图1。传统的细胞培养皿与透氧培养皿相比。a.传统的细胞培养皿对氧气不渗透，因此需要更多的时间使氧气通过培养基扩散到细胞中。b.将电池镀到透氧膜上，可使气相氧直接通过膜获得。

材料和试剂

长颈瓶
吸管尖头
15ml无菌管
1.5毫升微管
透氧培养板（商用板如表1所示）。本协议使用Coy实验室产品的2孔滑板
< > 表1。商用透氧膜清单
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无菌薄膜（Sigma-Aldrich，目录号：A9224-50EA）
亚克力缺氧室（定制）
1. 透明亚克力圆形圆筒显示立管（普利莫尔，美国亚马逊提供）
2. 1厘米厚的压克力平板（普利莫尔，美国亚马逊有售）
3. 油管接头
4. 硅脂
5. 环氧或硅酮胶
BlutackTM
McCoy改良介质（Thermo Fisher，Gibco，目录号：36600-021）
DMEM/F12介质（Thermo Fisher，Gibco，目录号：11320-033）
DMEM媒体（Thermo Fisher，Gibco，目录号：10313-039）
胎牛血清（THYMOFFER，GIGBO，澳大利亚FBS，目录号：26140~079）
青霉素链霉素（Thermo Fisher，Gibco，目录号：15070-063）
谷氨酰胺（Thermo Fisher，Gibco，目录号：35050-061）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（Gibco，目录号：14190-144）
台普尔（Thermo Fisher，Gibco，目录号：12605-028）
Rneasy迷你套件（Qiagen，目录号：74104）
Tris HCl（Sigma Aldrich，目录号：T3253）
NaCl（Omnipur，目录号：7710）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
NA4P2O7（化学品供应，目录号：TA045）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
Triton X（VWR，目录号：ICNA04807426）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
KCL（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
NONIDET-P40替代溶液（Sigma-Aldrich，目录号：98379）
DTT（皮尔斯，THEMOMFisher科学，目录号：20291）
RIPA裂解缓冲液（见配方）
细胞质提取缓冲液（见配方）
核提取缓冲液（见配方）

设备

层流罩
标准增湿细胞培养箱保持在5%co2
水浴（37°C）
血细胞仪
显微镜（蔡司Primovert，5x和10x物镜）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
气体混合器（3通道GB100，MCQ仪表，GB1E43120240版）
n2、co2和o2气源
预混合气体罐（BOC，目录号：CCS15388E）
油管（由MQ仪器提供，或可从圣戈班T3购买）
夹持架
连接到紧凑型氧传感器（OXY-1 ST，PRESENS）的剖面氧微传感器（PM-PST7，PRESENS）
微型离心机（Thermo Fisher Scientific，Heraeus Fresco 21[4°C]）

软件

MCQ气体混合物创建程序（MCQ仪器，版本1）
普雷森斯测量工作室2
Microsoft Excel
graphpad棱镜

程序

表1中列出的任何商业上的生物过滤器都可以用于这种细胞培养系统（较薄的膜将提供与周围空气更快速的交换）。本程序使用2孔滑板（Coy实验室产品）。此过程也可使用任何贴壁细胞系进行。我们在HCT116结直肠癌细胞（Martinez等人，2019年）U251胶质母细胞瘤细胞、PC3前列腺癌细胞、MDA-MB-231和MCF7乳腺癌细胞上使用了该模型系统。其他人则在内皮细胞、星形胶质细胞和乳腺癌细胞上使用了相关系统（Minoves等人，2017年）。根据我们的经验，所有细胞系都成功地附着在透氧膜上，而无需细胞外基质蛋白涂层。有些细胞系可能需要细胞外基质膜来促进附着。< > < > 注意：确保在层流罩内使用无菌技术进行所有细胞培养处理。

准备细胞培养
1. 根据细胞系，制备适当的添加1X谷氨酰胺和10%FBS的培养基，如表2所示。（可选：向培养基中添加50 iu/ml青霉素和50μg/ml链霉素）。
2. 在水浴中将介质预热至37°C。
3. 将种子细胞放入约15毫升预热培养基中的T75烧瓶中。
4. 在标准加湿培养箱中培养细胞，在37°C下保持5%的CO2。
  < > 表2。在该模型中测试的细胞系列表、相应的培养基和6小时实验的最佳播种密度
  
  < >
透氧膜上的种子细胞
1. 从T75烧瓶中吸取培养基，用无菌PBS清洗细胞，用2.5毫升胰蛋白酶解离试剂在37°C培养箱中解离约2分钟（直到细胞从烧瓶中分离）。
2. 向烧瓶中加入2.5毫升预热培养基，轻轻移取试管，确保在计数前悬浮均匀。
3. 将细胞转移到15ml无菌试管中，用血细胞仪计数细胞。
4. 在300x g下，在室温下离心细胞（使用eppendorf 5810r）5分钟。
5. 吸取并丢弃上清液。
6. 加入新鲜的，预热的培养基到小球中，重新悬浮细胞，轻轻移液以确保悬浮均匀。
7. 在1.5毫升培养基（见图2A）中制备2孔透氧滑板和种子细胞，其密度使细胞在24小时培养后达到接近100%的融合度+处理条件下的总持续时间（18小时试验的最佳种子密度如表所示2）。对于一个18小时的实验，在将培养皿放入缺氧室暴露于治疗条件下之前，细胞应该大约70-80%汇合（见图2b）。
8. 在标准加湿培养箱中培养细胞，在37°C条件下，保持5%的CO224小时
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  图2。含贴壁HCT116细胞的透氧培养皿。A.无菌无菌气膜密封的2孔滑动培养皿。接种后24小时贴附在透氧膜上的HCT116细胞的显微镜图像。
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建立缺氧室
这个程序使用一个定制的圆柱形亚克力缺氧室。为了建造一个简单的定制缺氧室，我们购买了各种尺寸的预装透明亚克力圆形圆筒显示立管（普利莫尔，可通过亚马逊，美国）。这个圆柱形的缺氧室的尺寸是：直径7厘米（内部）和高度3.5厘米，总体积140厘米3（图3b）。丙烯酸片（1厘米厚）的扁平片也可从PLYMAL购买，用作盖子。丙烯酸可以被切割成比腔室直径稍大的直径。本协议中使用的腔室盖直径为8 cm（图3A）。
&为了确保密封紧密，可以在盖的下面雕刻一个凹槽，使其与气缸紧密配合（见图3c）。或者，在实验开始时，在缺氧室的边缘添加~200微升-500微升硅脂，应足以将盖子固定在
放置以确保密封配合。可以在盖子顶部增加一个重量，以确保盖子固定到位（图4d）。
；缺氧室应该有用于流动气体的入口和出口孔（图3和图4），可以在盖子上钻孔。油管接头（见图4a和4b）可从当地五金店购买，并放置在盖子上的钻孔中（直径约1cm）。可使用环氧树脂或硅酮胶将适配器固定到位。
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图3。缺氧室的结构。a.缺氧室的盖子是一块扁平的亚克力（从普利摩购买，1厘米厚），盖子下面有一个大约1毫米的凹槽。盖子还包含两个孔（直径1厘米），作为流动气体的入口和出口。可使用环氧树脂或硅酮胶将管接头固定在这些孔中。缺氧室是一个压克力的平底圆筒（从普利莫购买）。圆筒直径7厘米，高3.5厘米，总体积140厘米。c.腔室盖上的凹槽很好地插入
圆柱形缺氧室，确保气密性。
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1. 在培养箱中培养24小时后，丢弃培养基，用1.5毫升预热培养基替换，并添加0.5%FBS。
2. 用无菌无菌无菌薄膜密封井（见图2a）。
3. 将滑板放在缺氧舱内，确保透氧膜的底面从舱底升起。< > 注意：使用吸管头和Blutack将板支起，并使用水平仪确保板与地板齐平-见图4a-4c。
4. 将盖子放在培养箱顶部，确保入口远离培养板，以防止气体直接流入细胞（图4a）。
5. 将培养箱浸入37°C水浴中的CO2培养箱中。温水浴有助于将室壁和内部气体保持在37°C。
  注意：如果燃烧室容易漂浮，用重物将燃烧室压入水浴中–见图4d。
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  图4。缺氧室设置。a.包含2孔滑板的缺氧室俯视图。通过blutacktm将2孔板提升至腔室内壁。燃烧室的盖子由一个进气孔和一个排气孔组成。入口孔的位置远离培养皿。b.包含2孔滑板的缺氧舱的前视图。放在盘子顶部的水平仪，以确保它是水平的。d.装有培养板的缺氧室，浸入37°C内的水浴中，co2培养箱。输入管通过入口连接到缺氧室。对于输入管道，使用MCQ为气体混合器提供的管道。圣戈班T3油管也是可以接受的。燃烧室被重物压住。
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定义模拟组织氧合的气体成分（示例/建议）
1. 定义常氧
  代表生理正常氧的氧浓度可能因感兴趣的组织而异。已有研究使用氧传感器测量了体内不同组织的氧合（见[Hunyor and Cook，2018]表1）。因此，可以基于这些测量进行估计。或者，一个好的起点是使用氧浓度，代表靠近主要血管的细胞的氧合（约90 mmhg或12%v/v）。
2. 定义缺氧
  缺氧浓度应根据所模拟的疾病类型来设置。在肿瘤中，氧的值可以从2到15毫米汞柱，取决于大小、位置和组织类型。4毫米汞柱是反映肿瘤严重缺氧的良好起点。
3. 定义间歇性缺氧
  间歇性缺氧的治疗方案也将取决于所模拟的疾病类型。该程序已用于先前一项模拟肿瘤阻塞性睡眠呼吸暂停的研究（Martinez等人，2019年）。间歇性缺氧的氧浓度基于阻塞性睡眠呼吸暂停小鼠肿瘤（皮下黑色素瘤）模型的测量。肿瘤中的氧波动在~5 mmHg（0.6%V/V）到~50 mmHg（7%V/V）之间交替（Almendros等人，2013年），因此氧循环协议被修改以在细胞周围介质中产生5到50 mmHg的波动（Martinez等人，2019年）（见图6g）。
  
  < >
使电池暴露在所需的混合气体中
1. 对于暴露于一种氧条件（即，持续常氧或持续缺氧），腔室的入口可以连接到预混合到所需气体成分的气体罐（如果使用此步骤，跳过过程G）。
2. 或者，腔室的入口可以连接到一个气体混合器，该气体混合器连接到N＜2＞< > >，> > > > 2 < > > > > > > > 2 < > > >气源。这一步骤特别适用于随时间改变氧气条件（即，用于模拟间歇性缺氧）。有关如何对气体混合器编程的说明，请参见步骤f。
  
  < >
将气体混合器编程为所需的气体成分
1. 打开MCQ气体混合器箱。
2. 打开MCQ Gas Mixed Creator Pro软件（图5）。
3. 选择“编辑程序”。
4. 输入对应通道（CH）上每个气体组分的所需百分比（百分比）（见图5B）。例如：
  1. 为了在12%o2（v/v）时模拟主要血管附近氧合良好的细胞，将每个通道的值设置为：n2（ch1）=83%，o2（ch2）=12%，co2（ch3）=5%（缓冲）。
  2. 为了在0.5%o2（v/v）下编程模拟严重肿瘤缺氧，将每个通道的值设置为：n2（ch1）=94.5%，o2（ch2）=0.5%，co2（ch3）=5%（缓冲）。
  3. 要对间歇性缺氧进行编程，请将一行中的值设置为：n2（ch1）=87%，o2（ch2）=8%，co2（ch3）=5%。选择“添加行”，并将第二行的值设置为：n2（ch1）=95%，o2（ch2）=0%，co2（ch3）=5%（缓冲），等。
5. 将“流量”（sccm；相当于ml/min）设置为所需流量。
6. 将“工时”设置为每个条件下所需的曝光持续时间。
7. 保存协议。
8. 选择“确定”。
9. 选择“运行程序”开始暴露在编程的氧气条件下。
注：在模拟间歇性缺氧时，可能需要延长“时间-工作”持续时间，以使细胞周围介质中的氧浓度达到所需水平。可以用氧电极测量细胞周围培养基中的氧浓度（参见程序G）。 BR/> < >
图5。使用MCQ Gas Mixture Creator Pro软件编程气体成分。a.MCQ Gas Mixture Creator Pro软件的打开页。b.作业程序编辑页面（在选择“编辑程序”之后）。间歇性低氧模型中，n＜2＞/Sub＞（C1）为每行87%或95%，O<＞2（CH2）为每行8%或0%，Co＜2（CH3）设为5%。流速设定为500 SCCM（相当于mL/min）。每行工作时间设定为5分钟。c.选择“运行程序”后的运行程序，从87%n2、8%o2和5%co2开始。d.氧气条件交替为95%n2、0%o2和5%co2时的运行程序
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测量氧浓度（以验证细胞周围介质中的氧含量）
准备：在腔室盖上钻一个额外的孔，以便插入氧气或温度探头。不使用时，用箔胶密封孔。钻孔的尺寸应适合所用氧探头的尺寸，该尺寸取决于品牌和型号（通常直径为5 mm-1 cm）。
1. 将氧传感器的针头穿过腔室盖上的孔，穿过气膜，然后扭转传感器的顶部以拔出氧传感器尖端（见图6a）。
2. 使用夹具支架将电极固定到位。
3. 打开Presens Measurement Studio 2软件。
4. 选择OXY-1通道。
5. 选择“测量”选项卡。
6. 选择“新建”。命名新的测量文件。
7. 单击测量文件并选择“分配给”。
8. 选择“实时视图”选项卡并单击“开始”开始测量。
9. 导出数据excel或graphpad棱镜和图形测量（示例见图6b-6g）。
注：空气中的氧平衡比介质中的氧平衡快得多，因此在室内空气中进行初始测量也很有用，以确保氧探头正常工作。氧浓度也会根据氧探头的位置而变化（如果探头没有直接放置在膜（细胞侧）上，细胞周围水平的氧浓度将不准确）。加入培养基的体积也会影响氧气浓度（Minoves等人，2017年）。处理氧探头时要小心，以免损坏传感器和刺穿培养皿的膜。
< >
图6。使用Presens氧气微传感器（在Graphpad棱镜上绘制）测量细胞周围介质中的氧气。a.通过缺氧室盖上的孔插入氧气探针针。b.连续暴露于12%o2中，c.连续暴露于0.5%o2中，d.暴露于8%o2中的30 s，然后暴露于0%o2中的30 s，e.暴露于8%o2中的1 min，然后暴露于0%o2中的1 min，e.暴露于8%o2的3分钟后接0%o2的3分钟，g.暴露于8%o2的5分钟后接0%o2的5分钟。每种情况下的d-g时间需要延长到5分钟，以便细胞周围的水平在周期的峰值达到所需的50 mmhg的氧张力，在周期的最低点或谷底达到5 mmhg的氧张力。不同的氧浓度可以根据感兴趣的组织的氧需求来模拟（见[ < < > >，2017）]。 < >
采集细胞并分析表达
细胞可以通过显微镜（1）、蛋白质表达（2）或mRNA表达（3）进行分析。
1. 显微镜
  商用透氧皿最初是为成像目的而开发的。细胞可以用荧光染料或蛋白质特异性绿色荧光蛋白转染，并用荧光显微镜进行分析。
2. 蛋白质表达
  可以通过在RIPA裂解缓冲液中刮取细胞或收获细胞以分离细胞核和细胞质蛋白，在下列步骤中提取细胞以提取总蛋白：
  1. 在培养板的每个孔中加入300微升冰冷细胞质提取缓冲液。
  2. 刮去细胞并将裂解液转移到预冷的1.5毫升微管中。
  3. 旋涡试管15s，在冰上孵育5min。
  4. 在4°C下离心5分钟（在21100x g下使用Fresco 21）。
  5. 吸取上清液（细胞质蛋白提取物）并转移到预冷的1.5毫升微管中。将微管放在冰上或在-30°C下保存直到使用。
  6. 在100微升冰冷核萃取缓冲液中再悬浮颗粒。
  7. 旋涡微管15秒，在冰上孵育10分钟。重复步骤h2c多次，共40分钟。
  8. 在4°C下离心10分钟（在21100x g下使用Fresco 21）。
  9. 吸取上清液（核蛋白提取物）并转移到预冷的1.5毫升微管中。将微管放在冰上或在-30°C下保存直到使用。丢弃小球。
  10. 蛋白质表达，然后通过Western印迹分析。
3. mrna表达
  细胞可以通过刮取来提取总RNA。使用Rneasy Mini Kit（Qiagen）并按照制造商的说明进行操作。通过反转录将纯化的mrna转化为cdna。通过qpcr量化表达式。

食谱

ripa分析缓冲液
10mmTris HCl，pH 7.5
100毫米氯化钠
1毫米EDTA
1毫米Na4P2O7
0.1%十二烷基硫酸钠
0.5%脱氧胆酸钠
1%Triton X
10%甘油
细胞质提取缓冲液
10毫米HEPES，pH值7.5
10毫米kcl
0.5毫米edta
0.5%非idet-40
1毫米DTT
核提取缓冲液
20毫米HEPES，pH值7.5
400毫米氯化钠
1毫米EDTA
1毫米DTT