材料和试剂

细胞标记染料
1. Vybrant CM-DiI（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：V-22888）}
2. VybrantDiD（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：V-22887）
3. 基于优选的波长，可以使用CellTrace CFSE（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C-34554）（CF-1或FL-2的优选波长） CM-DiI）
其他材料
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2. 1×Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Invitrogen，Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10313-039）
3. 胎牛血清（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11091-148）
4. 40微米细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
5. 感兴趣的小鼠
6. NaN 3（叠氮化钠）
7. 红细胞裂解缓冲液（ELB）（参见配方）
8. FACS缓冲区（参见配方）
抗体
为了证明观察到的效果是特异的，我们推荐阻断相关受体，或通过耗尽NK细胞，通过使用抗NK1.1（在受体存在的情况下），或通过使用抗脱唾液酸GM1。
1. 抗NK1.1（eBioscience，目录号：14-5941-82）
2. 抗-Asialo-GM1（eBioscience，目录号：16-6507-39）
3. 抗小鼠CD314（NKG2D）（eBioscience，目录号：14-5873-82）

设备

BD LSR II流式细胞仪

程序

尾静脉注射需要事先实践，成熟的雄性小鼠更容易注射。我们建议使用8-12周的雄性小鼠
在实验前通过I.P（腹膜内）注射150微克（在高达250μlPBS中）抗NK1.1至24小时，获得NK细胞耗竭一天的时间。
注意：不是所有的细胞类型都适合这些实验，小细胞很难恢复，大细胞可能堵塞肺，一些细胞没有标记好等。因此，强烈建议使用有限数量的动物的初步实验。我们测试的线是：HeLa，PC-3，DU145，PD1.6和YAC-1。由于尾静脉注射可在不同的小鼠之间变化，即使在同一组中，需要内部注射对照，其通常是对小鼠NK细胞杀伤有抗性的细胞。根据制造商的说明为染料标记两种细胞类型（实验和对照）。如果使用的细胞不在制造商方案中，则需要校准体外染色实验。如下进行HeLa（对于我们的大多数实验的对照群体），Jurkat，3T3，P3X，PC-3 DU145的标记：
1. 将细胞以1×10 6个/ml的密度悬浮于无血清培养基（DMEM或RPMI）中。
2. 加入1-5μl（从库存）的细胞标记溶液/ml细胞悬浮液。轻轻吹打混匀。在每个标记管中不要超过5ml体积。 CFSE和Vybrant-CM-DiI之间的差异是发射（FL-1/FL-2）和标记细胞的范围（我们建议在可能的情况下使用Vybrant-CM-DiI）。
3. 在37℃HeLa（8分钟），Jurkat（2分钟），3T3（15分钟），P3X（15分钟），PC-3（30分钟）DU145（30分钟）孵育。我们建议在用铝箔覆盖的15ml管中孵育
4. 以450-515em g离心5分钟。
5. 取出上清液，轻轻地在温热（37℃）培养基中重悬细胞
6. 重复洗涤程序（3-d和3-e）。
将细胞重悬于终浓度为10 7个细胞/ml的这些细胞注射到小鼠，每种细胞类型的2×10 6个细胞（4×10 6个细胞/ 6总共）通过尾静脉注射每只小鼠; 最终注射体积为400μl。
将细胞通过一个40微米的细胞过滤器
留出400微升的细胞混合物，将作为预注射管。在实验期间将这些细胞保持在37℃。
将细胞注入小鼠的尾静脉。
等待5小时。
根据伦理规定牺牲小鼠，我们建议使用CO 。
收获肺，将其放置在6孔板中，用2ml冰冷的PBS，直到完全收获整个实验的肺。
在50 ml管的顶部放置一个40μm细胞过滤器，将肺转移到过滤器中，将PBS从6孔转移到管中。
使用5ml注射器的圆筒/杵粉碎肺; 根据需要添加更多PBS。
在获得均匀溶液后，将管在450-515×g下离心5分钟。
弃去上清液并用10ml ELB（红细胞裂解缓冲液）重悬细胞并保持在冰上5分钟。
在450-515×g离心细胞5分钟。
弃去上清液并观察红细胞含量（如果沉淀中有可见的红细胞）重复步骤15-16，直到红细胞消失。
将细胞重悬在10ml补充有10％FBS的DMEM/RPMI中（该步骤消除ELB活性）。
离心细胞在450-515×g 5分钟。
弃去上清液和悬浮细胞在1-2毫升FACS缓冲区根据topellet大小。
使用FACS检查细胞。从预注样品开始，基于正向和侧向散射设置门（参见下图），并校准激光强度。收集至少2.5×10 5个细胞。绘制FL-4与FL-2（如果使用DiI）或FL-4与FL-1（如果使用CFSE）的点图。
阅读肺样本。我们建议每个样品至少收集2.5 x 10 ^6个细胞
注意：细胞可以重悬在2％甲醛中，并在4℃下在黑暗中储存过夜，然后通过流式细胞术进行分析。
流式细胞术分析（图1）：Y轴FL-1强度X轴FL-4强度。方框标记"实验"细胞群;虚线方框标记"内部对照"细胞群体。左下方是小鼠的肺细胞（FL-1，FL-4阴性）。

图1.流式细胞术分析
为了获得杀死百分比，计算预注射组中的实验细胞的量（NK灵敏的）除以对照细胞的量（NK不敏感的），并且将该比率设置为参考对照。因此，对于感染后5小时在肺中回收的细胞进行类似的计算，并计算肿瘤细胞存活。

食谱

ELB（红细胞裂解缓冲液）
NH 4 Cl 16.4g
KHCO ₃ 2 g
EDTA 0.5M400μl
2 L ddH 2 O 2/b 用HCl滴定至pH 7.2-7.4
FACS缓冲区
1x PBS
0.5％BSA
0.05％NaN 3（叠氮化钠）

致谢

作者要感谢Noam Stern-Ginossar，Chamutal Gur，Ariella Glasner和Mazal El-Nekaveh。

参考文献

Halfteck，G.G.，Elboim，M.，Gur，C.，Achdout，H.，Ghadially，H.and Mandelboim，O.（2009）。增强体内淋巴瘤肿瘤的生长在缺乏NK-激活受体NKp46/NCR1。 J Immunol 182（4）：2221-2230。
Stern-Ginossar，N.，Gur，C.，Biton，M.，Horwitz，E.，Elboim，M.，Stanietsky，N.，Mandelboim，M.and Mandelboim，O.（2008）。人类microRNA调节受体NKG2D介导的应激诱导免疫反应。 Nat Immunol 9（9）：1065-1073。
Tsukerman，P.，Stern-Ginossar，N.，Gur，C.，Glasner，A.，Nachmani，D.，Bauman，Y.，Yamin，R.，Vitenshtein，A.，Stanietsky，N.，Bar-Mag ，T.，Lankry，D。和Mandelboim，O。（2012）。 MiR-10b下调应激诱导的细胞表面分子MICB，是癌细胞识别的关键配体自然杀伤细胞。 Cancer Res 72（21）：5463-5472。