材料和试剂

1.5毫升试管（Sigma，目录号：T9661-500EA）
10ml注射器（Terumo，目录号：55+10s）
10毫升试管（Sarstedt，目录号：62-9924-284）
20毫升注射器（bd plastipak，目录号：300613）
21 g x 1/5“针头（Terumo，目录号：NN*2138R）
23cm细胞刮刀，辐射灭菌（NUNC，目录号：179693）
75 cm2斜颈非发热量聚苯乙烯（T75）烧瓶（Sigma，目录号：CLS430641U-100EA）
p200，p1000吸管头
副胶片（BEMIS，目录号：PM-996）
HELA细胞（ATCC，目录号：CRM-CCL-2）
厚壁开顶31毫升超离心管（贝克曼库尔特，目录号：355631）
完整片剂，无EDTA易包装（蛋白酶抑制剂）（罗氏，目录号：04693132001）
Dulbecco改良Eagle培养基，高糖和L-谷氨酰胺（DMEM）（Gibco，目录号：11965-092）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（DPBS）（Gibco，目录号：14190-136）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
胎儿牛血清（FBS）（GIGBO，目录号：10099—141）
HEPES（西格玛，目录号：H3375-100G）
混合套管（导管）（费尔蒙特医疗，目录号：MIX1001）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-02）
蔗糖（sigma，目录号：s0389-1kg）
胰蛋白酶EDTA溶液1X（Sigma，目录号：59430C-100mL）
（可选）Pefabloc（默克公司，产品目录号：11429868001）或Pepstatin A（Sigma-Aldrich，产品目录号：77170）
蔗糖缓冲液（见配方）
添加蛋白酶抑制剂的蔗糖缓冲液（见配方）
18%（v/v）percoll/蔗糖缓冲液（见配方）

设备

移液管（p200，p1000）
-80°C冷冻柜
细胞培养箱（Thermo Scientific，型号：Heraeus Heracell 150i）
离心机（Thermo Scientific，型号：Heraeus Megafuge 40R）
实验室级称重秤
甑夹
甑架
固定角转子（贝克曼库尔特，型号：70Ti型）
超声波驱动器（贝克曼库尔特，型号：optima xpn-100）

程序

在含有10%FBS（培养基）的DMEM中，将T75瓶HELA细胞保存在37.C，5%CO2的细胞培养箱中，直到细胞达到融合。
预冷至离心机，超速离心机和转子至4摄氏度。
用10毫升冰镇DPB清洗融合的T75瓶子两次，并通过刮入5毫升冰镇DPB收集细胞。
转移至10毫升试管中，在1500x g下离心细胞5分钟，在4.c.丢弃上清液并重新培养细胞颗粒。
在含有蛋白酶抑制剂的1.5毫升蔗糖缓冲液中重新培养细胞颗粒。
将细胞悬液通过21g×1a'针头吸入10ml注射器。
取出针头，排出注射器室中的空气，使细胞悬液距离针尖约3 mm。

注意：处理锋利物时要小心，并将其放入锋利物箱。
用5-6层副膜覆盖注射器尖端，以确保细胞悬浮液不会从注射器中泄漏。
两个光电池，将盖好的针头紧紧地压在墙壁/工作台顶部，最大限度地向后拉动柱塞并释放。

注意：注射器内的真空压力将导致柱塞缩回，从而产生弹出声（视频1）。

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这段视频显示了将细胞悬液装入注射器，密封注射器，并使用它来照亮细胞，以保持器官完整性，以便在percoll梯度中进行分离。

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再重复第9步五次，每个样本总共6倍“持久性有机污染物”。

注：过多的爆裂将照亮溶酶体膜，并通过密度梯度破坏它们的分离。六种持久性有机污染物已被经验确定为hela细胞的最佳选择。如果没有听到“砰砰”的声音，可能意味着注射器腔不气密（即针头上的副膜可能松动或刺破）。
将所有可溶组分转移至10毫升试管中，并在200x g下离心10分钟至4.C（热科学），以从可溶组分（上清液：细胞溶胶、内切体、溶酶体、溶酶体、内质网。
将所有可溶部分转移到31毫升冰上超离心管中，并通过上下轻轻吸管与1.5毫升蔗糖缓冲液混合。这种混合物是亚细胞组分的输入（图2a）。
移除50 m输入并存储在-80

注：当比较处理或基因型时，input可用作标准化的度量。
将13毫升18%Percoll/蔗糖的冷冻缓冲液吸入20毫升注射器的小室。将一根导管连接到注射器的尖端，并排出腔室内的任何空气，使液体距离导管尖端约3 mm。
将导管放入超离心管中，缓慢输送13毫升18%Percoll/蔗糖的冰冷缓冲液，使其在输入下方形成一层。轻轻地取出导管。

注：细胞裂解液（不透明）应漂浮在18%Percoll/蔗糖软垫（透明）上（图2b和2c）。
称取每个填充的离心管的重量，并通过在浮动输入端轻轻添加蔗糖缓冲液将其质量平衡至0.01 g以内。
轻轻地将超离心管放入转子中，并在4°C下以30000x g的速度将超离心管放置1h。将加速和减速设置为最大值。

注意：确保超级离心机处于平衡状态。
轻轻取下超离心管，并将超离心管固定在冰上，直至分馏。梯度应该看起来相对没有特征（图2d）。
将蒸馏器夹具牢固地安装到蒸馏器支架上，然后将离心管固定在夹具的夹钳内。
用p1000移液管，从梯度的最上面一层轻轻地移走1毫升组分，并在-80°C下储存在编号为1.5毫升的试管中，以便识别。对于每个样本，将每个分数编号为1-16（例如，，最上面的[最不致密]分数命名为1，最下面的[最致密]分数命名为16）。

注：分数体积，因此分数可被修改以增加或减少化验分辨率。15到20之间的分数总数是最佳的。
进行质量控制实验，以确定哪些组分富含溶酶体。活性和蛋白质分析可以在Percoll馏分的纯样品上进行。例如，通过western blot分析每个片段，探测溶酶体标记lamp1（图1b）。分析阳离子独立的甘露糖-6-磷酸受体（ci-m6pr）是有用的，因为该受体存在于内切体而不是溶酶体（chenget al，2018），在13-18组分中很明显。此外，溶酶体酶活性（如β-氨基己糖酶、β-葡糖脑苷酶、β-半乳糖苷酶和酸性磷酸酶）可用于检测溶酶体组分（图1C）（Leabac和Walk，1961；KOLDODY和芒福德，1976）。如果细胞裂解过于活跃，溶酶体被突然打开，这将被揭示为一个“扁平”β-己糖胺酶分布在各馏分，而不是在浓密馏分中峰的轮廓。除内切体和溶酶体以外的细胞成分也会出现在这个梯度中。例如，质膜将富集在最轻的组分中（Perretet al，1979）。内质网也将出现在较轻的部分，高尔基体将出现在中间部分。线粒体可能出现在较重的组分中，在纯化溶酶体组分时需要被视为潜在的污染物（suhy等，2000）。< >
图1。密度梯度产生富含溶酶体的亚细胞组分。a.实验工作流程示意图。简单地说，细胞被轻轻地溶解在注射器中，溶解的部分被层叠在Percoll/蔗糖垫上。在30000x g下4°c超离心1h，细胞器将以密度依赖的方式沿梯度分布。自上而下的分馏是根据细胞器的沉积剖面来分离细胞器的。较低密度的细胞器（如早期内体）沉积在梯度的顶部，而较密集的细胞器（如晚期内体和溶酶体）沉积在梯度的底部。b.hela细胞密度梯度组分的western blot分析。对晚内切体/溶酶体标记lamp1进行了印迹分析。注意，LAMP1富含高密度组分13-18。c.溶酶体酶在密度梯度组分中的活性分析（1-16；共16个）。注意，对于所有酶，高密度组分13-15中的活性都增加。所提供的数据是三个独立实验的平均值。
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图2。制备连续的Percoll梯度。a.将均匀化的细胞样品放入超离心管中。b.将18%的Percoll放在均质样品下方。c.在超速离心之前，细胞裂解液应被视为percoll悬浮液顶部的一个不显眼的层（黑色箭头）。d.离心后，梯度似乎相对没有特征，尽管高密度Percoll可能被观察到是一个多云区域或管底部的“按钮”。

食谱

制备以下溶液并在4°C下保存至需要。< > 注意：对于所有的解决方案，准备的量要大于允许移液误差所需的量。

蔗糖缓冲液
250毫米蔗糖
10毫米HEPES
1 mm EDTA，pH值7.4（使用NaOH调节pH值）
此溶液在4℃下稳定至少一个月，因此可以提前准备。
添加蛋白酶抑制剂的蔗糖缓冲液
每25毫升缓冲液中使用一片蛋白酶抑制剂
实验当天新鲜制备
注：如果预期特异性溶酶体蛋白酶的下游分析，则用不含edta的蛋白酶抑制剂替代不会影响所需蛋白酶活性测量的特异性蛋白酶抑制剂。例如，如果要测量组织蛋白酶B，不要使用亮肽或其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂。然而，在这种情况下，分别作为丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂的pefabloc（merck）或胃蛋白酶抑制素a（sigma aldrich）可用于提供一些防止蛋白质水解降解的保护。
18%（v/v）percoll/蔗糖缓冲液
实验当天新鲜制备

致谢

这项工作得到了澳大利亚神经生物学研究中心、澳大利亚政府的研究训练津贴和英联邦奖学金（J.M.C奖）的支持。该协议从CuI＜E>等中进行了修正和修改。（2019）。j.m.c和k.j.h优化并进行了关键实验。J.M.C写了手稿，分析了数据，准备了所有的数字。J.M.C，K.J.H，R.D.T，Y.C，Z.Y和T.J.S对手稿进行了批判性的评论。

相互竞争的利益

T.J.S和合著者声明没有利益冲突。

工具书类

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