材料和试剂

注：试剂可以来自不同的供应商，只要它们只用于单细胞rna-seq协议和无核酸酶。这里列出的那些是用来制定协议的。一般的分子生物学试剂假定已经存在于每个实验室中（例如水、tris或nacl）。对于塑料labware（滤嘴和滤管），我们使用了多个品牌，只要材料被证明不含核酸酶且结合力低，结果都是一样的。>

Eppendorf Lobind 1.5毫升（Eppendorf，目录号：30108051）
分离板（Thomas Scientific，目录号：EK-75118）
96孔板（Thomas Scientific，目录号：EK-75012）
过滤头（梅特勒-托莱多，目录号：17007954、17014973、17014973）
QPCR板（应用生物系统，目录号：4309849）
通用PCR板密封（Sigma-Aldrich，目录号：Z742420-100EA）
Umi_oligo dt_t31（100μm）（集成DNA技术）
Umi_Tso6（集成DNA技术）
96种不同寡聚体（96孔板集成DNA技术）
umi-pcr（96孔板集成dna技术
DNTP 25 mm（Thermo Fisher，目录号：R0181）
50X Advantage 2聚合酶（Takara，目录号：639202）
PVUI（提供Cutsmart 10X）（新英格兰生物实验室，目录号：R3150L）
dynabeadstmmyonetmstreptavidin c1（Thermo Fisher，目录号：65001）
发酵酶100t（100 mg/ml）（美国生物，目录号：37340-57-1）
RNase-Zap（Thermo-Fisher，目录号：AM9780）
RNase抑制剂（40 U/ml）（Takara，目录号：2313A）
无核酸酶水（Thermo Fisher，目录号：10977035）
ERCC RNA尖峰蛋白（Thermo Fisher，目录号：4456740）
丝锥（Sigma-Aldrich，目录号：T5316）
DMF（Sigma-Aldrich，目录号：74438）
5x上标第一股缓冲器（赛默飞世尔，目录号：18064014）
MGCL2（1米）（赛默飞世尔，产品目录号：AM9530G）
甜菜碱（5 M）（Sigma-Aldrich，目录号：61962）
上标II（赛默飞世尔，目录号：18064014）
10x Advantage 2 PCR缓冲液（Takara，目录号：639202）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：t2319）
吐温-20（西格玛-奥德里奇，P9416-50ml）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
卡帕图书馆量化（卡帕生物系统，目录号：KR0405）
安瓿珠子（贝克曼库尔特，目录号：A63881）
TE 10X（Sigma-Aldrich，目录号：T9285）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S5150）
EDTA（赛默飞世尔，目录号：AM9261）
洗脱缓冲液（EB）（桥根，目录号：19086）
PB缓冲器（PB）（桥根，目录号：19066）
Sybergreen 2x MasterMix（Invitrogen，目录号：4309155）
LNA引物（Exiqon）
qpcr的底漆
1. SOMN17 FW_U TDH3_U探头：TCGTCAAGTTGGTCTCTGG
2. SOMN18 RV_TDH3_探头：GGCAACGTTTCAACAAGT
3. somn21-fw_-adh1_探头：tggtgccaagttgtctg
4. somn22 rv_adh1_探头：ggcgaagatccaaagct
5. SOMN310 FW U 5 U ERCC U 00130:CGGAAAGTACTGACCAGCG公司
6. SOMN311 RV U 5 U ERCC U 00130:TGCCAATGATTCAGTGAC样
QPCR用光学盖（应用生物系统，目录号：4311971）
DNA高灵敏度芯片（安捷伦，目录号：5067-4626）
1%Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-1L）
100 mm DTT（Thermo Fisher，目录号：18064014）
碘化丙二钠（PI）（西格玛-阿尔德里奇，p4170-10mg）
细胞捕获和溶解溶液（见配方）
2x BWT缓冲液（见配方）
tnt缓冲液（见配方）

设备

96孔板磁铁（Thermo Fisher，目录号：12331D）
1.5-2毫升管磁铁（Thermo Fisher，目录号：12303D）
生物分析仪（安捷伦）
HISEQ 2000（照明）
facs（bd inflox，或aria ii，喷嘴70和100微米）
应用生物系统
Qubit（赛默飞世尔，目录号：Q32844）
热循环车（任何供应商）
热混合器（任何供应商）
多通道移液管（任何供应商）
平板离心机（任何供应商）

软件

Novocraft（Novocraft Technologies Sdn Bhd，http://www.novocraft.com/“target=”\u blank“>http://www.novocraft.com/）
samtools v1.3.1（li等人>，2009年，http://samtools.sourceforge.net/“target=”\u blank“>http://samtools.sourceforge.net/）
R编程语言V.3.5.0（R核心团队，2019年，https://www.r-project.org/“target=”\u blank“>https://www.r-project.org/）
基因组比对R包V.1.18.1（Lawrence等人，2013年）

程序

注意：如果可能，在实验室中生成一个单细胞库准备空间。如果没有，用rnase zap在每个库的开始和结束处清洗工作台的表面和所有材料。所有的材料和试剂都是用手套处理的，应采取rna工作的标准预防措施（不含rnase的材料和过滤头）。

细胞生长
在分类前一天，将所需酵母菌株的预接种物在相应的培养基中培养过夜（O/N）。为了描述指数增长的细胞，我们建议初始培养不要超过光密度od660=1.
单元格排序
1. 第二天早上（分类日），在相应的培养基中将细胞稀释至od660=0.05，并在细胞分离前至少进行2次细胞分裂（野生型菌株大约3小时）。
2. 准备96或384孔板，每个孔中含有5微升无水乙醇，以便立即固定细胞进行分类。
  注意：
  1. 在协议优化过程中，我们建议使用分离板。这些板可以一排一排地折断96孔板，因此可以使用同一块板进行多次试验。与你的设备检查盘子的兼容性。
  2. 我们获得了相同的结果，将细胞直接分类为5微升的“细胞捕获和溶解溶液”（见下文）。如果这样做，请准备在分类前把盘子放在4℃的冰上。
3. 在3毫升的生长培养基中稀释细胞至OD=0.05，并大力旋涡以分离细胞团。
  注：在此步骤中，可添加碘化丙二钠（PI）（4微克/毫升）以检查细胞活性。根据需要调整培养液量。根据我们的经验，3ml足够至少分类10个盘子。>
4. 在FACS设施中，用细胞过滤管过滤细胞（检查你的设施他们喜欢哪种细胞），并将细胞放在合适的分类管中进行活单细胞分类。
5. 检查板与分拣机的对齐情况。例如，这可以通过将液滴分类到覆盖板中，并确保液滴落入每个井的中心来完成。
6. 把活的单酵母（碘化丙二钠（pi）阴性）分到盘子的每个孔中，确保留下一个孔作为阴性对照。我们使用正向和侧向散射（分别为fsc和ssc）对总体进行分类。
  注意：要包括阳性对照，请将100个细胞分类为一个孔。>
7. 带有通用PCR板密封件的盖板。
8. 快速旋转板在每口井底收集电池（短旋转将所有液体收集到井底）。
9. 让乙醇在无菌环境（即无菌罩）中蒸发不超过45分钟。
10. 乙醇完全蒸发后，添加5微升酵母“细胞捕获和裂解溶液”。降速并立即冻结。
  注：无论细胞是被分类成乙醇还是直接进入“细胞捕获和溶解溶液”（见配方），冷冻板都可以在-80°C下保存至少6个月。ercc是rnas中的尖峰，它提供了对技术噪声的精确测量，而我们建议使用它们，它们可以被排除在外。>
11. 从新分类或冷冻的盘子（表1）中进行以下分析循环。
  
  表1。细胞壁消化和细胞裂解的温度条件
  注：消化可延长至30分钟。>
  
  < div >
12. 立即进行第一链cdna合成的rt反应。添加5微升逆转录混合物（RT混合物）（表2）。
  
  表2。用于第一链cdna合成的主混合试剂
13. 向下旋转板并执行以下循环（表3）：
  
  表3。细胞裂解的培养温度
14. 每口井加入15微升PCR混合物进行库扩增（表4）。
  
  表4。用于库扩增的主混合试剂
15. 向下旋转板并执行以下循环（表5）：
  
  表5。库扩增的PCR循环条件 < div >
  注意：这是一个安全的停止点（在4°C O/N或冷冻-20°C 1-2个月）。>>
16. （可选）稀释扩增库1:20，检查步骤b15中阳性细胞的百分比（图1；表6和表7）。
  注：使用针对管家基因的引物（我们使用TDH3，但我们获得了与ADH1相同的结果）来测量每个井的阳性细胞数。使用针对ercc的引物作为阳性对照进行扩增，扩增应在所有反应中均匀。此步骤在协议设置期间特别有用，因为它允许在前进之前检查样本/库（检查阳性库的数量）。有关引物序列，请参见表s1>
  < div >
  表6。用于QPCR评估的主混音
  
  注：底漆混合物指稀释在TE 1X中的FW和RV底漆（各10μm）的混合物。>
  
  表7。qpcr
  的pcr循环条件
  
  qpcr的引物序列：
  somn17 fw_tdh3_探头：tcgtcaagttgctctctgg
  somn18 rv_tdh3_探头：ggcaacgtttcaaccaagt
  somn21-fw_-adh1_探头：tggtgccaagttgtctg
  somn22 rv_adh1_探针：ggcgaagatccaaagctt
  somn310 fw_5_ercc_00130:cggaaagtactgaccagcg
  somn311 rv_5_ercc_00130:tgccaatgactcagcttgac
  注：考虑到内务基因的CT值，一个好的平板大约有70%的阳性井。阳性细胞少于50%的板是罕见的。为了确定低效率是由于分类还是由于反应效率，使用1:10稀释的cdna文库对erccs进行qpcr。未能放大erccs，或放大不均匀（由不同的ct值表示），表明不正确的库准备。如果每个板上的阳性细胞数较少，则可以在进行标记之前将不同板上的阳性细胞组合成一个新板，从而生成一个新板，并尝试提高分类效率。>
  < div >
  
  图1。由qpcr获得的ct值的代表性示例。散点图表示yscrna seq 96井板的循环放大（ct值）。每个点表示使用酵母内务基因（tdh3>，x轴）作为细胞大小（前向散射（fsc），y轴）索引排序值的函数而获得的值。虚线（ct>；25）显示用于区分正井和负井的阈值。标签显示未排序井h12的ct值（用作阴性对照）。
17. 向每个孔中加入15微升室温平衡且均匀的安瓿xp珠（1:0.6样品/珠比）。
  注意：在纯化步骤中，不要将珠的体积增加到1:1以上。少于标准量的珠子可确保底漆二聚体残留量最小。>
18. 用移液管上下混合十次，或直到溶液看起来均匀为止。将溶液转移到96孔板上，带有兼容的磁铁架。
19. 将混合物在室温下孵育10分钟，使dna与安瓿xp珠结合。
20. 将96孔板放置在磁性支架上5分钟，或直到溶液澄清并收集到珠子。
21. 当样品在磁铁上时，小心地除去液体而不干扰磁珠。
22. 用200微升80%（vol/vol）乙醇溶液清洗磁珠。将样品孵育30 s，然后用磁铁中的试管除去乙醇，不要使珠子过多。
  注：重要的是每次都要新鲜制备乙醇溶液，如乙醇从环境中吸收水分，从而改变最终浓度。请阅读并遵循制造商的说明。>
23. 再次重复乙醇清洗（重复步骤B20-B22）。
24. 去除任何乙醇痕迹，让珠子在室温下放置5分钟或直到乙醇蒸发，使珠子完全干燥。
  注意：在此步骤中盖住板或保护它不受任何可能的污染源或气流的影响。>
25. 一旦没有乙醇残留，在室温下用16.5微升洗脱缓冲液（eb缓冲液qiagen）从安瓿xp珠中洗脱dscdna文库。
26. 从磁铁上取下极板，用移液管上下移动三次或直到溶液均匀为止，使极板剧烈混合。
27. 将金属板放在磁性支架上，放置2分钟，或直到溶液看起来清澈为止。
28. 从每个孔中回收15μl上清液，并转移到新板上。正确标记标牌，因为它将被存储。
  安全停止点：cDNA文库可在-20°C下保存，然后再进行标记长达2周。>
全长cdna文库质量检查
1. 运行1微升的dscdna文库（步骤b28），使用高灵敏度dna芯片（2100生物分析仪）检查大小分布和浓度估计。如果可用，使用步骤b16中的qpcr结果来指导生物分析仪井的选择（图2）。
  
  图2。使用yscrna seq（步骤c1）获得的具有代表性的全长cdna的生物分析痕迹。在dna高灵敏度芯片（agilent 5067-4626）上运行从步骤（步骤b28）获得的cdna文库进行验证。库浓度也用高灵敏度量子位法（thermo-fisher）测量。左面板（A1）表示库的下限当中间（A5）和右边（B2）面板代表平均库时，我们排序的质量（图改编自Nadal Ribelles等人，2019年）
  
  适配器退火：要生成细胞条码库，TN5需要加载双链DNA（DSDNA）适配器。为此，需要对96个不同的dsdna适配器进行退火。
2. 在冰中用96个strt条形码（100μm）解冻板。
3. 在新的平板中，将5μl Umi-TN5-U（100μm）和5μl Umi-TN5-U 1至96（μm）混合在TE 1X中，以50μm（每个）的最终浓度进行1:1稀释。
4. 将混合物在95°C下加热3分钟，然后逐渐冷却至室温（0.5°C/s），以退火底漆。将板标记为“退火电池专用适配器”板。
  注：标牌上标明退火底漆的数量和退火日期。可提前制备盘子，并在-20°C下保存6个月。退火适配器的数量取决于需要标记的板的数量和使用频率。
5. 要将称重传感器专用适配器连接至TN5，准备一块新板并将其标记为“已加载TN5”。在每口井中，混合以下试剂。我们建议与所有试剂混合，并单独添加退火电池专用适配器（表8）。
  
  表8。主混音产生10x转置
6. 在37°C下孵育1小时，然后立即冷却至4°C，以装载TN5。在-20°C下冷冻“装载TN5”板。
  注：装载的TN5板可在-20°C下安全存放1-2周。注意，使用后立即将装载板存放在冰上4°C将显著降低TN5的活性，并导致标记效率低下。>
  
  标记
7. 在新的冰盘中制备以下混合物（表9）。
  
  表9。用于库集成的主混音
8. 在55°C下孵育5分钟，在85°C下孵育3分钟，使TN5失活，然后在热循环器中冷却至4°C。标记时间取决于tn5的纯化效率和活性。我们观察到这种酶随着时间的推移失去活性。强烈建议对每批TN5进行滴定，方法是在生物分析仪中标记相同数量的cDNA（步骤B28和C1）并检查断裂曲线。
9. 为每个样品制备1:20稀释度肌酮>C1链霉亲和素。
10. 用2x bwt缓冲液洗涤2倍的肌酐珠，并用比原来体积多20倍的2x bwt珠稀释。
  示例：20个样品的20微升珠子将最终用400微升2x BWT稀释。>
11. 将20微升稀释的肌酮>C1链霉亲和素珠（步骤C10）添加到每个孔中，并在室温下在室温下培养5分钟。
12. 将每个板（最多96个）的所有样品汇集到一个单独的收集管（1.5或2毫升）中。
13. 将收集管放在磁架上，留出足够的时间使溶液完全澄清。
14. 在磁铁上，用100微升TNT缓冲液清洗珠子一次，不要混合珠子。
15. 在磁铁上，用100微升铅缓冲液清洗一次myone>c1链霉亲和素，并丢弃上清液。
16. 在磁铁上，再次用100微升TNT缓冲液和废弃的上清液清洗3个珠子。
  
  移除3个端部
17. 将100微升以下混合物添加到步骤C14（表10）中清洗的珠子中。
  
  表10。用于3'端部移除的MasterMix
18. 将混合物在37℃下在热混合器中孵育1h。以1000转/分的速度每2分钟搅拌30秒，以避免珠状沉淀。
19. 用100微升TNT缓冲液清洗3个珠子。
  
  洗脱单链cdna
20. 在30微升无核酸酶的水中再悬浮。
21. 在70°C、850转/分的温度下在热混合器中培养10分钟。
22. 立即将珠子与磁铁结合，并将上清液转移到一个新的试管中，该试管包含上清液中的单链cdna文库（另一链仍与链霉亲和素珠子结合）。
  
  单链cdna清除
23. 将54微升室温安瓿xp珠添加到30微升sscdna文库中。
24. 在室温下孵育10分钟。
25. 将珠子绑在磁铁上1分钟或直到溶液完全澄清并丢弃上清液（保留珠子）。
26. 用200微升新鲜80%乙醇清洗一次，持续20-30秒。将磁珠绑在磁铁上执行此步骤。
27. 风干珠子约2分钟。
28. 在30微升EB缓冲液中再培养5分钟。
29. 将珠子粘合2分钟，或直到溶液澄清，然后将上清液转移到新试管中。
评估库集中度
1. 用洗脱cdna文库的1:100、1:1000和1:10000稀释液建立kapa定量反应（步骤c27）。试剂盒中提供了除DNA库以外的所有再生剂（表11）。
  注：本试剂盒可由您最喜欢的量化方法或使用具有已知标准（强烈建议使用Phix）的P5-P7底漆对的QPCR来代替SybrGreen 2x MasterMix。>
  
  表11.qpcr库量化的主混音
2. kapa和国产sybergreen的qpcr循环条件（表12）。
  
  表12.qpcr
  的pcr循环条件
3. 使用qpcr使用kapa biosystems提供的模板或制造商提供的说明计算库量化。
  注：我们使用了kapa、neb和自制系统，结果相似。>
4. 建立一个单独的PCR来运行一个生物分析仪来确定最终的大小分布。准备以下混合物，每个要加载的库一个单独的反应（表13）。
  
  表13。用于在标记后评估库大小的主混音
5. 运行步骤d2中相同的pcr，但持续11个周期。
6. 在高灵敏度DNA芯片中加入1微升，以获得基于生物分析仪轮廓的平均文库大小（图3）。
  
  图3。从yscrna seq.获得的代表性生物分析痕量。从大约80个细胞获得的两个代表性样品。显示每个库的浓度，并通过qpcr测定（步骤d3）。图来自Nadal Ribelles等人，2019年。
7. 使用自定义read 1>引物和umi-tn5-u作为索引read>引物对hiseq 2000高输出上的库进行排序。
8. 要在hiseq快速运行上运行库，请使用锁定核酸（lna）引物。在0.5μm时在底漆中刺入。
  索引1引物进入hp8
  将1个底漆读入HP9
  注：
  1. 使用测序工具箱/仪器和/或测序核心设施仔细检查此信息。
  2. 对于高输出运行，也需要自定义引物，但由于测序化学的差异，不需要LNA。
  >umi_pcr_read1:+gaatga+taccggcg+acca+ccga+t–定制250 nmole。DNA寡糖，高效液相色谱纯化
  索引1:ctgt+ct+ctt+ata+ca+tctga+cg+c-定制250 nmol DNA寡糖，高效液相色谱纯化
9. 每车道每个图书馆的负荷约为8-14 pmol。文库是单链dna，因此不需要变性。注：协议优化后，无需运行phix控件，如果加载phix，请考虑双链phix控件的变性步骤，yscrna seq库不需要此步骤。
  >
参考图4所示为板材加工的示意图。

图4。来自Smart Medical的YSCRNA序列图像的示意图Server（The Laboratory Servier，a HREF=“https http：//smart.servier.com/”target=“\ \ blank”>smart servier medical art

数据分析

ISCRNA-SEQ数据分析的初始步骤与Bulk RNA-SEQ（Conesaet al>，2016）应用的步骤非常相似，但有一些特殊性。YSCRNA-SEQ发生器每序列CDNA分子读两读。第一个读数（索引1）包含细胞特异性钡代码，该细胞特异性钡代码与特定细胞相关。第二读物（阅读1）包含了UMI，和映射到一个特异的转录、绝对分子计数和转录识别的TSS。为了Properly estimate gene expression from YSCRNA-SEQ data，both reads have to be computationally associated to their references.The former association is default by default in illumina's space>demultiplexing tool.本发明的个体快递文件（每一酵母细胞一次）是YSCRNA-SEQ分析的起始点。此后，我们进一步加速了快速文件的预处理，以识别UMIS，并实现基因表达表的一致性和量化（图5）。在这里，我们详细说明了我们在分析YSCRNA-SEQ数据时采取的步骤，从FASTQ文件开始：
note：the analysis spipeline was executed in a linux 64 bit machine with 32 gb of ram and 6 cpus.我们建议至少有12GB的RAM。一台具有几种计算芯的机器，也比较容易加快过程。
/ 图5YSCRNA-SEQ分析管道的方案代表 strong

阅读预处理为了从读者的初期提取UMI，我们使用了一个自定义的Javascript Program（debcscell）。

command$Java-CP directoryofdebcscell rootnameofdebcsccell f1=fastqfile bl=“>

这个脚本表述了后续行动：&NBSP；
1. 提取第一个6nt（UMI）并将其纳入后期使用的阅读名称。
2. 提取物和计数没有跟踪海事组织，第14页。如果有14个或更多的读者或G's，则该读者将被公开。
一致性 note：in our case，the reference sequences（referencesequencencesname.fa）are a combination of the S.Cerevisiae genome（SCER3，SGD R64 version；A HREF=“http://www.yeastgenome.org/”target=“\\\\\\\\\\\ \ xBlank”> www.yeastgenome由制造商提供的RCC控制序列不包括在T7推进剂序列克隆过程中使用的限制位置。自从YSCRNA-SEQ是TSS-specific，这一事实考虑到了读者初期因误差而产生的映射速率。我们生成了一个新的ERC参考，包括这些序列。这些修改后的参考文献可从基因表达综合网站下载（在。
1. 在我们的例子中，我们将每个库的平均读取深度定为72万次。我们评估，通过下采样，该深度基本上高于获得酵母转录组高分辨率所需的深度。事实上，在每个细胞约500000次读取时，检测到的转录本数量达到饱和（补充图2c【Nadal Ribelles等人，2019年】）。此外，我们观察到所有序列库的唯一映射读取的中位数约为74%。这些值是使用此协议的有用参考值。
2. 我们使用Novocraft对读进行对齐，但是开放源代码的对齐器，例如hisat2（Kim等人，2015）或star（Dobin等人，2013）可以不使用在结果上取得重大差异。
读取与使用默认参数的Novocraft（http://www.novocraft.com/）对齐。
1. 使用novoindex命令为novocraft创建索引：
  
  $novoindex referencesequencesname.nix referencesequencesname.fa>
2. 使用novoalign命令对齐读取：
  
  $novoalign-f fastqfileumipcesed.fastq-d引用序列名-o sam
3. 转换为BAM格式，并使用samtools视图和samtools sort对其进行排序：（从上一个命令中导出）
  
  samtools视图-bs-samtools sort-文件名.sorted.bam.>
量化
虽然我们知道存在用于量化基于umi的单单元数据的公共软件（例如umi tools[Smith等人，2017]），但我们使用r自定义脚本执行了量化，以获得完整的数据检查和数据过滤的灵活性和控制。量化的起点是在上一步中获得的已排序的BAM文件，每个已排序的单元对应一个文件。
1. 处理BAM文件。
  脚本：readalingumi.r.$r script readalingumi.r>>
  
  使用基因组比对包将每个bam文件加载到r中。然后，低质量的映射读取（mapq<；30）和5'端带有软剪裁的读取被过滤掉。最后，将地图读取到相同的位置，并将具有相同umi的地图分组，以便在下一步中折叠它们。
2. 处理umi分组数据。
  
  脚本：>bard2rds.r.$r script bard2rds.r>>
  
  在这个步骤中，不到3次读取所支持的umis被过滤掉，因为它们可能表示排序错误。然后，映射到相同基因组位置的不同umi被分组。不同的umis映射到同一位置代表同一转录本的不同分子。此信息存储在rangeddata>对象中。
3. 与注释和计数表生成重叠。
  
  脚本：txanno.r（链接）。$rscript txanno.r.>>
  
  如果有重叠，每个分子都被分配到一个来自注释的基因组特征。在这项研究中，我们使用了来自（Xu等人，2009年）的注释，因为它包含了将基因分为不同类别（编码、剪切、SUTS等）的综合分类。得到的结果是一个以基因为行、细胞为列的绝对基因表达表。
（可选）过滤
为了避免低质量细胞（死亡、压力或凋亡）的存在，我们决定只保留那些超过500000个序列读取的细胞，以及那些我们检测到超过1000个不同转录本的细胞。在我们的例子中，这种过滤器消除了线粒体RNA比例高的细胞，而线粒体RNA与低质量细胞相关（Ilicic等人，2016）。但是，这种过滤器不是必需的，可以根据实验类型和正在研究的生物问题进行调整。

食谱

注：所有试剂和水必须不含核酸酶，仅用于单细胞方案。

细胞捕获和裂解溶液（表14）

表14。“细胞捕获和裂解液”的组成

>>
2x bwt缓冲器
10mmTris HCl，pH 7.5
1毫米EDTA
2 m氯化钠
0.02%吐温-20
tnt缓冲
20毫米Tris pH 7.5
50毫米氯化钠
0.02%吐温

致谢

作者感谢sten linnarsson在与yscrna seq进行初步试验期间提供的试剂。我们感谢EMBL、Bianca Hennig和Lars Velten的蛋白质表达和纯化核心设施提供内部纯化的TN5。我们感谢Derek Caetano Anolls编辑和完善了手稿。M.N.R.曾获得EMBO长期奖学金（斯坦福大学），后来又获得了Maria de Maeztu博士后奖学金（Pompeu Fabra大学的Doctores Banco de Santander Maria de Maeztu）。P.L.是一名金融机构十岁前研究金（加泰罗尼亚将军）的接受者。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）和欧洲研究理事会（European Research Council）的高级研究员资助（ADG-294542）和中国国家重点研究与发展计划（2017YFC0908405）的资助。这项研究也得到了西班牙卫生部的资助。《经济与竞争力的尝试》（PGC2018-094136-B-I00和联邦快递到F.P.；BFU2017-85152-P和联邦快递到E.N.），加泰罗尼亚政府（2017 SGR 799）和Unidad de Excelencia Maria de Maeztu，MDM-2014-0370。我们衷心感谢西班牙经济、工业和竞争力部（MINECO）通过“卓越中心”Severo Ochoa奖和加泰罗尼亚政府CERCA计划提供的机构资金。F.P.是ICREA Acad_mia（加泰罗尼亚总司令）的接受者。

相互竞争的利益

作者声明没有财务或非财务利益。

工具书类

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