材料和试剂

吸管头（奥林巴斯，目录号：24-120RL、24-150RL、24-165RL）
无菌移液管尖端（奥林巴斯，目录号：24-401、24-404、24-412、24-430）
无菌血清学吸管（奥林巴斯，目录号：12-102、12-104）
15ml离心管（Olympus，目录号：28-101）
50毫升离心管（Fisher Scientific，目录号：14-955-239）
1.5毫升微量离心管（奥林巴斯，目录号：24-281）
1.5毫升蛋白球管（Eppendorf，目录号：022431081）
15ml蛋白球锥形管（Eppendorf，目录号：0030122216）
可调容量吸管（Eppendorf，目录号：2231300008）
Pierce一次性柱（Thermo Scientific，目录号：29920）
NAP-5脱盐塔（GE Healthcare，目录号：17-0853-01）
μ-皿35 mm，高玻璃底（IBIDI，目录号：81158）
处理过的细胞培养瓶（Thermo Scientific，目录号：12-556-010）
皮尔斯蛋白浓缩器PES，30K MWCO，0.5毫升（Thermo Scientific，目录号：88502）
胃蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P6887-250mg）
小鼠igg1同型对照（invitrogen，目录号：02-6100）；αegfr（大鼠igg2a）抗体（abcam，目录号：ab231）
mda-mb-468乳腺癌细胞株（atcc，目录号：htb-132）
BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23225）
Superdex G200（GE Healthcare，目录号：17-1043-01）
磺基SMCC[磺基丁二酰亚胺基4-（n-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐]，无称重格式（Thermo Scientific，目录号：A39268）
二甲基亚砜（Thermo Scientific，目录号：20684）
QDOT 605 ITK氨基（PEG）量子点（氨基-PEG-QDOT605，Invitrogen，目录号：Q21501MP）或QDOT 565 ITK氨基（PEG）量子点（氨基-PEG-QDOT565，Invitrogen，目录号：Q21531MP）
HEPES，1 M溶液，pH值7.3，分子生物学级，超纯（Thermo Scientific，目录号：J16924ae）
氯化钠，5 m（Lonza，目录号：51202）
半胱胺（Sigma-Aldrich，目录号：M9768-5G）
染料标记标记，荧光红610 T10（LGC BioSearch Technologies，目录号：RD-5082-5）
甘油（Thermo Scientific，目录号：J16374AP）
Dulbecco的PBS（Genclone，目录号：25-508）
胰蛋白酶EDTA（康宁，目录号：25-052-cv）
Pierce F（AB’）2制备工具包（Thermo Scientific，目录号：44988，见注1），包括：
1. Zeba旋转脱盐塔（Thermo Scientific，目录号：89889）
2. NAB蛋白A加旋转柱（Thermo Scientific，目录号：89956）
3. PBS（Thermo Scientific，目录号：1890535）
醋酸缓冲液，pH 4.0（Fisher Scientific，目录号：50-255-309）
EDTA（费希尔科学公司，目录号：03-500-506）
细胞生长培养基（RPMI 1640，10%胎牛血清和1%青霉素链霉素）
1. RPMI 1640，含L-谷氨酰胺，2000 mg/L D-葡萄糖（genclone，目录号：25-506）
2. 胎牛血清（FBS），热灭活，美国原产地（基因克隆，目录号：25-514H）
3. 青霉素-链霉素混合物（Lonza，目录号：17-602E）
醋酸消化缓冲液，pH 4.0（见配方）
交换缓冲液，pH7.2（见配方）

设备

Eppendorf easypet 3（Eppendorf，目录号：443000018）
pH计（Fisherbrand，Accumet，型号：15）
涡流混合器（vwr，型号：模拟涡流混合器）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
热混合器（Thermo Scientific，型号：13687720）
端对端混频器（Argos Technologies，Rotoflex，型号：R2000）
CO2培养箱空气套TC（VWR，目录号：10810-902）
生物安全柜（Labconco，型号：A2）
Nikon Eclipse TE2000倒置显微镜，带TIRF照明器和100X/1.49NA平面APO物镜（Nikon，型号：Eclipse TE2000-E）
ixon背照式EMCCD摄像机（和或技术，目录号：DU-888E-C00-BV-500）
488nm固体激光器（和或技术）

软件

Java1.80y172的Image J 1.5 2i

程序

这个过程描述了从igg中产生fab'片段及其随后与荧光染料的结合（这里，我们使用qdot），如图1所示。我们使用小鼠igg1优化了消化和还原方案，然后应用这些程序（见注8）进一步优化将αegfr抗体（大鼠igg2a）的fab'片段与qdots结合以进行smt的条件。
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图1。程序概述和卡通示意图。不同抗体之间的反应条件可能不同（见注释5和11）。

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醋酸消化缓冲液及胃蛋白酶溶液的制备
1. 制备醋酸盐消化缓冲液（配方1）。
2. 在醋酸消化缓冲液中制备10 mg/ml胃蛋白酶溶液（见注释2和3）。< >
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igg样品制备（见注4）
1. 拧下Zeba旋转脱盐塔的底部封盖并松开盖子。将色谱柱置于15毫升离心管中。
2. 在1000x g下离心柱2分钟以除去存储溶液。弃用直通阀。
3. 向柱中加入1毫升醋酸消化缓冲液。在1000x g下离心2分钟，并去除通流。重复此步骤三次。
4. 将平衡柱置于15ml蛋白球锥形管中。取下盖子，缓慢地将0.5毫升抗体样品添加到柱中树脂床的中心。小心不要打扰树脂床。
5. 更换盖子并在1000x g下离心2分钟。收集igg样品。图2显示，从该缓冲交换步骤中，相对于原始量（车道1），总IgG量略微降低（车道2）。
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胃蛋白酶消化igg为f（ab’）2
1. 将0.5ml制备的igg样品移入1.5ml蛋白球锥形管中。
2. 对于1 mg/ml的igg，向试管中加入2.5μl的10 mg/ml胃蛋白酶溶液。抗体/胃蛋白酶w/w比为20:1。
3. 让消化反应在37°C的热混合器上进行16小时，以1000转/分的速度搅拌。这种情况可以根据不同的IgG分子而变化（见注释5）。图2中3号车道~100kDa的频带显示f（ab’）2。
  
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消化反应终止（见注6）
1. 拧下Zeba旋转脱盐塔的底部封盖并松开盖子。将色谱柱置于15毫升离心管中。
2. 在1000x g下离心柱2分钟以除去存储溶液。
3. 向柱中加入1毫升PBS（pH 7.4）。在1000x g下离心2分钟，并丢弃流过的液体。重复此步骤三次。
4. 将平衡柱置于15ml蛋白球锥形管中。取下盖子，慢慢地将0.5毫升消化后的IgG样品涂在树脂床的中心。小心不要打扰树脂床。胃蛋白酶消化igg将在这一步终止。
5. 更换盖子，并在1000x g下离心2分钟以收集流过的液体。参见图2中的车道4。
  
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f（ab’）2样品的纯化
1. 让NAB蛋白A+旋转柱和PBS达到室温。将离心机转速设置为1000x g。
2. 松开NAB蛋白质A+旋转柱上的顶盖，并折断底部封盖。将色谱柱置于15毫升离心管中，离心1分钟以除去存储溶液。
3. 加入2毫升PBS分散树脂。对于0.5毫升的样品，使用一半的树脂。
4. 用2毫升PBS平衡柱中的树脂。离心1分钟并丢弃流经的液体。重复此步骤一次。
5. 用附带的橡胶盖盖住柱底部。将消化液涂在柱上，盖紧顶部。用倒置法对树脂和样品进行再悬浮。在室温下在端对端混合器上培养15分钟。
6. 松开上盖并拆下下下盖。将色谱柱置于15毫升蛋白球锥形管中，离心1分钟。保留流动（该部分含有F（AB’）2）。参见图2中的5号车道。
7. 为获得最佳回收率，用0.5毫升PBS清洗色谱柱。离心1分钟，收集流经的液体。重复并收集两个含有额外F（ab’）2的洗涤分数（参见图2中的第6和第7行以及注释7和8）。
8. 使用bca蛋白质测定法测量蛋白质浓度。
  1. 按照制造商的说明制备BCA试剂和蛋白质标准品的系列稀释液。将200μl BCA试剂与10μl上述标准品或样品混合。
  2. 在37℃下孵育30分钟后，混合物的颜色将根据蛋白质浓度从淡绿色变为紫色。见图3。
  3. 用分光光度计或读板器测量562nm处的吸光度，通过与标准曲线的比较来估计蛋白质浓度。< > < >
    图2。胃蛋白酶消化小鼠IgG1前后的每一步的SDS-PAGE分析。< /强>巷1：最初储存在PBS（pH 7.4）中的整个IgG1样品。通道2:IGG1样品在缓冲液交换后，将其带至醋酸消化缓冲液（pH 4.0）。通道3：在37°C的热振动筛上消化16小时后得到的样品（约100 kDa位置的强带表示F（ab’）2）。通道4：缓冲液交换后的样品，将其带到PBS（pH7.4）以终止反应。通道5：蛋白质A柱在室温下孵育15分钟后的流动。通道6和通道7：从洗涤蛋白质A柱中收集的两个连续部分，以最大化产量。
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    图3。测定纯化后蛋白质浓度的bca法。a.bca溶液的绿紫色转换程度与蛋白质浓度成正比。b.使用吸光度（562nm处）与已知蛋白质浓度（y=0.507x+0.0188）的标准曲线，测定从蛋白质a柱流动中采集的f（ab’）2样品的浓度。
    
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fab'-qdot共轭物分离柱的制备注：该片段是Invitrogen对Qdot抗体结合方案的修改。
1. 通过轻轻摇动或旋涡将分离介质（Superdex G200）悬浮在瓶子中。确保介质完全悬浮，然后开始使用Pierce一次性色谱柱制备色谱柱。
2. 用两条线标记柱，一条在熔块顶部上方45 mm处，另一条在熔块上方55 mm处（图4a）。
3. 在装入培养基之前，用纯水湿润熔块。在确保分离介质为均匀悬浮液后，用1毫升移液管将介质装入第二行55毫米标记处（图4b）的柱中，并使其沉降到约45毫米高的填充凝胶床中（图4c）。
4. 轻轻地在凝胶顶部加入0.5毫升蒸馏水，同时保持床面水平。
5. 当溶剂水平下降到接近已沉淀凝胶床顶部时，用PBS填充柱，并让PBS水平下降到刚好高于凝胶床顶部。再重复两次。
6. 当最后一次填充的PBS水平下降到凝胶床顶部上方2至3 mm时，更换底部和顶部盖子。
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  图4。分离柱的制备。a.图像显示熔块上方有两个标记（45和55 mm）。b.凝胶悬浮液填充柱至上部标记（55 mm）。c.凝胶沉淀到下标记处（45 mm）。< >
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量子点纳米晶的活化（见注9）
1. 在DMSO中制备新溶解的20 mm磺基SMCC溶液。为此，在229μl二甲基亚砜中溶解2 mg Pierce无称重硫SMCC。
2. 在氨基-PEG-QDOT605的8μm储备溶液62.5μl中加入1.75μl DMSO中的20 mm磺基SMCC溶液。短暂的漩涡。
3. 室温下孵育1小时，以500转/分的转速搅拌以激活QDOTS。避光。
4. 在启动步骤进行时准备脱盐柱。
  
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脱盐塔的平衡
1. 准备交换缓冲液（见配方2）。
2. 标记NAP-5脱盐塔。一个标记为“减少fab”，另一个标记为“激活qdot”。
3. 从两个塔上取下顶部和底部盖，让塔中的存储液体排出。当每个柱中的液体接近柱凝胶床的顶部时，开始加入交换缓冲液。
4. 用10毫升交换缓冲液平衡每一列。
5. 当在每个柱上的凝胶床上方仍可见交换缓冲液时，将每个柱的底部盖住，并将其放置到F（ab′）2还原和QDOT的活化完成为止。
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fab碎片的产生
1. 必要时，通过稀释或浓缩，在300μL PBS中制备100μg F（AB’）2。
2. 当qdot活化几乎完成时，将f（ab’）2样品与半胱胺（5 mm）和edta（2 mm）在10°C下孵育5分钟，以500转/分的速度混合（见注8和注10）。图5第2行的条带代表Fab’（50kDa）和进一步减少的片段（25kDa）；后者不太可能保持抗原结合能力。为了最大化Fab’s产率，我们建议使用不同的F（ab′）2个样品，使用小的等分试样（每车道5-10μl）测试各种还原条件（见注释11和12）。 < >
  图5。用半胱胺将F（AB’）2还原成Fab’的SDS-PAGE分析。Lane1：图2中Lane5的F（AB’）2样品。通道2：在pH 7和10°C下，用5毫米半胱胺还原5分钟后的样品（见注11），在缓冲液交换之前。约50 kDa的频带表示fab.
  
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还原fab'片段的脱盐和收集
1. 将40μl蒸馏水加入染料标记物的一小瓶中并混合。这就为两个共轭反应提供了足够的染料标记物。不使用时储存在2-6°C。
2. 向1.5毫升微量离心管中加入500微升水，并在弯月面处标记管的外侧。再加入500μl水，并在试管外侧做第二个标记，标记的体积为1000μl。扔掉水。该管用于收集步骤j7中的还原fab'和步骤k4中的活化qdot纳米晶。
3. 当f（ab’）2还原完成（步骤i2）时，向还原fab’中添加20μl染料标记物（在步骤j1中制备）。
4. 取消标记为“还原Fab”的脱盐柱，并允许剩余的交换缓冲液进入凝胶床。紧接着，将还原的混合物（在步骤J3中制备）添加到凝胶床的顶部。
5. 允许减少的Fab混合物完全进入凝胶。
6. 在凝胶床顶部加入1毫升的交换缓冲液洗脱Fab’。
7. 当第一个有色滴洗脱（见图6）时，开始将还原的Fab'收集到离心管中（在步骤J2中标记）；收集不超过500μL（到较低的标记线）。< > < >
  图6。从脱盐柱中收集还原的Fab片段。< /强> a.在还原的Fab′与染料标记的混合物完全进入柱之后，在脱盐柱中加入一毫升交换缓冲液。b.将第一个染色液滴收集到步骤j2中标记的试管中。
  
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活化qdot纳米晶的脱盐与收集
1. 打开标有“活化QDOT”的脱盐塔盖。允许剩余的交换缓冲液进入凝胶床。紧接着，将活化的Qdot nanocrystals（从步骤G3）添加到凝胶床的顶部。
2. 允许活化的QDOT纳米晶体混合物完全进入凝胶床。
3. 在凝胶床的顶部加入1毫升的交换缓冲液，将纳米晶包裹起来。
4. 当第一滴有色物质从柱中洗脱后，开始直接收集到含有还原和脱盐fab'的离心管中。见图7。
5. 当最终体积达到1毫升时停止收集（达到步骤j2中标记的顶线；500微升活化的量子点纳米晶体）。
6. 短暂混合。
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  图7。从脱盐柱中收集活化的QDOT。<强> A。在活化Q点完全进入凝胶后，在脱盐柱中加入一毫升交换缓冲液。b.将第一滴染色液收集在试管中。
  
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共轭反应
使还原的fab'和活化的qdot纳米晶在室温下反应2小时。避光。
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浓缩样品
1. 将体积（从步骤l1）分成两个蛋白质浓缩器。
2. 在4000x g下离心15分钟，将每个体积浓缩至~20μl。如果离心后体积为20μl，则继续离心5分钟。
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量子点共轭fab'与非共轭fab'的分离
1. 解开分离柱（从步骤F6），并允许剩余的PBS通过重力进入凝胶床。紧接着，将浓缩的共轭反应溶液从两个蛋白质浓缩器（总体积约40μl）中混合到色谱柱顶部。避免干扰凝胶床。
2. 让共轭反应溶液进入凝胶，然后轻轻加入50μl PBS。让这个缓冲液进入凝胶床。
3. 用PBS轻轻地填充柱上方的储液罐，让样品通过重力洗脱。目测监控熔块和柱尖之间的“死区”。
4. 当颜色出现在“死空间”时，在离心管中只收集前8-10滴有色溶液。见图8。
5. 通过在qdot的第一个吸收峰处的吸光度测量来测定qdot浓度。
6. 使最终的共轭池达到甘油的50%v/v，并在4°C下储存。
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  图8。从分离柱收集qdot共轭fab。a.共轭混合物完全进入柱后，用pbs填充分离柱。b.当颜色出现在死区时，洗脱液开始收集。
  
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用α-egfr-fab'-qdot605结合物在活细胞上追踪egfr
1. 用胃蛋白酶[20:1抗体/胃蛋白酶（w/w比）]37℃下的醋酸消化缓冲液（pH4.0）搅拌16小时，然后用蛋白质A柱纯化，将α-EGFR抗体消化成F（ab’）2（图9a）。
2. 用5毫米半胱胺在10℃下将得到的f（ab’）2降低到fab’，持续5分钟（图9b）。
3. 与活化的qdot605结合产生αegfr fab'-qdot605结合物。
4. 在全生长培养基中，让2nm的结合物在室温下与镀在玻璃底皿上的活细胞（过度表达egfr的mda-mb-468乳腺癌细胞系）上的靶蛋白（egfr）结合10分钟。用全生长培养基清洗三次（见注13）。
5. 在100x/1.49na平面载脂蛋白物镜的倒置显微镜上，使用TIRFM在488nm的光激发下进行单分子跟踪（SMT）（我们遵循Chung和Mellman，2015；Chung，2017中描述的方法）。使用EMCCD摄像机在11 Hz处进行图像采集。图9C中显示了使用Image J呈现的单独标记的QDOT的快照图像。
6. 通过测定与原始抗体结合的表位饱和后结合结合结合物的密度（约为kd的100倍）来估计结合物的结合特异性，相对于未饱和的密度。Fab’-QD结合物的结合特异度为89%。 < >
  图9。用αEGFR抗体（IGG2A）产生SMART的Fab′-QDOT偶联物。< /强> A和B。用αEGFR IgG2a证明Fab’-QDOT605偶联物在SMT上对活细胞的适用性。SDS-PAGE分析α-表皮生长因子受体大鼠IgG2A的胃蛋白酶消化（A）和半胱胺还原（B）。（B）还原产生的IgG的Fab通过量与温度、半胱胺浓度的变化具有相似的相关性。与图5所示小鼠igg1 f（ab’）2的ph值相同（见注11）。c.用αegfr fab'-qdot605结合物标记egfr后，用全内反射荧光显微镜（tirfm）在约60%汇合的mda-mb-468细胞上拍摄一张10.72hz的smt图像（488nm光照，100x油标）。

笔记

程序A-E修改自Pierce F（AB’）2制备工具包（Thermo Scientific，目录号：44988）的协议。ZEBA自旋脱盐柱，PBS，和NAB蛋白A +自旋柱在此协议中使用，可以在该试剂盒中找到。
每次反应都应新鲜制备胃蛋白酶溶液。
胃蛋白酶在高ph缓冲液中不可逆地变性。切勿在中性缓冲液中制备胃蛋白酶溶液。
当使用浓缩的igg样品时，只需在醋酸盐消化缓冲液中将样品稀释至所需浓度，并跳过步骤b。
胃蛋白酶消化不同的igg分子。建议在制备f（ab’）2之前，使用小份所需igg进行一个时间过程（1-5和16 h）试验。如果按照程序C中的建议，消化时间设置为16小时，则在一天结束时开始该反应，并在第二天早上停止该反应。
胃蛋白酶消化后将醋酸缓冲液改为pbs的目的是终止反应，并制备用于蛋白质a纯化（用于去除未消化的igg）的样品，因为蛋白质a柱在酸性ph下无效。
蛋白A柱可以通过使用IgG洗脱缓冲液（pH 2.8）的制造商说明书再生。
如图2, 5和9所示，可以根据需要使用非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证消化/还原产物。
这种共轭方案可以直接应用于马来酰亚胺连接的染料，其中活性马来酰亚胺可以与Fab’中的巯基反应。
半胱胺对空气和水分敏感。将原瓶保存在真空干燥器中。使用前准备半胱胺溶液。
半胱胺的还原产率因f（ab’）2样品的不同而不同。强烈建议在pH（5、6和7）、温度（4°C、10°C、22°C和37°C）和半胱胺浓度（0.5-20 mm）的范围内进行中试。
高效液相色谱法或FPLC可用于进一步纯化Fab′的还原样品。
结合物的孵育时间和浓度可以根据实验、Fab′、Em＞等< 的亲和力而变化，通常在2-10分钟（孵育时间）和0.5～10 nm（共轭浓度）范围内变化。