆转录的引物是寡-d（t），包括5′端（2）的离子p1适配器序列。当上标ii到达mirna的5′端时，它向cdna中添加一段无模板c，用于结合smart引物（3）。在smart引物中，三个末端g是rna核苷酸。将智能引物与cdna结合后，用上标ii合成互补序列（4，第三部分c节）。利用这种方法，在mirnas的3′端和5′端产生两个锚。这两种锚可用于pcr扩增mirna。在PCR扩增（第三部分D节）过程中，使用一个特异性引物，在miRNA（5）的5′端包括一个适配器，这将有助于以链特异性的方式进行miRNA测序。经过10-12个周期的pcr扩增（6、7、8），分别在mirna的3′端和5′端用p1和a接合器获得足够数量的双链dna，从而进行乳化pcr和后续测序。
  < BR>
用genelute-pcr清理试剂盒（sigma）纯化dna
1. 将两个PCR（50+50微升）汇集在一起。如果你有一个以上的样品，记得保持它们分开。
2. 将500微升的结合溶液加入到混合PCR中，并将溶液转移到结合柱中。
3. 在12000x g下旋转1分钟并丢弃洗脱液。
4. 向柱中加入500微升洗涤液。
5. 在12000x g下旋转1分钟并丢弃洗脱液。
6. 以最大速度旋转2分钟，无需额外清洗。
7. 将柱转移到新的收集管。
8. 向柱中心加入50微升无核酸酶水，在室温下孵育2分钟。
9. 在12000x g下旋转1分钟。
10. 用纳米滴分光光度计定量DNA。
11. 将纯化后的PCR保存在-20°C下，直至使用。
  
  < BR>
使用E-凝胶大小选择凝胶（Thermo Fisher Scientific）选择NGS的大小
对于dna测序来说，选择要测序的dna的大小范围是很重要的。在长rnas维度纯化的情况下，在第二部分的步骤g4中进行了描述。识别mirna的保留读码长度为18-35 nt（He等人，2019年），或mirna文库的纯化小rna覆盖相同的维度范围（Krishna等人，2013年；Fu等人，2019年）。2018）和在库构建期间添加的适配器（第三部分D和E节）为~107个核苷酸（引物A为57 nt，寡核苷酸p1 50 nt）（图6）。因此，我们选择了125到142新台币之间的涂片。完整步骤见下文。
1. 使用2%琼脂糖凝胶。
2. 凝胶的每个孔都应加载不超过20-25μL和500 ng的DNA。
3. 如果从第三部分E部分制备的DNA需要稀释，使用低TE稀释。
4. 用低te稀释dna梯（50bp）至25ng/微升，用10微升稀释梯加载e-凝胶中心孔。
5. 加载样本井，避免对不同的样本使用相邻的井（不同体积的相同样本可以加载到相邻的井中）。
6. 空井必须装满25微升无核酸酶水。
7. 运行E-Gel Sizeselect仪器（Thermo Fisher Scientific），选择正确的程序（Sizeselect 2%）。
8. 使用仪器可视化运行，并在所需的DNA尺寸填充恢复良好时停止运行。
9. 使用P20吸管从溶液中恢复溶液，而不接触凝胶。通常，可回收12-15微升。
10. 用无核酸酶水代替抽出的体积填充回收井。
11. 再次启动仪器，重复第三部分中的步骤F9，直到恢复所有所需的尺寸范围。
  
  < BR>
量纲分析和库量化（安捷伦生物分析仪分析）
根据高灵敏度DNA芯片（安捷伦）运行纯化样品。< BR>
1. 在室温下解冻高灵敏度DNA试剂盒至少30分钟。
2. 在高灵敏度DNA凝胶基质中加入15μL高灵敏度DNA染料，制备凝胶染料混合物。
3. 通过旋转和旋转混合。
4. 将溶液置于0.22μm孔径的spin-x离心管（康宁肋片）上，在2200x g下离心10分钟。
5. 按下表（表15）所述加载高灵敏度DNA芯片。
  < BR> 表15。安捷伦生物分析仪芯片加载
  < BR>
6. 从用于评估库大小分布的生物分析仪分析中，使用生物分析仪软件确定pmol/l中的摩尔库浓度。
7. 确定稀释因子，使文库浓度达到约100 pm。
8. 该浓度适用于使用离子一触模板试剂盒（Thermo Fisher Scientific）制备模板。使用以下公式：稀释系数=（以pm为单位的库浓度）/100 pm。
9. 用少量的dna文库和必要的低te稀释新的lobind eppendorf文库，得到大约100 pm的浓度。使用此库稀释液制备模板。
  
  < BR>
使用离子一触系统（Thermo
）的乳胶PCR（DNA测序模板制备） i.费希尔科学）
注：所述材料包含在Ion PGM Hi-Q OT2工具包（Thermo Fisher Scientific）中。>
1. 设置离子触控系统。
2. 按如下方法制备放大液（表16）。
  < BR> 表16。DNA文库稀释
  < BR>
3. 涡流5s，自旋2s。
4. 制备离子型pgm-hi-q-isps，并通过旋转管1分钟和旋转2秒彻底混合。
5. 在2-ml Lobind试管中制备以下混合物（表17）。
  < BR> 表17。一触式反应混合物
  < BR>
6. 将第三部分步骤h5中制备的溶液装入离子一触式反应过滤器，将过滤器安装到离子一触式仪器上并开始运行。
7. 在运行结束时，按照离子一触式指令对模板阳性IPSS进行富集并加载测序芯片。

数据分析

长rna表达分析的微阵列数据分析
1. 数据预处理
  使用特征提取软件（Agilent Technologies）提取探针特征。我们在（Alessioet al.>，2019；Chemelloet al.>，2019）发表了以下数据处理说明。数据必须在数组内和数组间规范化。对于阵列内的标准化，我们建议使用特征提取软件，而对于阵列间的分位数标准化（normalizeequales，limma r包）。为了过滤掉错误的表达式值，我们使用了从特征提取软件（agilent technologies）计算出的背景标志之上的find和/或well above背景标志。如果选择的过滤器不是正的，我们将na的值赋给特定的表达式值。这允许在表达矩阵中只保留在足够数量的生物复制中具有定义的表达值的转录本。例如，在（Chemelloet al.>，2019）中，我们只考虑了在总共10个生物复制中至少有8个可用值的基因/探针。
2. 微阵列数据的统计分析
  微阵列数据可以使用R统计套件或更友好的平台（如多实验查看器，TM4微阵列软件套件的工具）进行分析（Saeed等人，2003）。为了识别肌纤维间差异表达的探针，我们进行了单因素方差分析（ANova），但可以探索不同的替代方案，例如利用在微阵列显著性分析（sam）算法中实现的错误发现率识别差异表达的探针（tusher等人，2001）。
3. 基因本体论
  差异表达的编码基因可以根据基因本体（go）使用不同的web工具（e.g.>，在david数据库中实现的功能注释聚类方法[huang daet al.>，2009]或根据路径分析[em>e.g.>，（销售等人，2013年）。关于LNCRNAs，没有可执行的富集分析。为了推断其功能，可将其与编码基因进行基因表达相关，如in（guo等，2017；fang等，2018；cagnin等，2019）。
  < BR>
ngs表达分析
在所有的测序实验中，由于存在适配器，必须对原始读数进行修剪，然后根据其长度和质量进行过滤。Chemello等人（2019年）使用超过18个核苷酸的读数进行以下分析：使用mirdeep软件量化mirnas的表达（Friedlander等人，2008年）。已处理的读取被映射到mirbase数据库（ver）中已知的小鼠mirna前体。19）使用具有默认值的mirdeep的mapper模块。基本上，在这个过程中，相等的读取被计数并折叠。自动排除映射超过5个不同位置的读取。mirdeep中的量化模块用于规范化成熟mirnas的读取计数。有关问题的讨论，请参见（risso等，2018a；risso等，2018b；chen等，2019；cole等，2019）单细胞数据分析（标准化、读取计数、聚类）中使用的软件。

食谱

1x低TE缓冲区
te缓冲液是一种含有tris（一种常见的ph缓冲液）和edta（一种螯合mg2+等阳离子的分子）的缓冲液。它用于溶解dna或rna，以防止它们降解
要制作1X低TE缓冲区，请参见表18。
< BR> 表18。制作1x低TE缓冲区的配方

致谢

创始资料来源：CARIPAO基金会（FEC-GEXP）和PADOVA大学（CPDA139317）到S.C.和G.L.；CARIPLO基金会（2016－1006）到S.C.和G.L.；意大利卫生部（GR-2011-023 468，45）到S.C.；AIRC基金会（意大利项目IG2015-ID1773）给G.L.；意大利帕多瓦大学（Prot.5086）
；本协议由Alessio等人（2019年）和Chemello等人（2019年）在我们之前的工作基础上进行了修改。我们感谢所有以前作品的作者。

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的利益。

伦理学

动物护理和实验的所有方面都是按照国家卫生研究所出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物编号85-23，1996年修订）和关于实验动物的维护和使用的意大利法规（DL116/92）。实验程序由意大利卫生部（授权号305/2017-PR）和帕多瓦大学伦理委员会批准。尽一切努力减少动物的痛苦。

工具书类

Alessio，E.，Buson，L.，Chemello，F.，Peggion，C.，Grespi，F.，Martini，P.，Massimino，M.L.，Pacchioni，B.，Millino，C.，Romualdi，C.，Bertoli，A.，Scorrano，L.，Lanfranci，G.and Cagnin，S.（§2019）.pubmed//>30649422“target=\ \ nk>single cell analysis reveals the involvement of the long non-coding rna pvt1 in the modulation of muscle atrophy and mitochondrial network.>>em Augusto，V.，Padovani，C.R.，and Campos，G.E.R.（2004）.skeletal muscle fiber types in c57bl6j mice.braz j morphol sci（2:89-94. Biga，L.M.，Dawson，S.，Harwell，A.，Hopkins，R.，Kaufmann，J.，Lemaster，M.，Mater，P.，Morrison-Graham，K.，Quick，D.and Runyeon，J.（2019）..target=>U blank>>anatomy&；生理学Cagnin，S.，Chemello，F.，Alessio，E.and Lanfranci，G.（2019）.single-cell transcriptomics and proteomics of skeletal muscle.em technology and applicationsCampbell，W.G.，Gordon，S.E.，Carlson，C.J.，Pattison，J.S.，Hamilton，M.T.and Booth，F.W.（+2001）。differential global genen expression in red and white skeletal muscle.am j physiol cell physiolCelegato，B.，Capitanio，D.，Pescatori，M.，Romualdi，C.，Pacchioni，B.，Cagnin，S.，Vigano，A.，Colantoni，L.，Begum，S.，Ricci，E.，Wait，R.，Lanfranci，G.and Gelfi，C.（+2006）.Parallel Protein and Transcript Profiles of FSHD Patient Muscles correlate to the D4Z4 Arrangement and reveal a Common Impairment of slow to fast纤维differentiation and a general deregulation of myod-dependent<>proteomics6（>19:5303-5321）. Chemello，F.，Bean，C.，Cancellara，P.，Laveder，P.，Reggiani，C.and Lanfranci，G.（2011）.Microgenomic analysis in skeletal muscle:expression signatures of individual fast and slow myofibers.”（/ Chemello，F.，Grespi，F.，Grespi，F.，Zulian，A.，Grespi，F.，Zulian，A.，Cancellara，P.，Cancellara，P.，Hebert-Chatelain，E.，Hebert-Chatelain，E.，Martini，P.，Bean，C.，Martini，P.，Bean，C.，Alessio，E.，Buson，L.，Bazega，M.，Armani，A.，Sandri，M.，Ferrazzza，R.，Laveder，P.，Guella，G.，Reggiani，C页：130917329“Target=BLANK>transcriptomic analysis of single isolated myofibers identifices mir-27A-3P and mir-142-3P as regulators of metabolism in skeletal muscle<>>EM>3784 Chemello，F.，Mammucari，C.，Gherardi，G.，Rizzuto，R.，Lanfranci，G.and Cagnin，S.（2015）.26484227“Target=BLANK>>Gene expression changes of single skeletal muscle fibers in response to modulation of the mitochondrial calcium uniporter（em genom dataEM>5-64.67） Chen，G.，Ning，B.and Shi，T.（2019）.single-cell rna-seq technologies and related computational data analysis.front genet； Cole，M.B.，Risso，D.，Wagner，A.，Detomaso，D.，Ngai，J.，Purdom，E.，Dudoit，S.和Yosef，N.（2019年）。单细胞rna序列正常化程序的性能评估和选择。细胞系统>8（4）：315-328 e318。
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