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图1。sirf分析的流程图。所示为sirf分析的基本流程和主要步骤。

材料和试剂

8孔显微镜载玻片（Thermo Scientific，NUNC，目录号：177402）
塑料盖玻片（电子显微镜科学，目录号：72261-50）
玻璃盖卡瓦（Fisher Scientific，目录号：12-548-5M）
Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：NC9855580）
铝箔（Fisher Scientific，目录号：01-213-105）
纸巾（enVision，目录号：23304）
0.22μm瓶装水过滤器（康宁，目录号：430758）
胸腺嘧啶核苷（Sigma-Aldrich，目录号：T1895）
兔抗生物素抗体（细胞信号，目录号：5597S）
小鼠抗生物素抗体（Sigma-Aldrich，目录号：B7653
兔抗rpa抗体（abcam，目录号：ab79398）
山羊血清（Sigma奥德里奇，目录号：G9023）
5′-乙烯-2′-脱氧尿苷（EDU）（因维特龙，目录号：A10044）
羟基脲（Hu）（Sigma-Aldrich，目录号：H8627）
多聚甲醛32%溶液，em级（ems，目录号：15714）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
叠氮生物素（Invitrogen，目录号：B10184）
亚历山福鲁488叠氮化物（因维特罗根，目录号：A10266）
硫酸铜溶液（氟卡分析，目录号：35185）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：11140）
磷酸盐缓冲盐（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
Duolink？鼠标加聚乳酸探针（Sigma Aldrich，目录号：Duo92001-100RXN）
Duolink？兔减聚乳酸探针（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92005-100RXN）
Duolink？聚乳酸检测试剂红（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008-100RXN）
Duolink？Duolink原位清洗缓冲液（Sigma Aldrich，产品编号：Duo82049-20L）
4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（生命技术，目录号：62248）
延长金防伪剂（invitrogen，目录号：p36934）
吐温20（Sigma Aldrich，目录号P7949）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
IMDM（Gibco，目录号：12440-053）
FBS（双子座生物制品，目录号：100-106）
氯化钠（Fisher Scientific，S271-3）
固定液（见配方）
渗透液（见配方）
阻塞缓冲区（见配方）
洗涤缓冲液A（见配方）
洗涤缓冲液B（见配方）

设备

自流红外水套式CO2培养箱（Nuaire，型号：NU-4750）
尼康日食ti-u倒置显微镜（尼康，型号：ti-u）
科普林瓶（Thermo ScientificTME94）
精细弯曲钳（精细科学工具，Dumont 7，目录号：11271-30）
滑盒（VWR82003-414）
Vortex（VWR模拟涡流混合器，产品目录号：10153-838）
4°C冰箱（BSI，型号：SCGP21OW1AREF）
-20°C冷冻柜（BSI，型号：ABT-2020mB）

软件

多灵克分析工具（西格玛·奥尔德里奇，http://www.sigma aldrich.com/catalog/product/sigma/duo90806？lang=en&ion=us）
NIS元素（Nikon，https://www.nikoninstruments.com/products/software“target=”\u blank“>https://www.nikoninstruments.com/products/software）
Microsoft Excel（Microsoft，https://products.office.com/en-us/excel“target=”\u blank“>https://products.office.com/en-us/excel）
imagej（imagej，https://imagej.net/welcome“target=”\u blank“>https://imagej.net/welcome）
graphpad棱镜（graphpad，https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/“target=”\u blank“>https://www.graphpad.com/scientific software/prism/）

程序

细胞标记
1. 实验前一天，在300微升的生长培养基中，每孔8室玻璃显微镜载玻片的1 x 1044-2 x 104对数期生长细胞，使细胞在细胞标记当天融合50-60%。我们通常使用贴壁细胞，例如生长在添加10%胎牛血清的imdm培养基中的hap-1细胞。< > 注意：我们还没有使用这个程序与悬浮细胞。然而，原则上，可以使用悬浮细胞，因为它们可以用溶液中的EDU处理，用细胞质蛋白沉积在显微镜载玻片上，然后固定以进行测定。
2. 第二天，从井中轻轻抽出生长培养基，加入200μl含edu（125μm）的预热生长培养基。固定前，将载玻片在37℃的组织培养箱中培养8分钟。这种条件允许在未受干扰的新复制DNA中检测蛋白质，“仅E”。
  注意：在处理细胞之前，将生长培养基平衡到37°C，以确保处理期间细胞的不间断复制。快速清洗和处理，以限制暴露在可能干扰复制的室温下。
3. （可选）对于复制暂停条件，在8分钟后抽吸EDU培养基，用PBS快速但轻轻地洗两次井，抽吸并添加含有羟基脲（Hu）的生长培养基或任何选择的复制暂停剂，以达到所需的时间量，通常在37℃下1-5小时。这种情况允许在停滞的叉子“e-hu”处检测蛋白质。< > 注意：我们通常使用200μm或4 mm hu作为复制暂停条件。低浓度的HU代表暂时的叉失速条件，而高浓度会导致DNA断裂（罗伊等人，2018B）。一小时的HU治疗可使早期复制暂停事件可视化，而4小时（或更长）的HU治疗可使后期事件可视化。
4. （可选）用胸腺嘧啶核苷追踪edu治疗（步骤a2）。这使得能够区分与新合成的DNA结合的蛋白质和与正在进行的DNA复制叉子相关的蛋白质；与DNA复制叉子一起移动的蛋白质在与胸腺嘧啶核苷孵育期间将继续移动，并且不再接近原始的EDU标签，这使得解放军的反应毫无成效。对于胸苷追逐，8分钟后抽吸含edu的培养基，用pbs洗两次井，然后添加含胸苷（100μm）的反向生长培养基。将载玻片在37℃下孵育4小时。这种条件允许检测与复制DNA结合的蛋白质，而不是与活性复制叉“e-thy”一起进行。类似地，在这种情况下没有信号，加上在“仅e”情况下有信号，定义了与正在进行的dna复制叉子一起移动的蛋白质。
5. 始终包括一口无EDU治疗的井作为阴性对照，“无EDU”。edu-edu-sirf（见注释）作为阳性对照。< > 注：建议执行所有条件，包括可选条件，以区分正常未受干扰复制叉（仅e）处的蛋白质与停滞复制叉（e-hu）处的蛋白质或接近复制叉的染色质结合蛋白质（e-thy）。e-thy条件区分了结合dna自身的蛋白质和结合到活性复制叉的蛋白质。
  
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细胞固定
1. 轻轻吸出生长培养基，小心地向每个孔中加入200μl固定液（2%pfa在pbs中稀释[ph 7.4]）。室温（RT）孵育15分钟，不干扰玻片。固定时间可能因细胞类型而异。
  注意：在生化安全柜内小心处理pfa。根据机构生物安全指南丢弃pfa废物。
2. 固定后，丢弃pfa，并用pbs（pH7.4）冲洗井两次，持续5分钟。从井道滑块（图2）上拆卸井道，确保井道在拆卸过程中不会干燥，并小心地将滑块放在含有60毫升pbs的coplin罐中。< > 注：固定滑块可在4°C存放一周。 < BR> < >
  图2。滑室分解总成。a.滑室分解总成。b.使用弯曲的细镊子移除硅胶垫圈（标定腔室）。小心操作，避免用镊子刮伤玻璃孔。< >
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细胞通透性
1. 通过将载玻片放入含有60毫升渗透性溶液（0.25%Triton X-100，PBS）的Coplin罐中，在室温下放置15分钟，使细胞渗透。
2. 用PBS（pH值7.4）在Coplin罐中清洗载玻片两次，每次5分钟。< >
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点击反应
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阻断和初级抗体培养
1. 取出塑料盖玻片，在含有PBS（pH 7.4）的Coplin罐中清洗玻片，室温下5分钟。
2. 将玻片放回潮湿的室内，在PBS中加入30微米的井/井缓冲液（10%的山羊血清和0.1%的Triton X-100）。用新的塑料盖玻片盖玻片，注意避免和阻止气泡。
3. 合上滑盒，RT孵育1h。
4. 稀释对阻断缓冲液感兴趣的主要抗体。可能需要测试不同稀释度以获得最佳信号。使用补充的抗生物素抗体和针对感兴趣蛋白质的抗体。例如，如图5所示，是使用小鼠抗生物素（1:100，sigma）和兔抗rpa抗体对（见注释）。当使用感兴趣的小鼠抗蛋白抗体时，选择兔抗生物素（1:200，细胞信号）。
5. 从滑梯上取下塑料盖片，轻轻敲掉阻挡缓冲垫。
6. 每口井加入30-40μl一级抗体混合液，使用新的塑料盖片，避免和抑制气泡。
7. 将载玻片放入潮湿的室内，在4℃下孵育过夜。
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邻近连接试验（pla）
1. 将载玻片放入含有60 ml Duolink洗涤缓冲液A（10 mm Tris HCl，pH 7.5，150 mm NaCl和0.05%吐温20）的Coplin罐中洗涤三次，每次5分钟。
2. 通过在封闭缓冲液中稀释1:5，制备针对各自主要抗体的Duolink原位pla探针抗正、抗负。例如，当使用兔抗rpa和鼠抗生物素时，准备图5所示示例中的抗鼠正和抗兔负。< > < >
  图5。hap-1细胞中的代表性rpa-sirf图像。a.125μm edu处理8分钟的hap-1细胞中rpa-sirf分析的代表性图像。细胞与生物素叠氮化物和alexa 488叠氮化物（10:1，共10μm）共点击。gfp通道显示s期细胞的edu-alexa 488信号。pla信号在txred通道中显示。PLA信号可以归一化到Alexa 488信号，以根据细胞的EDU含量来解释PLA信号差异。B.无EDU条件下RPA-SIRF的代表性图像（阴性对照）。比例尺=20μm.
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3. 取下多余的清洗缓冲液，并将载玻片放在预热（37°C）的潮湿室内。迅速添加30μl/井稀释聚乳酸探针，注意防止井干涸。
4. 将新的塑料盖片放在载玻片上，并在37°C的潮湿载玻片室中培养1小时。
5. 再次将载玻片放入含有60毫升Duolink清洗缓冲液A的Coplin罐中清洗，每次3次，每次5分钟。
6. 在高压灭菌水中稀释杜林克结扎储备缓冲液（1:5）和杜林克连接酶（1:40），制备结扎混合物。在解冻期间和解冻后旋动结扎储备缓冲液，确保溶解任何沉淀物。将连接酶保存在-20°C的冷冻块中，并添加到连接缓冲液中。
7. 取下多余的冲洗缓冲液，将载玻片放回湿润的载玻片室，加入30μl/井的结扎混合物，注意防止载玻片干燥。
8. 将新的塑料盖片放在载玻片上，在37℃的潮湿载玻片室中培养30分钟。
9. 将载玻片再次放入含有60毫升Duolink清洗缓冲液A的Coplin罐中清洗，每次两次，每次2分钟。
10. 在高压灭菌水中稀释Duolink扩增原料（1:5）和Duolink滚圈聚合酶酶（1:80），制备扩增混合物。通过在琥珀色光保护管中或在铝箔覆盖的管中制备溶液来限制放大原液的曝光，例如。将聚合酶酶置于-20°C的冷冻块中。
11. 取下多余的冲洗缓冲液，将滑梯放回潮湿的滑梯室。加入30μl/井放大液，注意防止玻片干燥。
12. 用一个新的塑料盖玻片盖住，在37°C的温度下培养湿滑室100分钟。
13. 将载玻片放入含有60 ml Duolink洗涤缓冲液B（200 mm Tris HCl pH 7.5和100 mm NaCl）的Coplin罐中，在黑暗中各洗涤三次，每次10分钟。
14. 将载玻片放入含有60毫升0.01倍稀释度的Duolink冲洗缓冲液B的Coplin罐中，在黑暗中冲洗1分钟。进行DAPI染色。
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DAPI染色和安装
1. 在PBS中制备DAPI溶液（1:1000，末端浓度1μg/ml）。避光。
2. 取下多余的清洗缓冲液B，将滑梯放回潮湿的滑梯室。加入30μl/孔DAPI溶液，注意防止玻片干燥。
3. 盖上新的塑料盖片，在室温下培养湿滑室5分钟。
4. 将载玻片放入含PBS的coplin罐中清洗两次，每次5分钟。
5. 从载玻片上取下多余的PBS，并将其放在纸巾上安装。
6. 向载玻片的每个孔中加入20微升延长金防伪剂，并用玻璃盖玻片（1.5毫米）固定。安装时避免出现气泡，并从盖滑套边缘擦去多余的安装试剂。将载玻片放在室温干燥的滑盒中过夜，以固化并避免暴露在阳光下。< > 注意：如果在2天内没有成像，请将幻灯片保存在-20°C下。

数据分析

使用荧光显微镜（如Nikon Eclipse Ti）以40x/0.95数值孔径（N.A.）的放大倍数（20x/0.75 N.A.）拍摄的图像幻灯片也可用于较大的细胞。pla信号在txred通道中捕获（ex 594 nm，em624nm，如sigma duolink推荐的duolink检测试剂red）。gfp滤波器用于与alexa 488 azide（ex 495 nm，em519nm）共点击时对细胞成像。dapi滤光片用于观察细胞核（ex 358 nm，em461nm）。合并的图像文件用于后续分析（图5）。通常情况下，每种情况下，在井的不同区域获得3-5个图像场，总共至少100-200个单元。
如果PLA信号是离散的和良好分散的，则可以使用DuoLink量化工具或显微镜固有定量软件，如尼康NIS元素软件来确定每个核的信号数目。或者，当信号非常丰富且软件（如图6）无法区分时，使用imagej软件或显微镜软件（如nikon-nis-elements软件）测量txred通道的平均荧光强度。edu水平的差异将改变感兴趣蛋白和生物素化edu之间pla的效率。因此，每个小区的pla信号应分别标准化为每个小区的总edu信号（由绿色通道中的alexa 488 edu信号测量）或在edu edu sirf条件下测量的中值pla信号。
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图6。在hap-1细胞中具有代表性的edu-sirf图像。上面的面板显示了在125μm edu处理8分钟的hap-1细胞中的edu-edu-sirf的示例。pla信号太丰富，无法手工计数。在这种情况下，可以测量平均TXRED强度来量化pla。绿色通道表示Alexa 488 EDU信号。比例尺=20μm.
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将sirf信号标准化为edu内容的首选方法是将每个核的sirf信号数除以alexa 488为gfp+细胞获得的每个核的总gfp强度（每个核的sirf信号/给定细胞的总gfp强度）。请注意，该条件应与相同的sirf分析（不含alexa 488叠氮co-click）进行比较，以确保co-click保持pla信号总体丰度不变。
或者，可以通过使用小鼠抗生物素抗体和兔抗生物素抗体来执行edu-edu-sirf（见注释）。在这种情况下，平均txred强度是细胞edu含量的一个指标。每个核的sirf信号数除以每个条件下的edu-edu-txred强度中值（每个核的sirf信号/每个条件下所有细胞的txred强度中值）。
注意：计算中间强度时，不包括EDU-Alexa488阴性的单元格。
如果数据遵循d'agostino&pearson正态性检验所测量的非正态分布，则使用mann-whitney t检验来确定条件或细胞系之间sirf信号差异的统计显著性（roy等人，2018a）。

笔记

可选：在单独的载玻片上对相同的实验条件单独与小鼠抗生物素抗体和兔抗生物素抗体进行额外的pla反应。该“edu-edu”sirf可用于用edu内容对pla信号进行标准化（图6），作为当alexa 488叠氮化物与生物素叠氮化物共同点击时针对edu-alexa 488强度的标准化的替代（图5）。
< > 我们对hap-1、mcf10a、mef、mcf7、hct116、u2os、h1299细胞的固定时间进行了优化。不同细胞系的固定量和固定时间可能需要优化。

食谱

固定液
1. 将10毫升32%pfa溶液（ems）加入150毫升pH7.4的PBS中，制成2%pfa，充分混合；
2. 将剩余的稀释过的pfa储存在气密瓶中，在室温（最多一周）或4°C下避光保存一个月
致化溶液
1. 将12.5毫升10%Triton X-100溶液加入487.5毫升PBS（pH 7.4）中，制成0.25%Triton X-100溶液
2. 充分混合并储存在室温下
阻塞缓冲器
1. 将1毫升山羊血清和100微升Triton X-100（10%）溶液加入8.9毫升无菌PBS中
2. 充分混合并在4°C下储存一周
清洗缓冲液A
1. 将8.8 g NaCl、1.2 g Tris碱和0.5 ml吐温20溶解在800 ml高压灭菌水中
2. 用盐酸将pH值调整到7.4
3. 将高压灭菌水添加至1000 ml（最终浓度为0.01 m Tris、0.15 m NaCl和0.05%吐温20）
4. 过滤溶液（0.22μm过滤器）并储存在4°C下。使用前将溶液置于室温下
洗涤缓冲液B
1. 将5.84 g NaCl、4.24 g Tris碱和26 g Tris HCl溶解在500 ml高压灭菌水中
2. 使用盐酸将pH值调整到7.5
3. 将高压灭菌水添加至1000 ml（最终浓度为0.2 m Tris和0.1 m NaCl）
4. 过滤溶液（0.22μm过滤器）并储存在4°C下。使用前将溶液置于室温下
edu原液

将2毫升二甲基亚砜直接加入含有50毫克EDU的小瓶中，制成100毫米储备。通过旋涡溶解粉末。在-20°C温度下储存小份原液，以防光线照射

致谢

这项工作得到了RP180463、RP180813（CPRIT）和1R01ES029 680（NIEHS）资助的支持，K.S是丽塔艾伦基金会研究员和癌症生物学的CPRIT学者。PLA技术最初是由等人开发的。Petruk et al.，2012和2017；Taglialatela et al.，2017，以及Roy et al.，2018a和2018b也报告了生物素点击edu和感兴趣蛋白质之间的pla，反映了sirf的原理技术。